Name: Solubilização e Bio conjugação de pontos quânticos e ensaios de toxicidade bacterianas por curva de crescimento e Contagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Aprenda a solubilizar e bioconjugar pontos quânticos de CdTe para avaliar efeitos antibacterianos em bactérias. Este método utiliza ativação por luz azul de 440 nm para gerar espécies reativas de oxigênio e medir a sobrevivência bacteriana.

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Este trabalho foi financiado pelo programa Descoberta NSERC Individual, o NSERC / CIHR Programa Cooperativo de Investigação de Saúde (CHRP), eo NSERC CRIAR canadense Programa de Formação de Astrobiologia (CAPT).

1. Solubilização QD Este é um método apropriado para CdTe. Métodos semelhantes podem ser utilizados com outros tipos de QDs tais como InP / ZnS 20 e CdSe / ZnS 21. <ol><li> Prepara-se uma solução de QDs CdTe em tolueno a 15 mM (densidade óptica = 2,5 no pico exciton primeiro). </li><li> Transferir 200 uL deste estoque para um frasco de vidro. Não utilize plástico! </li><li> Adicionar 800 uL de tolueno, 1 mL de tampão de borato 200 mM (pH 9) e 2 uL de 11,5 M de ácido mercaptopropiónico (MPA). </li><li> Tampe o frasco e agitar vigorosamente durante 30-60 segundos. </li><li> As fases aquosas e orgânicas-solvente irá separar-se espontaneamente. A fase aquosa irá tornar-se a cor das QDs. Para evitar a camada de tolueno, removê-la e descartá-lo. Em seguida, transferir a fase aquosa para um frasco limpo. </li><li> Purifica-se os QDs solubilizados por lavagem / filtragem quatro vezes usando um uL 500, 10000 de peso molecular de filtro de centrifugação de corte. Os filtros devem sercentrifugada a 3000 xg durante 13 minutos. Para pelo menos, as duas últimas lavagens, lava-se com o tampão final desejado. </li><li> Após a lavagem final, suspender as QDs lavadas em tampão de borato 50 mM ao pH desejado e armazenar a 4 ° C. Eles são estáveis ​​durante 1-2 semanas. </li><li> Medir a absorvância espectros de emissão e estimar a concentração de base em fórmulas publicados 22. </li></ol> Os resultados representativos: Figura 1 mostra uma imagem de QDs CdTe sob iluminação lâmpada de UV, e espectros de emissão antes e após solubilização água, mostrando a mudança insignificante da troca da tampa. Os valores de tamanho são o diâmetro do núcleo medido por microscopia electrónica. 2. Conjugação QD a antibióticos Esta parte do protocolo é aplicável a qualquer carregada negativamente nanopartícula-água solubilizada, incluindo QDs mais comerciais, partículas de metal, e mais 19. <ol><li> Qualquer molécula que irá trabalhar either de auto-montagem para os QDs negativamente carregadas solubilizados, ou que tem um grupo reactivo que pode ser conjugado, tal como uma amina primária. Neste exemplo, estamos a utilizar polimixina B (PMB), que está carregada positivamente e de auto-montagem sem necessidade de reagentes de conjugação. Dissolve-se o PMB em H2O a 60 mM. (Se o antibiótico escolhido não é solúvel em H2O, dissolver em DMSO ou etanol a uma concentração de 0,1-1 mM). Esta será uma solução 10x (em H2O) ou uma solução de 100x (em solvente). </li><li> Calcule quanto solução QD você vai precisar para os experimentos de toxicidade bacterianas. Para uma placa de 96 poços com 0,3 mL por poço em quadruplica, 0,5 mL de 200 nM conjugado é necessário. Preparar dois tubos contendo 100 L de 1 mícron pontos quânticos em 50 mM tampão borato. </li><li> Se o acoplamento com uma amina primária, preparar um mg 19 / mL (100 mM) de solução de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]-carbodiimida (EDC) em H 2 O. EDC em solução não é estável; Usar imediatamente e jogar o resto fora. </li><li> Adicionar 50 ul de solução 10x antibiótico (em H2O) ou 5 uL da solução de 100x (em solvente) para o tubo de conjugado. Para PMB: a conjugação CdTe na proporção molar de 30:1, adicionar 50 uL de 60 mM PMB. Adicionar H2O ou solvente para o tubo de controlo QD só. </li><li> Se necessário, adicionar 1 mL da solução-mãe de EDC para o tubo de conjugado. </li><li> Traga o volume conjugado a 0,5 ml com o tampão apropriado (tampão borato ou PBS; nenhum buffers contendo amina, tais como Tris, uma vez que irá inibir a EDC). </li><li> Tubos de protetor de luz com papel alumínio e coloque em um nutator ou roqueiro durante 1 hora. Se a agregação ocorre, repetir a conjugação com menores concentrações de antibiótico. Titular para cima de concentração até que as partículas não agregada. </li><li> Lavar os conjugados por passagem através de um filtro apropriado. 