Name: Oct4GiP Ensaio Reporter para o Estudo de genes que regulam o mouse Manutenção células-tronco embrionárias e auto-renovação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a usar o ensaio reporter Oct4GiP para estudar genes que regulam a manutenção e autorrenovação de células-tronco embrionárias de mouse. Este método permite avaliar rapidamente a função gênica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos Brad Lackford para leitura e edição do manuscrito. Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental, National Institutes of Health Research Program intramuros Z01ES102745 (GH).

1. Oct4GiP mouse manutenção de células ES Células Oct4GiP foram gentilmente fornecido pelo Dr. Austin Smith. Eles foram derivados a partir dos ratinhos 129/Ola que transportam um transgene Oct4-GFPiresPac 4,5. Eles são mantidas em placas revestidas com gelatina de cultura de tecidos em meio ESGRO completa mais clonal grau (Millipore), ou em meio M15: DMEM (Invitrogen) suplementado com 15% de FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x não- aminoácidos essenciais (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore), e 10 uM β-mercaptoetanol. <ol><li> Revestir placas com 0,1% de gelatina (Sigma) à temperatura ambiente durante 30 minutos (0,1 ml gelatina solução cm / 2). </li><li> Placa células Oct4GiP em gelatina-placas revestidas a ~ 2 x 10 4 cm / 2. </li><li> Dividir as células de dois em dois dias com tripsina a 0,05%. </li></ol> 2. Transfection siRNA em células Oct4GiP O ensaio de repórter Oct4GiP é mais convenienqüentemente realizado em gelatina-revestido fundo plano 96 - ou 384-bem placas (Corning ou BD) no meio de M15. O procedimento geral é descrito na Figura 1. <ol><li> siRNA lipídios montagem complexos: <ol><li> Para a transfecção em placas de 96 poços, montar siRNA-lipídicos complexos em U-inferior placas de 96 poços. </li><li> Em cada poço, misturar 10 uL OptiMEM (Invitrogen) e 0,3 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen) e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Adicionar 5 pmol siRNA à mistura lípido-OptiMEM e incubar durante mais 15 minutos. O siRNA: razão de lípido é de 100 pmol: 6ul. </li><li> Transferir os complexos siRNA-lipídicos em OptiMEM a partir da placa de U-baixo para a gelatina revestido placa de fundo plano com uma pipeta multi-canal. </li><li> Para a transfecção em 384 poços, preparar os complexos siRNA-lipídicos utilizando Lipofectamine 0,1 uL de 2000 e 2 pmol siRNA em 10 OptiMEM uL. </li></ol></li></ol> Nota: A concentração final em siRNAas transfecções é de 50 nM. Realizar biológica 3-4 repetições para cada transfecção do siRNA. Configure misturas mestras dos complexos siRNA-lipídicos na placa de U-bottom e alíquota para o plano de fundo chapa de gelatina-revestido. <ol start="2"><li> Oct4GiP plaqueamento de células e de transfecção: <ol><li> Para a transfecção em placas de 96 poços, recolher as células Oct4GiP e ressuspender em meio M15-los fresco a 9 x 10 4 células / ml. </li><li> Adicionar 100 uL da suspensão de células para cada poço utilizando uma pipeta multi-canal. </li><li> Misturar a suspensão de células com os pré-alíquotas siRNA lípidos complexos no poço por pipetagem cima e para baixo 3-5 vezes. Alterar dicas para transfecções siRNA diferentes. </li><li> Para a transfecção em placas de 384 poços, as células Oct4GiP Ressuspenda a 6 x 10 4 células / ml e 30 aliquota de suspensão de células uL a cada poço. </li></ol></li></ol> Nota: A densidade de plaqueamento óptima de células é geralmente de 3 x 10 5 células / cm 2, mas may requerem otimização de siRNAs que afetam drasticamente o crescimento celular ou viabilidade. Densidade plaqueamento baixa irá conduzir a sobrevivência da célula pobre durante a transfecção. Densidade de plaqueamento alta levará a fundo elevado, devido à elevada diferenciação celular induzida confluência. Se necessário, a densidade de plaqueamento de ensaio entre 2-4 x 10 5 células / cm 2. <ol start="3"><li> Troca de meio: <ol><li> Remova o meio de idade, utilizando multi-canal de aspiração (Corning) ou vácuo varinha (VP-Científico). Ter cuidado para não riscar as células no fundo das placas. </li><li> Alimentar as células com meio fresco de células ES (100 uL para a placa de 96 poços e 30 uL de 384-bem placa) usando uma pipeta multi-canal a cada dia. </li></ol></li></ol> 3. Análise FACS <ol><li> Dissociação celular: <ol><li> Quatro dias após a transfecção, remover média usando multi-canal de aspiração (Corning) ou de vácuo varinha (VP-Scientific). </li><li> Para placas de 96 poços, lavar as células uma vez com 100μl de PBS. </li><li> Adicionar 25 ul de tripsina a 0,25% a cada poço utilizando uma pipeta multi-canal. