Name: Visualização e análise do fluxo sangüíneo e consumo de oxigênio na microcirculação hepática: aplicação para um modelo Hepatite Aguda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda a visualizar a microcirculação hepática e medir a pressão parcial de oxigênio em microvasos usando eritrócitos marcados com fluorescência e fosforimetria a laser. Este método permite investigar mecanismos fisiológicos e patológicos do fígado.

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Os autores agradecem a Sra. Risa Otsuka de assistência técnica e experiências de ajuda. Esta pesquisa foi parcialmente financiada pelo Ministério da Educação, Ciência, Esportes e Cultura, Grant-in-Aid para Jovens Cientistas (B), 2010, 22700476, e Memorial Foundation Suzuken 2010 para KT E esse estudo foi suportado por Pesquisa e Desenvolvimento de Simulação da Próxima Geração Integrada da matéria viva, uma parte do Desenvolvimento e Uso do Projeto de próxima geração de supercomputadores do MEXT, e em parte por JST ERATO Projeto Biologia Gás Suematsu.

1. Marcando eritrócitos com isotiocianato de fluoresceína Isómero I (FITC) Todos os protocolos experimentais nós utilizados foram aprovados pelo comitê de ética da Keio University School of Medicine. <ol><li> Anestesiar uma ratinhos dadores, e depois de fazer uma incisão celiotomia retirar sangue total a partir da veia cava inferior com uma seringa de 1 ml contendo pequena quantidade de heparina. O rato foi imediatamente sacrificados por injecção de pentobarbital sódico (100 mg / kg ip). </li><li> Lava-se a sangue total duas vezes com PBS (pH 7,4) por centrifugação durante 5 min a 400 g num rotor de balanço-balde. </li><li> Dissolve-se 10 mg de FITC em 5 ml de 100 mM de Na 2 HPO 4 e filtrá-lo com uma membrana com 0,22-iM poros. </li><li> Num tubo de ensaio misturar 1 ml da solução de FITC com 0,15 ml de 3 mM de glucose, 0,25 ml de 180 mM NaH 2 ml PO 4, e 1,5 de 100 mM de Na 2 HPO 4. Adicionar 0,2 ml de RBC pellet, e toque o tubo para misturar. </li><li> Manter o tubo durante 2 horas a 4 ° C e, em seguida lavar os RBCs duas vezes em PBS coradas. </li><li> Coloque uma pequena quantidade da suspensão de RBC em uma grama corrediça e ver se as RBCs aparência saudável (isto é, que a sua forma e tamanho são normal) e que a intensidade de fluorescência é suficiente. </li><li> Suspender o 0,1 ml de glóbulos vermelhos em 0,9 ml de PBS a pH 7,4, e manter a suspensão a 4 ° C até injecção. </li></ol> 2. Preparação de oxigênio-sensível Dye <ol><li> Dissolve-se 500 mg de BSA em 10 ml de PBS a pH 7,4. </li><li> Adicionar 30 mg de Pd (II)-meso-tetra (4-carboxifenil) porphine (Pd-TCPP) à solução de BSA e agitou-se durante a noite. </li><li> (Opcional) Extrair BSA-bound Pd-TCPP usando cromatografia de fluxo por gravidade ou uma coluna de spin para o separar livre Pd-TCPP. </li><li> Centrifugar a solução para remover não dissolvido Pd-TCPP, e filtrar o sobrenadante com um filtro de membrana com 0,22-iM poros. &lt;/ Li&gt; <li> Loja de 1 ml em tubos de alíquotas a -20 ° C. Evite a repetição de ciclos de congelamento e descongelamento. </li></ol> 3. Preparação dos animais <ol><li> Para a observação microscópica da microcirculação preparar uma placa de plástico com um furo 20 milímetros de diâmetro, e uma fita de 30 mm de quadrado de vidro de cobertura sobre o furo quadrado. </li><li> Anestesiar um mouse, retire a pele e preparar a pele. Coloque um cateter na cauda vão para injecção de drogas usando uma agulha 30 G ligada a um polietileno de 10-cm (PE 10) do cateter preenchido com heparinizado PBS. </li><li> Após a incisão mediana, estender um lóbulo principal do fígado na chapa de plástico, e coloque o mouse em decúbito esternal. </li><li> Preparar pequenas tiras com o envoltório de cozinha (3 mm x 8 mm) e azulejo-los em torno da borda do lobo hepático para inibir a mover-se do fígado com a respiração e mantendo-o a partir de secagem. </li><li> Observe a microcirculação hepática sob um microscópio (com luz transmitida), e confirmar que o bfluxo Lood não tem nenhuma estase no campo de visão, pelo menos, 15 min. </li><li> Lentamente injetar 0,2 ml de hemácias fluorescente etiquetado para a observação do fluxo de sangue ou 0,2 ml de Pd-TCPP solução para medição de pO 2. Esta quantidade de glóbulos vermelhos marcados com FITC serão responsáveis ​​por 1/50 de todos os RBCs em circulação na região visualizada. </li></ol> 4. Visualização do Fluxo de Sangue <ol><li> Excitar o FITC por irradiação com luz da lâmpada de mercúrio que passou através de um filtro passa-banda (450-490 nm) 1. </li><li> Gravar a imagem fluorescente com uma câmara CCD. </li></ol> 5. pO Medição 2 Pd-TCPP fosforescência é relativamente fraca e deve ser detectado com um detector de alta sensibilidade. Todas as experiências precisam de ser