Solubilização e Bio conjugação de pontos quânticos e ensaios de toxicidade bacterianas por curva de crescimento e Contagem

O objetivo geral deste procedimento é realizar triagem de alto rendimento dos efeitos antibacterianos de nanopartículas com ou sem conjugação a antibióticos. Aqui, os efeitos antibacterianos de poli-mistura e B, pontos quânticos de telureto de cádmio conjugados, são testados para alcançar esse objetivo. Os pontos quânticos são primeiramente solubilizados em ácido mercapto-propiônico.

Em seguida, os pontos quânticos são conjugados ao poli-mix e ao antibiótico B; as bactérias cultivadas com antibiótico são então tratadas com pontos quânticos conjugados e não conjugados ao antibiótico, e metade das amostras é submetida à radiação com luz azul de 440 nanômetros por 30 minutos, o que induz os pontos quânticos a gerar excitons e espécies reativas de oxigênio, a fim de avaliar o efeito dos tratamentos com pontos quânticos sobre o crescimento e a sobrevivência bacteriana. Leituras de densidade óptica são realizadas e contagens de colônias são efetuadas. Os dados obtidos indicam que a aplicação de pontos quânticos de telureto de cádmio conjugados ao antibiótico, seguida por irradiação, produz os maiores efeitos tidais entre as condições testadas.

Embora este método possa fornecer informações sobre o efeito dos pontos quânticos de telureto de cádmio e sua conjugação com polix na B sobre o crescimento de E. coli, ele também pode ser aplicado a outros tipos de nanopartículas e antibióticos em diversas cepas bacterianas. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois qualquer excesso de MPA fará com que os pontos quânticos agreguem, e se pipetarem a toluína até mesmo uma pequena quantidade, destruirão o filtro.

Embora hoje iremos demonstrar um método para avaliar os efeitos antibacterianos de pontos quânticos KE IDE conjugados com antibióticos. Um método semelhante poderia ser usado com outros tipos de pontos quânticos, como fosfato de índio, sulfato de zinco e sulfeto de cádmio sulfato de zinco. Inicie este procedimento preparando uma solução de pontos quânticos de telureto de cádmio ou CDTE em tolueno a 15 micromolar em um frasco de vidro, meça a densidade óptica ou OD por espectroscopia de absorção transferindo com pipeta 200 microlitros desta solução estoque para um frasco de vidro.

Não utilize plástico. Em seguida, adicione 800 microlitros de tolueno, um mililitro de tampão borato 200 milimolar e dois microlitros de ácido mercapto-propiônico 11,5 molar ou MPA, tampe o frasco e agite vigorosamente por 30 a 60 segundos. Após a agitação, as fases aquosa e orgânica se separarão espontaneamente.

A fase aquosa ficará com a cor dos pontos quânticos. Para evitar a camada de ladrilhamento, remova-a, depois remova a fase dos pontos quânticos e transfira-a para um frasco limpo. Para purificar os pontos quânticos solubilizados, transfira-os para um filtro de centrífuga de 500 microlitros.

Adicione 100 microlitros de tampão bore oito 50 milimolar e centrifugue a 3000 ×g por 13 minutos. Realize esta lavagem quatro vezes; após a lavagem final, suspenda os pontos quânticos lavados em 500 microlitros de tampão bore e armazene a quatro graus Celsius.

Eles permanecerão estáveis por uma a duas semanas. Para estimar a concentração dos pontos quânticos, meça os espectros de absorvância e de emissão. Esta figura mostra pontos quânticos de CDTE sob iluminação com lâmpada UV e os espectros de emissão antes e depois da solubilização em água, demonstrando mudança desprezível nas propriedades ópticas decorrente da troca de ligantes.

Esta parte do protocolo é aplicável a qualquer nanopartícula solarizada em água com carga negativa, incluindo musgo, pontos quânticos comerciais, partículas metálicas e outros. Neste exemplo, o antibiótico polimixina B ou PMB será conjugado aos pontos quânticos numa razão molar de 30 para 1. O PMB é positivamente carregado e se autoorganiza sem necessidade de conjugação. Reagentes: dissolver PMB em água.

A 60 micromolar. Para uma placa de 96 poços com 0,3 mililitros de bactérias por poço em quadruplicata. 0,5 mililitros do conjugado de 200 nanomolar é suficiente para preparar isso com 100 microlitros de pontos quânticos de um micromolar em tampão bore de 50 milimolar em um tubo de microcentrífuga.