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos com agitação ocasional, e inspeccione visualmente para assegurar separação completa das células. </li><li> Adicionar 90 ul de PBS com FBS 10% para inactivar a tripsina e dissociam-se as células em uma única suspensão celular por pipetagem repetida. </li><li> Para 384 poços, dissociar as células com 10 ul de tripsina e extingue-se com 30 ul de PBS com FBS 10%. </li></ol></li><li> Análise FACS: <ol><li> Analise a fluorescência da GFP no analisador FACS BD LSRII equipado com a unidade de HTS ou outro com o mesmo equipamento analisador FACS (tais como Accuri ou Intellicyt). </li><li> Utilizar o modo de alto rendimento no HTS e analisar 10 ul de suspensão de células. Definir o limite de contagem de 1,0 x 10 4 células. </li><li> Ajuste a tensão PMT e limiar para capturar as células na trama para frente contra o dispersor lateral. Porta para a população de células vivas no FORWard vs enredo lado dispersão. </li><li> Criar um histograma para o canal de GFP. Definir o portão no canal de modo que a GFP ~ 10% das células parecem ser GFP-negativa nas células simulados ou controlo siRNA-transfectadas. </li><li> Determinar% GFP-negativas células de cada tratamento: células diferenciadas% =% GFP-negativas células. Compare as células diferenciadas% entre experimentais e controle de siRNA-transfecções usando 2-tailed t-teste, e marcar as visitas positivas com valores de p &lt;0,01. </li></ol></li></ol> 4. Os resultados representativos Oct4, Nanog, e Sox2 são três genes que desempenham papéis cruciais na manutenção da célula ES auto-renovação 6,7,9-11. Figura 2 mostra que o ensaio de repórter Oct4GiP pode facilmente detectar a diferenciação causada por silenciar estes factores no células-tronco embrionárias Oct4GiP. A Figura 2A mostra as células ES são Oct4GiP GFP-positivo quando mantidos como ES<html> células. Figura 2B mostra o gráfico de dispersão para a frente vs lado e do histograma do canal de GFP das células Oct4GiP transfectadas com o controlo ou Oct4 de siRNAs. É necessário portão para células vivas no gráfico de dispersão para a frente vs lado, como as células mortas e detritos são GFP-negativa e irá aumentar de fundo. Por outro lado, dupleto discriminação para excluir aglomerados de células possíveis nem sempre é necessária. Nas células de controlo siRNA-transfectadas, a grande maioria das células deve ser GFP-positivo. Se óbvias GFP-negativas populações estão presentes nos poços de controlo de siRNA-transfectadas, as células Oct4GiP de partida ou o procedimento de transfecção pode ter sido comprometida eo resultado pode não ser interpretável. A Figura 2C mostra o gráfico de barras de células diferenciadas% (células diferenciadas% =% GFP-negativas células) do controle, Oct4-, NANOG-, e Sox2 siRNA-células transfectadas. <html> d/3987/3987fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Esboço do ensaio repórter Oct4GiP. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" /> Figura 2. Oct4GiP ensaio repórter pode detectar diferenciação de células ES causada por Nanog, Oct4, ou silenciamento Sox2. A) E14Tg2a (de tipo selvagem de linha, preto) e Oct4GiP (linha verde), as células foram analisadas por FACS. Histograma da GFP-canal mostra que as células são Oct4GiP GFP-positivo. B) As células foram transfectadas Oct4GiP em placas de 96 poços com o controle ou Oct4 siRNA e FACS analisados ​​4 dias após a transfecção. As células para a frente vs parcelas laterais de dispersão e histogramas da GFP-canal das células transfectadas são mostrados. C) Oct4GiP foram transfectadas com o Controlo-,-Nanog, Oct4-, ou-Sox2 siRNA. As células diferenciadas% foi determinada a partir da% GFP-negativa células 4 dias após a transfecção, e foi desenhado como média + / - erro padrão da média (n = 4).f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura.