10.000 cutoff de peso molecular funciona para a maioria dos antibióticos, mas não para as proteínas ou anticorpos. </li&gt; <li> Dependendo da molécula, diferentes métodos podem ser utilizados para estimar o número de moléculas de antibióticos por QD: absorvância ou espectroscopia de fluorescência, electroforese em gel, ou de infravermelhos com transformada de Fourier (FTIR). </li></ol> Os resultados representativos. Neste exemplo, a conjugação PMB é caracterizada por alterações no espectro de emissão QD. A Figura 2 mostra os espectros de QDs CdTe com adição PMB. 3. Preparação de bactérias para a tela de 96 poços; Determinação da IC antibiótico 50 Isto é aplicável a quase qualquer estirpe bacteriana crescido no meio adequado 18. O comprimento exacto do tempo as gravações deve continuar depende da taxa de crescimento bacteriano. No nosso exemplo, usamos Escherichia coli cultivadas em caldo lisogenia (LB) médio. <ol><li> A fim de escolher os adequadas concentrações de conjugado QD, é importante conhecer oIC 50 do antibiótico a ser conjugada e se os QDs sozinhos são tóxicos. Isto deve ser iniciado 2 dias antes da experiência conjugação. À noite, mL semente 10 de meio de crescimento bacteriano a partir de uma colônia fresca, usando técnica estéril e biossegurança correta. </li><li> No dia seguinte, 1-2 horas antes da experiência, encher cada um dos poços de uma clara de fundo placa de 96 poços com uma quantidade quase-máxima de meio de crescimento. Usando uma pipeta de canais múltiplos de sementes, cada poço com 1-50 uL de cultura bacteriana (a concentração irá depender da rapidez com que o estirpe particular cresce e terá de ser calibrado pelo seu laboratório). </li><li> Colocar a placa sobre o leitor de placas e ajustá-lo para ler a cada 10 minutos durante 2 horas a um comprimento de onda determinado (normalmente 600 nm). Monitorar a placa para que as bactérias não crescem muito densa muito rapidamente. </li><li> Quando as células atingem todos os OD = 0,1-0,15, retire a placa do leitor de placa e parar a gravação. </li><li> Adicionar droga sozinho e sozinho em QDsconcentrações diferentes em pelo menos triplicados. Use um lado da placa como um controlo &quot;escuro&quot; e uma meia para ser iluminada. Um esquema sugerido é dado na Figura 3. As concentrações devem abranger uma ampla gama suficiente para incluir uma concentração que inibe as bactérias muito pouco, e um que mata todos eles. </li><li> Proteja o lado &quot;negro&quot; da placa com papel alumínio. Expor o outro lado para uma lâmpada no comprimento de onda desejado. Usamos um costume de 96 poços, a lâmpada de 440 nm feita a partir de 2,4 mW LEDs (Figura 4) e irradiam para 30-60 min. As placas pretas com fundo claros ajudam a proteger as bactérias não expostas de luz difusa. Uma coluna vazia pode também ser usado entre os lados expostos e un exposto. </li><li> Após a exposição à luz, colocar a placa no leitor de placas e OD registo 600 a cada 10 minutos para 5-12 horas, dependendo da taxa de crescimento. Mantenha a temperatura &lt;32 ° C, se possível, para evitar a secagem das culturas. </li><li> Traçar as curvas de crescimentonum ponto de tempo seleccionado vs log [concentração] e determinar o IC 50 do antibiótico utilizando a equação de Hill: </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" /> em que H é o coeficiente de Hill, y max é o ponto mais alto de crescimento (idealmente em um planalto), e y min é o ponto de zero, também idealmente em um planalto. É improvável que QDs só por si, mostram a toxicidade muito para as células nas concentrações utilizadas, portanto, um valor