Em seguida, adicione 50 microlitros da solução de antibiótico PMB 10 x ou 60 micromolar em água ao tubo do conjugado. Adicione 50 microlitros de água ao tubo controle. Complete o volume até 0,5 mililitros com tampão 50 milimolar, protegendo os tubos da luz com papel alumínio e coloque-os em um rotador durante uma hora.

Se ocorrer agregação, repita a conjugação com concentrações mais baixas de antibiótico. Titule a concentração progressivamente até que as partículas não agreguem, para lavar os conjugados. Despeje as soluções através de um filtro com corte de peso molecular de 10.000, o que funciona para a maioria dos antibióticos, mas não para proteínas ou anticorpos.

Por fim, estime o número de moléculas de antibiótico por quantum por espectroscopia de absorvência ou fluorescência, eletroforese em gel ou espectroscopia no infravermelho próximo. Esta figura mostra os espectros típicos de absorvência e emissão dos pontos quânticos antes da conjugação com PMB e a emissão após a adição de 160 equivalentes molares de PMB.

A relação entre a proporção de PMB e a intensidade da emissão do ponto quântico, indicada pelos quadrados, e a localização do comprimento de onda do pico, indicada pelos triângulos, é mostrada aqui. À medida que a concentração de PMB aumenta, a intensidade da emissão do ponto quântico diminui, resultando em um deslocamento no comprimento de onda de emissão máximo. A próxima parte do protocolo é realizada para determinar a concentração inibitória半máxima ou IC 50 do antibiótico e da toxicidade do ponto quântico na noite de dois dias antes do experimento de conjugação.

Semente 10 mililitros de meio LB a partir de uma colônia fresca de e coli. No dia seguinte, uma a duas horas antes do experimento, preencha cada poço de uma placa clara de 96 poços com meio de crescimento. A placa para o ensaio deve ser organizada conforme mostrado aqui.

As amostras devem ser semeadas em triplicata e as concentrações dos antibióticos devem abranger uma faixa ampla o suficiente para incluir uma concentração que iniba pouco as bactérias e outra que as elimine completamente. Poços contendo pontos quânticos nas concentrações a serem utilizadas nos experimentos com conjugados também devem ser incluídos em triplicata. Utilizando uma pipeta multicanal, adicione aos poços apropriados de um a 50 microlitros de cultura bacteriana.

A concentração dependerá da velocidade de crescimento da linhagem específica e precisará ser calibrada adequadamente. Para monitorar o crescimento, coloque a placa em um leitor de placas e configure-o para realizar leituras a cada 10 minutos durante duas horas em 600 nanômetros. Quando as células atingirem uma DO entre 0,1 e 0,15, remova a placa do leitor e interrompa o registro.

Em seguida, adicione o PMB nos pontos quânticos aos poços apropriados e cubra em triplicata metade da placa com papel alumínio. Em seguida, coloque a placa sob uma lâmpada personalizada de 440 nanômetros feita com LEDs de 2,4 miliwatts por 30 minutos para expor o lado iluminado da placa. Após a exposição à luz, coloque a placa no leitor de placas e registre a DO 600 a cada 10 minutos por cinco a 12 horas, dependendo da taxa de crescimento. Mantenha a temperatura inferior a 32 graus Celsius, se possível, para evitar a secagem das culturas usando o software.

Plote as curvas de crescimento em um ponto de tempo selecionado versus a concentração logarítmica e determine a CI50 do antibiótico utilizando a equação de Hill mostrada na tela, onde H é o coeficiente de Hill, Ymáx é o ponto mais alto de crescimento e Ymín é o ponto zero, idealmente também em uma platô. Ao final do período de registro, poços claros indicarão morte celular completa e um gradiente de densidade celular deverá aparecer ao longo do aumento das concentrações da droga.

As bactérias devem apresentar curvas de crescimento em forma de S, como mostrado aqui. A localização do platô máximo variará bastante de cepa para cepa e também depende da temperatura. Pode-se escolher um ponto temporal específico como representativo e os valores plotados em função do logaritmo do antibiótico para obter a CI 50 e avaliar os pontos quânticos.

A sobrevivência frente à toxicidade versus o logaritmo da concentração dos pontos quânticos também pode ser representada graficamente, mas é raro obter uma eliminação bacteriana significativa com pontos quânticos isolados na concentração utilizada. Uma vez determinada a toxicidade dos pontos quânticos e dos antibióticos isoladamente, o mesmo protocolo pode ser aplicado para determinar a toxicidade do antibiótico. Pontos quânticos conjugados mostrados.