<ol><li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+differentiation%3A+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+potency+by+spontaneous+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li>
<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+Oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li>
<li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+cloning+of+Nanog%2C+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li>
<li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3%2F4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li>
<li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li>
<li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li>
<li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li>
<li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+embryonic+stem+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li>
<li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li>
<li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ensaio repórter Oct4GiP descrevemos acima pode medir quantitativamente o grau de auto-renovação vs diferenciação. Em comparação com outros métodos disponíveis, tais como o 12 baseada na morfologia e proliferação / viabilidade baseado ensaios, oferece uma maior sensibilidade e rendimento, bem como uma medição mais directa do estado de células ES. É, portanto, bem adequado para grande escala telas e análise epistasia genética. Na verdade, nós e os outros têm utilizado com sucesso o ensaio repórter Oct4GiP par...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> ESGRO grau médio completo acrescido clonal </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (glucose elevada 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (reduzir o meio de soro) </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> ESGRO mLIF (10 7 units/1ml) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (Non-aminoácidos essenciais) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Nucleosídeos de 100x para a célula ES </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M7522-100ml </td></tr><tr><td> ES-qualificada de soro fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td></tr><tr><td> SiRNA Nanog </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-046.256-02 </td></tr><tr><td> SiRNA Sox2 </td><td> Dharmacon </td><td> M-058.489-01 </td></tr></tbody></table> SiRNA Controle: duplex siRNA alvo firefly luciferase (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA), sintetizado pelas Dharamcon.

oct4gip ensaio reporter para o estudo de genes que regulam o mouse manutenção células-tronco embrionárias e auto-renovação

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotência e auto-renovação são duas características definidoras das células-tronco embrionárias (células ES). O entendimento do mecanismo molecular vai facilitar muito o uso de células-tronco embrionárias para estudos de biologia do desenvolvimento, modelagem de doenças, descoberta de drogas e da medicina regenerativa (revisto em 1,2). Para acelerar a identificação e caracterização de novos reguladores de manutenção de células ES e auto-renovação, foi desenvolvido um ensaio baseado em fluorescência repórter para medir quantitativamente o estado de auto-renovação em células ES de rato usando as células Oct4GiP 3. As células Oct4GiP expressar a proteína verde fluorescente (GFP), sob o controlo da região promotora do gene Oct4 4,5. Oct4 é necessária para a célula ES auto-renovação, e é altamente expressa em células ES e rapidamente para baixo-regulado durante a diferenciação 6,7. Como resultado, a GFP expressão e de fluorescência nas células repórter correlaciona fielmentecom a célula de identidade ES 5, e fluorescência-activated separação de células (FACS) análise pode ser usado para acompanhar de perto o estado de auto-renovação das células ao nível única célula 3,8. Juntamente com RNAi, o ensaio repórter Oct4GiP pode ser usada para rapidamente identificar e estudar os reguladores de manutenção de células ES e auto-renovação 3,8. Em comparação com outros métodos para ensaiar a auto-renovação, é mais conveniente, sensível, quantitativa, e de menor custo. Ela pode ser realizada em 96 - ou 384-bem placas para estudos em larga escala, tais como de alto rendimento telas ou de análise de epistasia genética. Finalmente, por meio de outros linhagem específicos repórter linhas de células ES, o ensaio descrevemos aqui também pode ser modificada para estudar especificação destino durante a diferenciação de células ES.

Nós descrevemos um ensaio repórter de fluorescência para rapidamente identificar e caracterizar genes que regulam a manutenção do mouse células-tronco embrionárias e auto-renovação.

Oct4GiP Ensaio Reporter para o Estudo de genes que regulam o mouse Manutenção células-tronco embrionárias e auto-renovação

A pluripotência e a autorrenovação são duas características definidoras das células-tronco embrionárias (células CT). A compreensão do mecanismo molecular subjacente irá...

