Visualização e análise do fluxo sangüíneo e consumo de oxigênio na microcirculação hepática: aplicação para um modelo Hepatite Aguda

Um sistema óptico foi desenvolvido para visualizar a microcirculação hepática com eritrócitos marcados com fluorescência e para medir a pressão parcial de oxigênio nos microvasos com imagem de fosfo por assistência a laser. Este método pode ser utilizado para investigar mecanismos fisiológicos e patológicos mediante a análise da estrutura microvascular, do diâmetro, da velocidade do fluxo sanguíneo e da tensão de oxigênio. Na microcirculação hepática, o sangue flui dos ES portais para os Es centrais, criando um gradiente de oxigênio entre os dois.

A concentração de oxigênio no fígado afeta tanto a expressão enzimática quanto a patologia, tornando a análise do fluxo sanguíneo e a medição de oxigênio temas importantes de pesquisa. Nosso método experimental envolve a administração intravenosa de hemácias marcadas com fluorescência.

Para visualizar a microcirculação utilizando fluorescência para a medição da pressão parcial de oxigênio, administramos por via intravenosa porfirina de paládio, que emite fosforescência na corrente sanguínea quando excitada por um laser, em grau dependente da concentração de oxigênio ao redor. Esse processo permite a análise quantitativa do oxigênio; a medição da pressão parcial de oxigênio na microcirculação hepática revelou valores de 59,8 e 38,9 milímetros de mercúrio nas veias porta e centrais, respectivamente, demonstrando a eficácia da medição da concentração de oxigênio. Em seguida, aplicamos esta metodologia a um modelo de hepatite.

Observamos uma pressão parcial de oxigênio elevada nos sinusoides ES portais e nos ES centrais, mas uma diferença de pressão reduzida entre os ES portais e centrais. Isso provavelmente se deve à diminuição do consumo de oxigênio na região venosa central em decorrência da necrose de hepatócitos. Esses resultados demonstram que nossa metodologia de utilizar um sistema óptico para medir a hemodinâmica hepática e o consumo de oxigênio é capaz de elucidar mecanismos de diversas doenças hepáticas na microcirculação hepática.

O gradiente de oxigênio é um parâmetro essencial envolvido na expressão de enzimas nas regiões periportais e paracentrais, bem como em tipos de doenças hepáticas relacionadas a distribuições microscópicas, portanto é importante quantificar o fluxo sanguíneo e o consumo de oxigênio. Para esclarecer os mecanismos, a vantagem do nosso método é que a medição óptica contínua e sem contato pode quantificar o fluxo sanguíneo, os diâmetros dos vasos sanguíneos e o gradiente de oxigênio na microcirculação hepática. O sangue total foi coletado de um camundongo doador e os eritrócitos foram lavados duas vezes com PBS por centrifugação a 400 G durante cinco minutos.

Em seguida, dissolva dois miligramas de FITC em um mililitro de fosfato de sódio monobásico DI 100 milimolar, antes de filtrar através de uma membrana com poros de 0,2 mícrons. Em seguida, coloque uma solução de um mililitro de FITC em um tubo de ensaio junto com 0,15 mililitro de solução de dextrano 3 milimolar, 0,25 mililitro de fosfato de sódio monobásico DI 180 milimolar e 1,5 mililitro de fosfato de sódio monobásico DI 100 milimolar, e agite levemente para misturar. Mantenha em temperatura ambiente por duas horas antes de lavar as hemácias marcadas duas vezes com PBS.

Em seguida, coloque uma pequena quantidade de suspensão de hemácias em uma lâmina de vidro e confirme tanto a aparência normal das hemácias quanto a fluorescência suficiente. Suspenda 0,1 mililitro de hemácias em 0,9 mililitro de PBS e mantenha a 4 graus Celsius até o uso. Em seguida, dissolva 500 miligramas de BSA em 10 mililitros de PBS. Então, adicione 30 miligramas de porfirina de paládio e agite durante a noite. Centrifugue a solução para remover qualquer porfirina de paládio não dissolvida e filtre o sobrenadante através de uma membrana com poros de 0,2 mícrons. Aliquote 1 mililitro do filtrado em tubos de ensaio e armazene a menos 20 graus Celsius. Tenha cuidado para evitar congelamentos e descongelamentos repetidos.

Para visualizar microscopicamente a microcirculação, corte um orifício de 20 milímetros de diâmetro em uma placa de plástico e cubra o orifício com uma lamínula quadrada de 30 milímetros de lado. Estenda o lobo hepático principal sobre uma placa de plástico em posição prona após canular uma veia da cauda. Em seguida, use várias tiras de filme plástico de alimentação com dimensões de três milímetros por oito milímetros para cobrir a área ao redor do lobo, evitando movimentos provocados pela respiração e a dessecação.