não será determinado. Os resultados representativos. No final do período de gravação, poços claros irá indicar a morte celular completa, e um gradiente de densidade de células deve aparecer ao longo concentrações crescentes da droga. As bactérias devem mostrar as curvas em forma de S de crescimento (Figura 5 A); a localização do patamar máximo irá variar muito de estirpe para estirpe e também depende da temperatura. Um ponto de tempo dado pode serescolhida como representante e os valores representados vs log [antibiótico] para dar o IC 50 (Figura 5 B). Para avaliar a toxicidade QD, sobrevivência versus Log [QD] também pode ser traçado, mas alcançar a morte bacteriana significativa com QDs sozinho é rara (Figura 5 C). 4. Preparação de bactérias para tela de 96 poços com antibiótico / QDs <ol><li> Um dia antes do experimento, 10 mL de sementes da cultura de uma colônia fresca para o meio adequado rico, usando técnica estéril e biossegurança correta. O conjugado QD-antibiótico deve ser preparada neste dia, a menos que seja altamente instável. </li><li> 1-2 horas antes da experiência, encher cada um dos poços de uma clara de fundo placa de 96 poços com uma quantidade quase-máxima de meio de crescimento. Usando uma pipeta de canais múltiplos de sementes, cada poço com 1-50 uL de cultura bacteriana. </li><li> Coloque o prato sobre o leitor de placas e configurá-lo para ler a cada 10 minutos durante 2 horas no mesmo comprimento de onda como na Parte 3.</li><li> Quando as células atingem todos os OD = 0,1-0,15, retire a placa do leitor de placa e parar a gravação. </li><li> Adicionar conjugados QD em diferentes concentrações em, pelo menos em quadruplicado. Use um lado da placa como um controlo &quot;escuro&quot; e uma meia para ser iluminada. Um esquema sugerido é dada na Figura 6. A faixa de controle de bactérias só deve ser sempre incluída em casos de problemas com a cultura, temperatura, etc afetar as condições de crescimento. A única faixa de droga apenas e só QD também devem ser incluídos para garantir que elas coincidam com a placa de controle feito anteriormente. O resto dos poços são dedicados a conjugados, a fim de permitir a boas estatísticas. </li><li> Proteja o lado &quot;negro&quot; da placa com papel alumínio. Expor o outro lado para uma lâmpada no comprimento de onda desejado. </li><li> Após a exposição à luz, colocar a placa no leitor de placas e OD recorde de 600 a cada 10 minutos para 5-12 horas. Mantenha a temperatura &lt;32 ° C, se possível, evitar drying das culturas. </li></ol> Resultados representativos. A combinação de QDs e antibiótico pode ser menos tóxico do que o antibiótico por si só; igualmente tóxicos; ou mais tóxico. Isto pode ser quantificada utilizando as curvas de crescimento e de IC50 de medições. A Figura 7 mostra um exemplo de conjugados que igualmente tóxicos como antibiótico por si só, e um exemplo de conjugados que são mais tóxicos. 5. Contagem <ol><li> Escolher um ou mais dos poços da placa de 96 poços tratada de modo a ser utilizados para diluições em série e contagem de colónias. </li><li> Fazer uma diluição em série de cada uma das amostras seleccionadas bacterianas com PBS ou solução salina (0,9% NaCl). Transferir 20 uL da solução bacteriana e diluir com 180 uL solução salina, alterar a ponta da pipeta mistura, e transferir 20 uL de solução bacteriana diluída para 180 uL solução salina. Repita 6 vezes. </li><li> Tome 10 uL de cada diluição e placa sobre um adequado<html> placa de mídia sólido. Todos os 8 concentrações de uma amostra pode ser revestida sobre um prato 10 centímetros de Petri redondo, embora pratos rectangulares são preferidos porque é mais fácil para alinhar as coisas. </li><li> Deixar secar sobre a bancada durante 15 min. então incubar à temperatura apropriada para o seu bactérias durante 16 horas. </li><li> Contar as colónias e calcular unidades formadoras de colónias (CFU) de acordo com (# de colónias x factor de diluição) / volume chapeado = CFU / mL. </li></ol> A Figura 8 mostra uma placa de CFU exemplo. 