realizado numa sala escura. <ol><li> Os picos de absorção de Pd-TCPP são a 410 nm e 532 nm, de modo que o segundo-harmónica comprimento de onda de 532 nm é recomendado para a excitação. Este comprimento de onda pode ser gerado por um Nd: YAG pulso de laser 2. </li><li> Alimentar o feixe do laser Nd: YAG na porta apropriada no microscópio invertido, e ajustar o ponto de feixe para uma posição central no plano focal. A resolução espacial depende do tamanho do ponto de laser, que é alterado pela passagem do feixe através de um furo de pino. </li><li> Para detectar a fosforescência, anexar um filtro de longo-pass (&gt; 620 nm) e um tubo fotomultiplicador (PMT) para a outra porta do microscópio. O PMT deve ser sensível aos comprimentos de onda vermelhos, especialmente em torno de 700 nm. </li><li> Amostrar o sinal de fosforescência (500 pontos amostrados a 200 kHz) e calcular a constante de tempo de decaimento, encaixando uma função exponencial para a decomposição. </li><li> Para a calibração preparar dois conjuntos de amostras de Pd-TCPP solução com pO 2 150 mmHg e 0 mmHg. Adicionar ditionito de sódio 1% em volume de amostra para produzir ausência de oxigénio. Manter o pH das amostras a 7,4 ea temperaturatura a 37 ° C durante a calibragem. </li><li> Fixar o Stern-Volmer tempo de decaimento constante k q e livre de oxigénio luminescência τ 0 na equação (1) 3. No nosso caso, com Pd-TCPP soluções a 37 ° C e um pH de 7,4, k q é 374 mmHg -1 s -1 e 0 é τ 0,74 ms. Estes parâmetros de medição dependem do equipamento (isto é, a laser, detector, outros dispositivos ópticos) e do método de processamento de sinal, de modo a calibração é necessário em cada sistema de medição 4. τ 0 / τ = ​​1 + k q • τ 0 • pO 2 (1) </li><li> Definir o rato sobre a placa sobre a platina do microscópio, observar a microcirculação hepática, e ajustar a posição do alvo de microvasos até ao ponto de o ponto de laser. </li></ol> 6. Modelo de Hepatite <ol><li> Camundongos rápidos com livre acesso à água durante a noite. </li><li> Prepara-se uma20 mg por ml de solução de acetaminofeno (APAP) em DMSO. </li><li> Injectá-la por via intraperitoneal em 1 ml/100 g de peso corporal (ie, 200 mg / kg de peso corporal). Após a injecção, o rato pode ser dado livre acesso a comida e água 5. </li><li> 24 horas após a injecção, anestesiar o rato e expor o fígado através de uma incisão mediana. Se a hepatite é conseguido, necrose na região pericentral será facilmente visível a olho nu. </li></ol> 7. Os resultados representativos Exemplo, imagens de microcirculação hepática são mostrados na Figura 1, onde (a) é uma imagem de luz de transmissão e (b) é uma imagem de fluorescência. Individuais eritrócitos marcado com FITC são observados no filme de vídeo, e vénulas de portal, sinusóides, e vénulas centrais são reconhecidos por direcções de fluxo de sangue. Como mostrado na Figura 2, o ponto de laser irradiação de um vénula central, através de uma lente objectiva x100 foi aproximdiatamente 10 um de diâmetro. Intravascular pO 2 na microcirculação hepática foi medida em ratinhos C57BL macho / 6 ratinhos, e Figura 3 (a) mostra as relações entre pO 2 e diâmetro do vaso em vénulas de portal e central. A pO 2 gradiente de portal para vênulas centrais indica que liberam oxigênio hemácias de forma eficiente ao passar sinusóides. Como mostrado na Figura 3 (b), a média pO 2 foi de 59,8 mmHg em vasos de portal, 48,2 mmHg em sinusóides, e 38,9 mmHg em vénulas centrais. Quando produzido hepatite aguda, injetando APAP via intraperitoneal, intravascular pO 2 foi significativamente elevado em cada parte da microcirculação hepática: p &lt;0,05 na veia porta, e p &lt;0,01 em sinusóides e veias centrais (Figura 3 (c)). <img src="/files/ftp_upload/3996/3996fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Baixa ampliação-images mostrando microcirculação hepática com (a) a luz transmitida e (b) de fluorescência. <img src="/files/ftp_upload/3996/3996fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Imagem do ponto de laser irradiando uma vênula alvo central para medição pO 2. <img src="/files/ftp_upload/3996/3996fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. PO 2 gradiente na microcirculação hepática de camundongos sadios e de camundongos com acetaminofeno-induzida lesão hepática. (A) mostra pO 2 versus diâmetro do vaso para o portal vénulas (PV) e vénulas central (CV), e (b) mostra o gradiente de oxigénio a partir de PV para CV através sinusóides (S). A pO 2 diferença entre PV e CV reflete o consumo de oxigênio de hepatócitos ou outras células do parênquima. (C) mostra que, em condições de hepatite induzida por APAP administração, pO 2 foi significativamente elevados em PV, S, e CV e pO 2gradiente diminuiu, indicando que o consumo de oxigênio hepático foi comprometida.

