Em Eletroporação vitro do lábio inferior rômbico de embriões de camundongos Midgestation

O objetivo geral deste procedimento é manipular a expressão gênica em progenitores do cérebro posterior embrionário por meio da introdução de DNA plasmidial por eletroporação em estágios gestacionais mais precoces. Isso é realizado primeiramente isolando embriões com 11,5 dias de gestação e posicionando-os com a face dorsal voltada para cima em solução salina tamponada com fosfato estéril. O segundo passo consiste em injetar cerca de 50 microlitros do plasmídeo de expressão em 0,01% de verde rápido.

Em uma injeção bem-sucedida, todo o sistema ventricular será preenchido com a mistura de DNA e azul de metileno. Em seguida, o embrião é submetido a um pulso elétrico. O lado do embrião mais próximo ao eletrodo carregado positivamente incorporará o DNA plasmidial.

O outro lado servirá como controle negativo interno. O passo final é a colocação dos embriões em cultura de tecidos por pelo menos 24 horas. Em última análise, o gene eletroporado será expresso após 24 horas de cultura e poderá ser avaliado por imunohistoquímica.

A vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que é possível manipular os progenitores do rombencéfalo embrionário em pontos temporais gestacionais mais precoces. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área, como a forma pela qual diferentes genes ural podem influenciar o destino dos progenitores embrionários. Inicie este procedimento esterilizando as ferramentas de dissecação e a cabine de fluxo laminar de acordo com o manuscrito anexo.

Para coletar os embriões, coloque uma fêmea de camundongo eutanasiada que esteja grávida com prole no dia gestacional E 11,5 sobre a bandeja de dissecação na capela. Em seguida, pulverize o abdômen do camundongo com etanol 70%. Abra a cavidade peritoneal e fixe as paredes na bandeja de dissecação.

Em seguida, puxe os cornos uterinos para que fiquem posicionados dentro da cavidade peritoneal. Usando pinças, abra cuidadosamente a parede do corno uterino. Utilize uma colher de 20 milímetros para remover suavemente os embriões no saco vitelino da placenta.

Após isso, coloque os embriões em uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros, previamente preenchida com 10 mililitros de PBS estéril pré-aquecido uma vez. Nesta etapa, transfira o primeiro embrião para uma nova placa de 100 milímetros previamente preenchida com 10 mililitros de PBS estéril uma vez, que foi pré-aquecida a 37 graus Celsius.

Em seguida, remova e descarte cuidadosamente o saco vitelino. Posicione então o embrião de modo que seu lado dorsal esteja voltado para cima. Segure suavemente o embrião com as pás eletrodos de sete milímetros sob um microscópio estereoscópico.

Posicione os eletrodos um em cada lado do tubo neural ao nível do quarto ventrículo do cérebro posterior. Em seguida, use uma seringa de um cc para aspirar a mistura de DNA plasmidial e Fast green a 0,01%. Em geral, 500 microlitros da mistura são suficientes para a eletroporação de pelo menos oito a dez embriões. A seguir, fure suavemente a placa do teto que recobre o quarto ventrículo com uma agulha tuberculínica de 25 mm e cinco oitavos de polegada acoplada à seringa de um cc.

Em seguida, injete cerca de 50 microlitros da mistura DNA DI no ventrículo. Injeções bem-sucedidas são caracterizadas pelo preenchimento completo de todo o sistema ventricular pela mistura DNA DI. Um método alternativo de administração da mistura DNA DI será acessar o sistema ventricular perfurando o véu, sobrejacente ao mesencéfalo, ligar o gerador de pulsos e então aplicar cinco pulsos quadrados utilizando um gerador de pulsos por eletrodo e as pás eletrodos de sete milímetros mais próximas ao tecido carregado positivamente.

Em seguida, ao manipular o plasmídeo em uma cabine de fluxo laminar, preencha os poços da placa de cultura de 12 poços com dois mililitros de meio DME MF 12 suplementado com 10% de soro bovino fetal, 5% de soro equino, 1% de glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina, previamente aquecido a 37 graus Celsius. Em seguida, pinça-se o embrião na região mediana com um par de pinças. Remova a porção posterior do embrião e, posteriormente, coloque a porção anterior em um dos poços preenchidos da placa de cultura.

Repita o procedimento para todos os embriões e preencha apenas os poços externos da placa de 12 poços. Para evitar contaminação das culturas, mantenha os embriões em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas para expressar o plasmídeo eletroporado. Se for desejado um tempo de cultura mais longo, preencha os poços serológicos de um novo prato de 12 poços com dois mililitros do meio D-M-E-M-F 12.

Transfira os embriões com uma colher esterilizada para os poços de uma nova placa. Em seguida, coloque-os de volta no incubador a 37 graus Celsius e cultive-os por até 48 horas para fixar os embriões para análise. Preencha uma placa de 12 poços com PBS a uma vez, depois transfira os embriões e lave-os a quatro graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, fixe os embriões em paraformaldeído 2% em PBS 1 vez por duas horas a quatro graus Celsius. Então, enxágue-os três vezes em PBS 1 vez a quatro graus Celsius por cinco minutos. Novamente, após preencher uma nova placa de 12 poços com sacarose 30% em PBS 1 vez.

Transfira os embriões para essas placas e equilibre-os durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, inclua os embriões no composto de temperatura de corte ideal utilizando um banho de etanol com gelo seco ou armazene-os a menos 20 graus Celsius. No final, corte os embriões em seções de 30 mícrons com um criostato.

Monte-os em lâminas e armazene-os a menos 20 graus Celsius a partir da uni histoquímica. Os estudos mostrados aqui são os resultados representativos da imuno-histoquímica para GFP em cortes transversais de um embrião eletroporado E 11,5 após 24 horas de cultivo. As setas mostradas aqui indicam a placa do teto, que retém o anticorpo secundário.

Os resultados mostram que a área eletroporada do lábio ROIC inferior foi restrita e não se estendeu a todo o eixo anterior-posterior do tubo neural. Aqui são apresentados os resultados de duas das proteínas analisadas: MASH1 e Math1. Observamos que a maioria dos embriões manteve níveis normais de expressão após a eletroporação e o cultivo, em comparação com os embriões controle aos 11,5 dias. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em uma a duas horas, se realizada corretamente.

Após assistir a este vídeo, você agora deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o ensaio de eletroporação in vitro para manipular a expressão gênica nos progenitores da membrana embrionária do camundongo.