6. Os resultados representativos <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" /> Figura 1. QDs CdTe. (A) Oito preparações de QDs CdTe iluminada com uma varinha de UV (365 nm). (B) Espectro de absorção e emissão de cinco tamanhos selecionados antes e depois da água solubilização. As linhas tracejadas são espectros em tolueno, as linhas sólidas são em água. files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. A análise espectral e gel de QD-PMB conjugados. QDs laranja emissores de CdTe foram utilizados para este exemplo, os efeitos sobre outros tipos de QDs terá de ser avaliados para cada experiência. (A) absorvância típica (cinza de linha) e espectros de emissão (linha preta) dos QDs antes de conjugação de PMB ea emissão (linha tracejada) após a adição de 160 equivalentes molares de PMB. (B) relação entre a razão do PMB ea intensidade da emissão QD (quadrados) e localização do pico de comprimento de onda (triângulos). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" /> Figura 3. Sugerida layout da placa para placa de controle de crescimento. Uma ampla gama de concentrações de PMB e QD está representado. Uma metade da placa é irradiada (realçado azul), e uma meia idêntica é protegido da luz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui</a>para ver maior figura. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" /> Figura 4. Lâmpada personalizado 96-LED para irradiação placa uniforme, mostrando aparência off e on. Uma lâmpada de mão típico UV pode também ser utilizado, mas não vai cobrir a totalidade da placa de modo uniforme. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" /> Figura 5. Exemplos de resultados para o controle da placa de crescimento. (A) representativos curvas de crescimento de bactérias com diferentes concentrações da droga, de 0 a completar a morte celular. Os símbolos abertos são PMB apenas com concentrações dadas; os símbolos a cheio são CdTe-PMB sem irradiação; e os símbolos meia-cheias são CdTe-PMB com irradiação. A irradiação não teve nenhum efeito sobre as amostras PMB-somente, assim estas curvas foram omitidos para maior clareza. Todos os conjugados PMB-CdTe são 30:1 PMB: razões de QD. (B) Parcelas de valores da curva de crescimento em 200 min vs Log [PMB] e se encaixa com a equação. (1). Para control para os efeitos da luz, uma curva é feito com antibiótico apenas com 30 minutos de exposição à luz. (C) a sobrevivência bacteriana em 200 min vs concentração QD, usando QDs CdTe. Alguns toxicidade é visto com exposição à luz, mas muito pouco para determinar um valor IC50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" /> Figura 6. Sugerida layout para placa de teste conjugado. A metade azul-destaque da placa deve ser exposto à luz, ea metade unhighlighted está protegida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 7" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" /> Figura 7. Exemplo resultados para placa de teste do conjugado. Valores de crescimento curva em 200 min foram plotted e ajuste para a equação. (1). (A) CdTe-PMB conjugados mostram aumento de toxicidade sobre PMB sozinho. (B) de nanopartículas de ouro Au-PMB conjugados não mostram aumento da toxicidade sobre PMB sozinho. <img alt="A Figura 8" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" /> Figura 8. Exemplo de uma placa de CFU. E. coli semeadas numa placa de 96 poços foi tratada com QD-PMB com ou sem irradiação durante 30 min. em seguida, incubadas a 32 ° C durante 4 horas. Diluições em série de cada amostra bacteriana foram feitas com solução salina, e 10 uL de 100 X a 10 7 diluições X foram plaqueadas em placas de agar. As placas foram incubadas a 37 ° C e as colónias foram contadas após 16 horas. A placa mostra as diluições ao longo das linhas como indicado, as colunas são: (A) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe, (B) 0,12 PMB uM + 4 nM CdTe (C) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe, (D) 0,06 iM PMB + 2 nM CdTe irradiadas, (E) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe irradiadas, (F) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe irradiaçãomediado.