Visualize a circulação hepática com um microscópio de transmissão e confirme que não há estase do fluxo sanguíneo no campo de visão por pelo menos 15 minutos. Para observar o fluxo sanguíneo, injete gradualmente zero vírgula dois mililitros de hemácias marcadas com fluorescência.

Para medir a pressão parcial de oxigênio, injete 0,2 mililitros de solução de porfirina de paládio. Os eritrócitos marcados com FITC representarão um quinquagésimo de todos os eritrócitos em circulação na região visualizada; excite o FITC irradiando-o com uma lâmpada de mercúrio passada por um filtro de passagem de banda de 450 a 490 nanômetros e registre a fluorescência com uma câmera CCD. A fosforescência da porfirina de paládio é relativamente fraca e exige um detector de alta sensibilidade e um ambiente escurecido.

Os picos de absorção da porfirina de paládio estão em torno de 410 e 532 nanômetros, sendo recomendado o comprimento de onda do segundo harmônico de 532 nanômetros. Esse comprimento de onda é produzido por um laser de pulso de neodímio YAG; conecte o feixe laser a um microscópio invertido e ajuste-o de modo que o feixe ilumine o centro do plano focal. A resolução espacial do laser depende do tamanho do ponto, que pode ser ajustado fazendo o feixe passar por um orifício estreito.

Acople um filtro de passagem longa e um tubo fotomultiplicador ao microscópio para detectar a fosforescência. O PMT deve ser sensível a comprimentos de onda vermelhos, especialmente em torno de 700 nanômetros. Amostre o sinal fosforescente e calcule a constante de tempo de decaimento aplicando uma função exponencial.

Neste experimento, amostramos 500 pontos a 200 quilohertz. Para calibrar, prepare duas soluções de porfirina de paládio com uma pressão parcial de oxigênio de 150 e zero milímetros de mercúrio, respectivamente. Para a solução com zero milímetros de mercúrio, adicione 1% de dihi sódio às amostras para criar a condição em que o oxigênio está ausente durante a calibração.

Mantenha um pH da amostra de 7,4 e uma temperatura de 37 graus Celsius. Posicione o camundongo sobre a platina do microscópio e ajuste os microvasos para os quais deseja visualizar a microcirculação hepática ao ponto do feixe laser. Camundongos com livre acesso à água durante a noite, injete acetaminofeno a 200 miligramas por quilograma por via intraperitoneal. Após 24 horas da injeção, anestesie o camundongo e exponha o fígado com uma incisão mediana. Se houver hepatite, será facilmente visível a olho nu por meio da necrose na região paracentral.

Nossa medição da pressão parcial de oxigênio e dos microvasos hepáticos em camundongos mostrou pressões médias de oxigênio para os espaços portais, solos sinusoidais e veias centrais de 59,8, 48,2 e 38,9 milímetros de mercúrio, respectivamente. Em outras palavras, o gradiente de oxigênio do espaço portal até o espaço central indica liberação suficiente de oxigênio das hemácias à medida que passam pelos sinusoides. Preparamos camundongos com hepatite induzida por acetaminofeno para medir os microvasos hepáticos.

Como um modelo de patologia, descobrimos que as pressões parciais de oxigênio nas veias porta, sinusoides e veias centrais eram maiores no grupo com acetaminofeno em comparação com camundongos normais. A diferença de pressão parcial de oxigênio entre as veias porta e centrais foi de 20,9 milímetros de mercúrio para camundongos normais e de 16,9 milímetros de mercúrio para camundongos com modelo de hepatite. A diferença de pressão parcial de oxigênio entre as veias porta e centrais foi de 20,9 milímetros de mercúrio para camundongos normais e de 16,9 milímetros de mercúrio para camundongos com modelo de hepatite.

O gradiente de oxigênio na microcirculação hepática surge principalmente devido ao fornecimento de oxigênio pela veia porta que é consumido pelos hepatócitos; a necrose de hepatócitos na área venal central causada pelo acetaminofeno resulta em diminuição do consumo de oxigênio, na microcirculação a jusante e, portanto, em problemas relacionados à hemodinâmica. O fornecimento e o consumo de oxigênio estão envolvidos em muitas formas de doenças hepáticas. Criamos um modelo de hepatite aguda e observamos aumento da tensão de oxigênio nos microvasos.

Nosso sistema óptico pode ser utilizado para investigar mecanismos fisiológicos e patológicos mediante a análise da estrutura microvascular, da distribuição do fluxo e do consumo de oxigênio.