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar rapidamente o papel do gene de interesse na manutenção da autorrenovação de células-tronco embrionárias de camundongo ou células ES. Isso é alcançado primeiro montando a mistura-mestra de transfeção que será usada para silenciar os genes de interesse. Como segundo passo.A mistura-mestre de transfeção é transferida para uma placa revestida com gelatina e as células T 4G IP são adicionadas. Em seguida, as células são cultivadas em condições normais de cultura de células ES, permitindo que o efeito do silenciamento gênico se manifeste. Após quatro dias de cultura, as células são destacadas da placa e seu estado de autorrenovação é determinado por citometria de fluxo. Por fim, as diferenças no percentual de células GFP negativas entre as células T 4G IP transfectadas com siRNA controle e experimental podem ser avaliadas por meio de análises.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a análise da morfologia celular ou de marcadores de linhagem, é que ela oferece maior sensibilidade e produtividade, sendo, portanto, mais adequada para telas genéticas de média ou grande escala ou para análise de epistasia genética. Este método pode facilitar grandemente o estudo do gene importante para a manutenção e autorrenovação do ESL. Também pode ser adaptado aos eventos de autoespecificação que ocorrem durante a diferenciação do ESL.C&eacute;lulas T 4G IP s&atilde;o mantidas em placas revestidas com gelatina. S&atilde;o semeadas a cerca de duas vezes 10&sup4; por cent&iacute;metro quadrado e subcultivadas a cada dois a tr&ecirc;s dias para transfe&ccedil;&atilde;o. Em placas de 96 po&ccedil;os com fundo plano, comece revestindo a placa com gelatina 0,1%, em seguida prepare a mistura-mestre de Optum e Lipectomy 2000 e distribua al&iacute;quotas em uma placa de 96 po&ccedil;os com fundo em U.Incube a placa por cinco minutos em temperatura ambiente, depois adicione cinco picomoles de I a à mistura lipídica ideal e incube por mais 15 minutos. Em seguida, remova a gelatina da placa de fundo plano de 96 poços e use uma pipeta multicanal para transferir os complexos de lipídios i a em condição ideal da placa de fundo em U para as placas de fundo plano. Agora, colete as células OC 4G IP e re-suspenda-as em meio M 15 fresco até nove vezes 10 à quarta potência de células por mililitro.Em seguida, utilize uma pipeta multicanal para adicionar 100 microlitros da suspensão celular a cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços, pipetando para cima e para baixo de três a cinco vezes para misturar a suspensão celular com o pré-Eloqua. Sir, complexos de lipídios, trocando as ponteiras para diferentes sir a transfect; em seguida, coloque as placas em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e cultive as células por quatro dias. Em cada dia de cultura, utilize um aspirador multicanal para remover o meio antigo, tomando cuidado para não arranhar as células no fundo das placas.Em seguida, utilize uma pipeta multicanal para alimentar as células com 100 microlitros de meio fresco para células ES quatro dias após a transfeção. Remova o meio utilizando um aspirador multicanal e lave as células uma vez com 100 microlitros de PBS. Em seguida, utilize uma pipeta multicanal para adicionar 25 microlitros de tripsina 0,25% a cada uma.Incube bem as células por cinco minutos à temperatura ambiente com agitação ocasional. Em seguida, inspecione visualmente a placa para garantir a completa dessanexação das células após a dessanexação. Adicione 90 microlitros de PBS com 10% de FBS para inativar a tripsina, pipete a solução celular para cima e para baixo várias vezes para dissociar as células em uma suspensão simples de células.Por fim, utilize o modo de alto rendimento na unidade HTS de um analisador de fax para analisar 10 microlitros da suspensão celular. Defina o limiar de contagem para 1,0 vezes 10 à quarta células e ajuste a voltagem do PMT para capturar as células no gráfico de dispersão frente versus dispersão lateral. Inicie o gate de análise para a população de células viáveis no gráfico de dispersão frente versus dispersão lateral e, em seguida, crie um gráfico de histograma para o canal GFP.Definir o gate no canal GFP de forma que cerca de 10% das células pareçam ser GFP negativas nas células transfectadas com SINA controle ou mock, a fim de determinar a porcentagem de células diferenciadas com base na porcentagem de células GFP negativas. Para cada tratamento, compare a porcentagem de células diferenciadas entre os grupos experimentais e os controles transfectados com irna.Esta primeira figura mostra que as células selvagens E 14 TG duas A, representadas pelo histograma preto, são negativas para GFP, enquanto as células T 4G IP, representadas pelo histograma verde, são positivas para GFP quando mantidas como células ES nestas próximas duas figuras. Os gráficos de dispersão frente versus dispersão lateral e os histogramas do canal GFP das células T 4G IP quatro dias após transfeção com siRNAs controle ou T quatro são mostrados nos gráficos de dispersão. Primeiramente, as células viáveis são selecionadas no gráfico de dispersão frente versus dispersão lateral, pois as células mortas e os detritos são negativos para GFP e apresentam fundo aumentado, conforme observado nos dados dos histogramas. Nas células transfectadas com irna controle, a grande maioria das células é positiva para GFP.Esses gráficos de barras mostram a porcentagem de células diferenciadas a partir de células controle nano OCT4 e SOX2, transfetadas com siRNA, e células OCT4G IP quatro dias após a transfeção. Em todos os casos, conforme esperado, as células transfetadas com siRNA foram determinadas como exibindo níveis mais elevados de diferenciação do que os controles. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada com uma hora de tempo de manipulação para cada placa de 96 poços.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o ensaio repórter GIP de Oxford para determinar rapidamente o papel do seu gene de interesse na manutenção do ESL de camundongo.