<ol><li>Michalet, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+for+live+cells%2C+in+vivo+imaging%2C+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics.</a> Science. 307, 538-544 (2005).</li>
<li>Jamieson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+applications+of+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biological applications of quantum dots.</a> Biomaterials. 28, 4717-4732 (2007).</li>
<li>Asokan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+heat+transfer+fluids+in+the+synthesis+of+high-quality+CdSe+quantum+dots%2C+core%2Fshell+quantum+dots%2C+and+quantum+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The use of heat transfer fluids in the synthesis of high-quality CdSe quantum dots, core/shell quantum dots, and quantum rods.</a> Nanotechnology. 16, 2000-2011 (2005).</li>
<li>Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+quantum+dots+for+multiplexed+biological+detection+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 13, 40-46 (2002).</li>
<li>Chan, W. C. W., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+bioconjugates+for+ultrasensitive+nonisotopic+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection.</a> Science. 281, 2016-2018 (1998).</li>
<li>Biju, V., Itoh, T., Ishikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+quantum+dots+to+cells%3A+bioconjugated+quantum+dots+for+targeted+and+nonspecific+extracellular+and+intracellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intracellular imaging.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 3031-3056 (2010).</li>
<li>Boucher, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bad++bugs%2C+no+drugs%3A+no+ESKAPE%21+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clin. Infect. Dis. 48, 1-12 (2009).</li>
<li>Morones, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bactericidal+effect+of+silver+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The bactericidal effect of silver nanoparticles.</a> Nanotechnology. 16, 2346-2353 (2005).</li>
<li>Mitoraj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light+inactivation+of+bacteria+and+fungi+by+modified+titanium+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visible light inactivation of bacteria and fungi by modified titanium dioxide.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 6, 642-648 (2007).</li>
<li>Fu, G., Vary, P. S., Lin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatase+TiO2+nanocomposites+for+antimicrobial+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Anatase TiO2 nanocomposites for antimicrobial coatings.</a> J. Phys. Chem. B. 109, 8889-8898 (2005).</li>
<li>Chung, C. J., Lin, H. I., Tsou, H. K., Shi, Z. Y., He, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antimicrobial+TiO2+coating+for+reducing+hospital-acquired+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B.+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">An antimicrobial TiO2 coating for reducing hospital-acquired infection.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 85, 220-224 (2008).</li>
<li>Nair, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+size+scale+of+ZnO+nanoparticles+and+microparticles+on+toxicity+toward+bacteria+and+osteoblast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of size scale of ZnO nanoparticles and microparticles on toxicity toward bacteria and osteoblast cancer cells.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, Suppl . 1. S235-S241 (2009).</li>
<li>Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. C., Kahru, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+nanosized+and+bulk+ZnO%2C+CuO+and+TiO2+to+bacteria+Vibrio+fischeri+and+crustaceans+Daphnia+magna+and+Thamnocephalus+platyurus%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus.</a> Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).</li>
<li>Rincon, A. G., Pulgarin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+coaxial+photocatalytic+reactor+%28CAPHORE%29+in+the+TiO2+photo-assisted+treatment+of+mixed+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+and+the+bacterial+community+present+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Catal.+Today%22%5BJournal%5D)">Use of coaxial photocatalytic reactor (CAPHORE) in the TiO2 photo-assisted treatment of mixed Escherichia coli and Bacillus subtilis and the bacterial community present in wastewater.</a> Catal. Today. 101, 331-344 (2005).</li>
<li>Neal, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+be+inferred+from+bacterium-nanoparticle+interactions+about+the+potential+consequences+of+environmental+exposure+to+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">What can be inferred from bacterium-nanoparticle interactions about the potential consequences of environmental exposure to nanoparticles.</a> Ecotoxicology. 17, 362-371 (2008).</li>