Aqui está um exemplo de configuração para o ensaio. Observe que os conjugados são testados em concentrações crescentes em quádruplo, incluindo uma tira controle com apenas bactérias, uma tira com apenas fármaco e poços de amostra apenas com pontos quânticos. As leituras de DO 600 podem então ser usadas para gerar curvas de crescimento, e os valores de CI 50 são determinados como anteriormente.

Esta figura mostra um exemplo de conjugados que são tão tóxicos quanto o antibiótico isolado e um exemplo de conjugados que são mais tóxicos. Para determinar o número de unidades formadoras de colônia ou UFC para cada condição, escolha um ou mais poços da placa de 96 poços tratada para serem usados na realização de contagens em placa. Faça uma diluição seriada de cada uma das amostras bacterianas selecionadas com solução salina.

Para fazer isso, pipete 180 microlitros de solução salina para as colunas apropriadas. Transfira 20 microlitros da solução bacteriana e dilua com 180 microlitros de solução salina. Troque a ponteira da pipeta, homogeneíze e transfira 20 microlitros da solução bacteriana diluída para 180 microlitros de solução salina.

Repita este processo seis vezes. Em seguida, retire 10 microlitros de cada uma das últimas seis diluições e plaque-os em forma de manchas em uma placa retangular com meio de auger. Podem ser plqueadas 36 manchas em uma placa retangular.

Deixe a placa secar por 15 minutos sobre a bancada; após 15 minutos, incube a placa a 37 graus Celsius por 16 horas após a incubação. Conte as colônias para determinar as unidades formadoras de colônias por mililitro. Multiplique o número de colônias pelo fator de diluição e divida pelo volume plaqueado para determinar o efeito dos tratamentos sobre o crescimento bacteriano.

A densidade celular de E. coli foi medida em OD 600. São apresentadas aqui curvas representativas de crescimento bacteriano com diferentes concentrações de fármaco, variando de zero até a morte celular completa. Os símbolos abertos indicam PMB apenas, com as concentrações indicadas.

Os símbolos sólidos representam C-D-T-E-P-M-B sem irradiação e os símbolos preenchidos pela metade representam C-D-T-E-P-M-B com irradiação. A irradiação não teve efeito nas amostras contendo apenas PMB, portanto essas curvas foram omitidas para maior clareza. Abaixo estão os gráficos dos valores da curva de crescimento em 200 minutos versus log PMB e os ajustes a esta equação para determinar os valores de CI50, a fim de controlar os efeitos da luz.

É realizada uma curva apenas com o antibiótico e 30 minutos de exposição à luz. Este gráfico indica a sobrevivência bacteriana aos 200 minutos em função da concentração de QDs utilizando QDs de CDTE. Observa-se alguma toxicidade com a exposição à luz, mas em grau insuficiente para determinar um valor de CI 50.

Isso indica que a toxicidade do CDTE isolado nas concentrações utilizadas no experimento de conjugação é desprezível. Para comparar os efeitos de diferentes tratamentos sobre o crescimento celular, os valores da curva de crescimento em 200 minutos foram plotados e ajustados à equação mostrada anteriormente, conforme exibido aqui. Os conjugados C-D-T-E-P-M-B foram mais tóxicos do que o PMB isolado. Em comparação, os conjugados de nanopartículas douradas A-U-P-M-B não mostraram aumento da toxicidade em relação ao PMB isolado, para determinar o efeito dos tratamentos sobre a sobrevivência bacteriana.

O número de unidades formadoras de colônia foi determinado para E. coli cultivadas em uma placa de 96 poços tratada com P-M-B-Q-D-P-M-B ou QD isolado, com ou sem radiação I por 30 minutos, seguido de incubação a 32 graus Celsius por quatro horas. Foram realizadas diluições seriadas de cada amostra bacteriana com solução salina, e 10 microlitros de soluções de 100 x até 10 à sétima X foram semeados em placas de ágar. As placas foram incubadas a 37 graus Celsius e as colônias foram contadas após 16 horas.

Neste exemplo, as colunas A a C da placa contêm bactérias tratadas com concentrações crescentes de CDTE. Os conjugados sem irradiação e as colunas D a F contêm bactérias tratadas com concentrações crescentes de conjugados. Juntamente com 30 minutos de irradiação, as diluições são mostradas ao longo das linhas.

Os dados indicam que, sob irradiação, os conjugados apresentam maior inibição do crescimento bacteriano em comparação com os conjugados sem irradiação. Não se esqueça de que os reagentes ca são extremamente tóxicos e precauções, como o uso de luvas, jalecos laboratoriais e óculos de proteção, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a triagem em alta produtividade do efeito antibacteriano de nanopartículas com ou sem conjugação a antibióticos.