oct4gip-reporter-assay-to-study-genes-that-regulate-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo mostra o procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus induzível que expressam Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4.

Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

O Stemgent induzível Dox Mouse Set Lentivirus TF pode reprogramar fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) para pluripotentes induzidas da haste (iPS) células. Aqui demonstramos o protocolo para DOX induzível-expressão de fatores de reprogramação em ratos transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para gerar colônias iPS que expressam marcadores comuns MES pluripotência.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

SC1 funções através da inibição dual de Ras-GAP e ERK1. Testamos a função de SC1 no apoio célula do rato ES auto-renovação, na ausência de LIF e mostrou que SC1 é capaz de manter a auto-renovação de culturas de células de rato ES.

O uso de SC1 (Pluripotin) para Suporte MESC auto-renovação na ausência de LIF

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a atividade do ácido retinóico em embriões de camundongos. Ao isolar as células dos embriões de camundongo, as células são co-cultivadas com células repórteres de ácido retinóico (RA). As células embrionárias produzem AR, que induz a expressão de beta-galactosidase nas células repórteres, indicando atividade de AR nas células embrionárias.

Empregando células repórter em uma co-cultura para estudar a produção de ácido retinóico por células embrionárias de camundongos

Ensaio única expressão gênica de células é necessária para a compreensão da heterogeneidade de células-tronco.

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Neste estudo, geramos células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células de líquido amniótico de camundongo, usando um sistema de transposon baseado em não vírus.

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Aqui, apresentamos um protocolo quantitativo e escalável para realizar telas de moléculas pequenas direcionadas para os reguladores de cinase da transição pluripotente iniciada na primitiva.

Um método simples para identificar quinases que regulam a pluripotência de células estaminais embrionárias por meio de triagem de inibidores de alto rendimento

Descrevemos em detalhes dois protocolos de base química para cultivo de células-tronco embrionárias do mouse. Esse novo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidação mediada por Tet (vitamina C) e reprimindo a síntese de novo de 5-metilcitosina (por PD0325901) para manter o DNA hypomethylation e pluripotência das células-tronco embrionárias do mouse.

Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C

Este protocolo mede quantitativamente a estabilidade e a meia-vida de RNAs potenciadores intergênicos e intragênicos em células-tronco embrionárias de camundongo, utilizando tratamento com Actinomicina D, RT-qPCR e análise de regressão não linear. Estratégias de normalização específicas de posição são incorporadas para modelar com precisão a dinâmica do decaimento do eRNA de forma dependente do contexto.

Avaliação Quantitativa Otimizada da Estabilidade do RNA Potenciador em Células-Tronco Embrionárias de Camundongos

Este protocolo fornece um pipeline computacional simplificado para quantificar transcritos de intensificadores nascentes. Ao integrar a acessibilidade da cromatina, a característica da cromatina e os dados transcricionais, ele permite a detecção precisa e a análise específica da atividade do intensificador em regiões intragênicas complexas, mantendo-se acessível a pesquisadores sem treinamento extensivo em bioinformática.

Um pipeline computacional para quantificação de RNA intensificador intergênico/intragênico em células-tronco embrionárias de camundongo

Aprenda a usar o ensaio reporter Oct4GiP para estudar genes que regulam a manutenção e autorrenovação de células-tronco embrionárias de mouse. Este método permite avaliar rapidamente a função gênica.

Oct4GiP Ensaio Reporter para o Estudo de genes que regulam o mouse Manutenção células-tronco embrionárias e auto-renovação

Explorar mais vídeos