<li>Kovochich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+C60+aggregates+toward+mammalian+cells%3A+role+of+tetrahydrofuran+%28THF%29+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of C60 aggregates toward mammalian cells: role of tetrahydrofuran (THF) decomposition.</a> Environ. Sci. Technol. 43, 6378-6384 (2009).</li>
<li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+and+cellular+toxicity+of+nanocrystal+quantum+dots+depend+on+their+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties and cellular toxicity of nanocrystal quantum dots depend on their surface modification.</a> Nano Letters. 4, 2163-2169 (2004).</li>
<li>Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+CdTe+Quantum+Dots+in+Bacterial+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+NanoBiosci%22%5BJournal%5D)">Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains.</a> IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).</li>
<li>Park, S., Chibli, H., Wong, J., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activity+and+cellular+toxicity+of+nanoparticle-polymyxin+B+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activity and cellular toxicity of nanoparticle-polymyxin B conjugates.</a> Nanotechnology. 22, 185101(2011).</li>
<li>Cooper, D. R., Dimitrijevic, N. M., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitization+of+CdSe%2FZnS+QDs+and+reliability+of+assays+for+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Photosensitization of CdSe/ZnS QDs and reliability of assays for reactive oxygen species production.</a> Nanoscale. 2, 114-121 (2010).</li>
<li>Pong, B. K., Trout, B. L., Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+ligand-exchange+for+efficient+solubilization+of+CdSe%2FZnS+quantum+dots+in+water%3A+A+procedure+guided+by+computational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Modified ligand-exchange for efficient solubilization of CdSe/ZnS quantum dots in water: A procedure guided by computational studies.</a> Langmuir. 24, 5270-5276 (2008).</li>
<li>Narayanaswamy, A., Feiner, L. F., Meijerink, A., Zaag, P. J. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+and+dot+size+on+the+spectral+properties+of+colloidal+InP%2FZnS+core-shell+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature and dot size on the spectral properties of colloidal InP/ZnS core-shell quantum dots.</a> Acs Nano. 3, 2539-2546 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As nanopartículas representam uma abordagem promissora para a criação de novos agentes anti-microbianos. Análise da curva de crescimento é uma maneira de monitorar a densidade da célula bacteriana que distingue as células-ativamente crescentes de crescimento inibido células. Quando acoplada com contagens de placas, permite uma análise completa do potencial antibiótico de um conjugado. O formato de 96 poços permite variações relativamente alto rendimento de concentração e outras condições, tais como exposição à luz, este...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Borato componente tampão # 1 </td><td> Pescador </td><td> O ácido bórico A-74-1 </td><td></td></tr><tr><td> Borato componente tampão # 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Tetraborato de sódio B9876 </td><td></td></tr><tr><td> MPA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5801 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin 500 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9322 </td><td> Vários MWCO disponível </td></tr><tr><td> Frascos de vidro </td><td> Pescador </td><td> 03-338C </td><td></td></tr><tr><td> EDC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E6383 </td><td></td></tr><tr><td> A polimixina B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1004 </td><td></td></tr><tr><td> Gr bacterianaowth médio Componente (LB) # 1 </td><td> Pescador </td><td> NaCl S271 </td><td></td></tr><tr><td> Meio de crescimento bacteriano (LB) Componente # 2 </td><td> BD </td><td> Triptona 211705 </td><td></td></tr><tr><td> Meio de crescimento bacteriano (LB) Componente # 3 </td><td> BD </td><td> Extracto de levedura 211.929 </td><td></td></tr><tr><td> Lâmpada para exposição à luz </td><td> Personalizado </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clara de fundo placas de 96 poços </td><td> Pescador </td><td> 07-200-567 ou 07-200-730 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescência espectrômetro </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leitor de placas de absorbância </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BactoAgar para meios sólidos </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.1 </td><td></td></tr><tr><td> As placas de Petri em volta </td><td> Pescador </td><td> 08-75-12 </td><td></td></tr><tr><td> As placas de Petri rectangulares </td><td> Pescador </td><td> 08-757-11A </td><td></td></tr></tbody></table>

solubilização e bio conjugação de pontos quânticos e ensaios de toxicidade bacterianas por curva de crescimento e contagem

Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

Os pontos quânticos (QDs) são nanopartículas de semicondutores fluorescentes com tamanho dependente de espectros de emissão que podem ser excitados por uma ampla gama de comprimentos de onda. QDs têm atraído muito interesse para a imagem, diagnóstico e terapêutica devido a sua fluorescência brilhante e estável 1,2 3,4,5. QDs podem ser conjugados com uma variedade de moléculas bio-activas para a ligação a bactérias e células de mamíferos 6. QDs também estão sendo amplamente investigada como agentes citotóxicos para o assassinato seletivo de bactérias. O surgimento de multiplicar-estirpes bacterianas resistentes torna-se rapidamente uma crise de saúde pública, particularmente no caso de agentes patogénicos Gram negativos 7. Por causa do efeito bem conhecido antimicrobiana de nanomateriais certos, especialmente de Ag, existem centenas de estudos que examinam a toxicidade das nanopartículas de bactérias 8. Estudos bacterianas foram realizados com outros tipos de nanopartículas de semicondutores, bem como, especially TiO 2 9,10-11, mas também ZnO 12 e outros, incluindo CuO 13. Alguns comparações de estirpes bacterianas foram realizados nestes estudos, geralmente comparando uma estirpe de bactérias Gram negativas com um positivo de Gram. Com todas essas partículas, mecanismos de toxicidade são atribuídos a oxidação: ou fotogeração o de espécies reactivas de oxigénio (ROS) pelas partículas ou a libertação directa de iões metálicos que podem causar toxicidade oxidativo. Mesmo com esses materiais, resultados de diferentes estudos variam muito. Em alguns estudos a cepa teste do Gram positivo é declaradamente mais sensível do que os 10 Gram negativa, em outros, é o 14 oposto. Estes estudos têm sido bem revisada 15. Em todos os estudos de nanopartículas, a composição de partículas, o tamanho, a química de superfície, a amostra de envelhecimento / avaria, eo comprimento de onda, a potência ea duração da exposição à luz podem todos afectar dramaticamente os resultados. Além disso, sintetizadosubprodutos s e solventes deve ser considerado 16 17. Técnicas de rastreio de alto rendimento são necessários para ser capaz de desenvolver agentes eficazes de nanomedicina novos. QDs CdTe têm efeitos anti-microbianos por si só 18 ou em combinação com antibióticos. Em um estudo anterior, mostramos que o acoplamento de antibióticos para CdTe pode aumentar a toxicidade para as bactérias, mas reduzir a toxicidade para células de mamíferos, devido à diminuição da produção de espécies reativas de oxigênio a partir das 19 conjugados. Embora seja improvável que o cádmio contendo-os compostos irão ser aprovado para utilização em seres humanos, tais preparações podem ser utilizadas para a desinfecção de superfícies ou de esterilização da água. Neste protocolo, damos uma abordagem direta para solubilização QDs CdTe com ácido mercaptopropiónico (MPA). Os QDs estão prontos para uso dentro de uma hora. Nós, então, demonstrar o acoplamento de um agente antimicrobiano. A segunda parte do protocolodemonstra um ensaio de inibição de 96 poços bacteriana utilizando os QDs conjugados e não conjugada. A densidade óptica é lida durante muitas horas, permitindo que os efeitos da adição QD e exposição à luz a ser avaliada, bem como imediatamente após um período de recuperação. Nós também ilustram uma contagem da colónia para a quantificação de sobrevivência bacteriana.

As nanopartículas, tais como pontos quânticos de semicondutores (QDs) pode ser usado para criar agentes fotoactiváveis ​​para aplicações anti-microbianos ou anti-cancro. Esta técnica mostra como a água-solubilizar telureto de cádmio (CdTe) QDs, conjugá-los a um antibiótico, e realizar um ensaio de inibição bacteriana baseada em curvas de crescimento e contagem de placa.

Solubilização e Bio conjugação de pontos quânticos e ensaios de toxicidade bacterianas por curva de crescimento e Contagem

Pontos quânticos (QDs) são nanopartículas semicondutoras fluorescentes com espectros de emissão dependentes do tamanho que podem ser excitados por uma ampla escolha de comprimentos de onda. ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar triagem em alta escala dos efeitos antibacterianos de nanopartículas com ou sem conjugação a antibióticos. Aqui, os efeitos antibacterianos de polimix e B, nanopartículas de telureto de cádmio conjugadas, são testados para alcançar esse objetivo. Primeiramente, as nanopartículas são solubilizadas em ácido mercaptopropiónico.Em seguida, os pontos quânticos são conjugados ao poli mix e B; as bactérias cultivadas com antibióticos são então tratadas com pontos quânticos conjugados e não conjugados com antibióticos, e metade das amostras é submetida à radiação com luz azul de 440 nanômetros por 30 minutos, o que induz os pontos quânticos a gerar excitons e espécies reativas de oxigênio, a fim de avaliar o efeito dos tratamentos com pontos quânticos sobre o crescimento e a sobrevivência bacteriana. São realizadas leituras de densidade óptica e contagens de colônias. Os dados obtidos indicam que a aplicação de pontos quânticos de telureto de cádmio conjugados com antibiótico, seguida por radiação I, produz os maiores efeitos tidais entre as condições testadas.Embora este método possa fornecer informações sobre o efeito dos pontos quânticos de

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra a detecção bacteriana quantitativa multiplexada empregando microesferas de poliestireno magnético carboxilado tingidas em conjuntos distintos. O procedimento engloba a formação de complexos de bactérias, separação magnética e análise baseada em fluxo, permitindo a quantificação precisa e simultânea de várias bactérias no mesmo poço de reação.

Detecção Bacteriana Quantitativa Multiplexada usando Microesferas Magnéticas Marcadas com Corante

Um protocolo para a quantificação e comparação simultânea de três componentes celulares e extracelulares dentro de biofilmes é apresentado. A metodologia envolve o uso de microscopia confocal de varredura a laser, software de análise e visualização estrutural de biofilme e software de análise estatística.

Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes

As bactérias podem acumular mutações prejudiciais ou benéficas durante a vida. Em uma população de células indivíduos que acumularam mutações benéficas podem rapidamente superar seus companheiros. Aqui apresentamos um procedimento simples para visualizar a competição de intraespécies em uma população de células bacterianas ao longo do tempo usando indivíduos rotulados fluorescentes.

Monitorando a competição de subespécies em uma população de células bacterianas por cocultivação de cepas fluorescentes rotuladas

Fornecemos instruções detalhadas para a preparação de pontos quânticos direcionados monovalentes (mQDs) a partir de DNA fosforotioato de comprimento definido. O envolvimento do DNA ocorre em alto rendimento e, portanto, os produtos não requerem purificação. Demonstramos o uso da tag SNAP para direcionar mQDs para receptores de superfície celular para aplicações de imagem de células vivas.

Produção e Segmentação de Monovalent Quantum Dots

As infecções por biofilme mostram alta tolerância à quimioterapia. Nenhum ensaio captura a complexidade dos biofilmes. Em vez disso, são necessários ensaios complementares. Apresentamos uma plataforma de triagem (desenvolvida para S. aureus) que combina ensaios de viabilidade, biomassa e matriz de biofilme. Permite a descoberta de medicamentos anti-biofilme, incluindo a avaliação dos efeitos quimioterápicos a longo prazo.

A Plataforma de Ensaios Anti-biofilme adequado para a Exploração de bibliotecas de compostos naturais

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Um simples ensaio de medição da ATP e método de coloração ao vivo/morto foram usados para quantificar e Visualizar Neisseria gonorrhoeae sobrevivência após o tratamento com ceftriaxona. Este protocolo pode ser estendido para examinar os efeitos antimicrobianos de qualquer antibiótico e pode ser usado para definir a concentração inibitória mínima dos antibióticos em biofilmes bacterianos.

Exame quantitativos de susceptibilidade antibiótica de Neisseria gonorrhoeae agregados usando ATP-utilização comercial ensaios e coloração Live/mortos

Antibióticos fluorescentes são ferramentas poderosas que podem ser usadas para estudar múltiplos aspectos da resistência antimicrobiana. Este artigo descreve a preparação de antibióticos fluorescentes e sua aplicação para estudar a resistência a antibióticos em bactérias. As sondas podem ser usadas para estudar mecanismos de resistência bacteriana (por exemplo, efflux) por espectrofotometria, citometria de fluxo e microscopia.

Visualização da resistência bacteriana usando sondas de antibióticos fluorescentes

Este manuscrito descreve um método para o uso de microscopia de fluorescência unicelular para visualizar e quantificar a competição bacteriana na cocultura.

Quantificação da Competição Interbacteriana usando imagens de fluorescência unicelular

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a eficácia antibacteriana de um polímero eluidor de antibióticos para simular aplicação clínica profilática usando um ensaio de viabilidade microbiana luminescente baseado em ATP disponível comercialmente em tempo real. Esse método permite o monitoramento da atividade longitudinal de materiais farmacológicos e pode ser amplamente adaptado para testar plataformas de liberação de fármacos antimicrobianos.

Um Novo Método para Determinar a Atividade Antibacteriana Longitudinal de Materiais Farmacológicos

Este protocolo fornece uma estrutura sistemática para avaliar como os fitoquímicos podem potencializar os efeitos bactericidas dos biocidas tradicionais usando modelagem de atividade bactericida e ensaios de interação combinatória, que visam identificar misturas sinérgicas que melhorem o controle microbiano e reduzam o uso geral de biocidas.

In Vitro Avaliação dos Efeitos Potenciadores de Moléculas Derivadas de Plantas sobre Biocidas Convencionais

Aprenda a solubilizar e bioconjugar pontos quânticos de CdTe para avaliar efeitos antibacterianos em bactérias. Este método utiliza ativação por luz azul de 440 nm para gerar espécies reativas de oxigênio e medir a sobrevivência bacteriana.

Solubilização e Bio conjugação de pontos quânticos e ensaios de toxicidade bacterianas por curva de crescimento e Contagem

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