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

Fornecimento de oxigênio aos tecidos é um papel essencial da microcirculação, e um monte de papéis descrever doenças relacionadas à anatomia microvascular e reologia 6. O fluxo de sangue hepático é uma combinação de sangue arterial e venoso. Cerca de 30% do fluxo sanguíneo para o fígado é bem oxigenado sangue fornecido pela artéria hepática e os outros 70%, fornecido pela veia portal, é o fluxo venoso mal o sangue oxigenado a partir do baço e do tracto gastrointestinal 7. Doenças do fígado, como es...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Pd (II) meso-Tetra (4-carboxifenil) porphine </td><td> Frontier Scientific, Inc. </td><td> PdT790 </td></tr><tr><td> Isotiocianato de fluoresceína isómero I </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> F7250 </td></tr><tr><td> Acetaminophen </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> A7085 </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> tubo fotomultiplicador </td><td> Hamamatsu Photonics KK </td><td> H10722-20 </td></tr></tbody></table>

visualização e análise do fluxo sangüíneo e consumo de oxigênio na microcirculação hepática: aplicação para um modelo hepatite aguda

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Há uma grande discrepância entre a oferta ea demanda de oxigênio no fígado, porque o consumo de oxigênio hepático é relativamente elevada, mas cerca de 70% do suprimento sanguíneo hepático é pouco sangue oxigenado da veia porta derivado do trato gastrointestinal e do baço. O oxigénio é entregue a hepatócitos de sangue que flui a partir de um ramo terminal da veia porta a uma vênula central através sinusóides, e isto faz um gradiente de oxigénio em lóbulos hepáticos. O gradiente de oxigénio é um parâmetro importante física que envolve a expressão de enzimas a montante ea jusante, na microcirculação hepática, mas a falta de técnicas de medição de consumo de oxigénio na microcirculação hepática atrasou a elucidação dos mecanismos relacionados com o metabolismo de oxigénio no fígado. Por conseguinte, utilizado marcado com FITC eritrócitos para visualizar a microcirculação hepática e utilizado laser assistida phosphorimetry para medir a pressão parcial de oxigénio no microvasos aí. Noncontact e medição óptico contínuo pode quantificar velocidades de fluxo de sangue, diâmetros dos vasos e gradientes de oxigênio relacionadas com o consumo de oxigênio no fígado. Em um modelo de hepatite aguda que fizemos através da administração de paracetamol para ratos, observamos pressão de oxigênio aumentou em ambos os vênulas portal e central, mas um gradiente de diminuição de oxigênio nos sinusóides, indicando que a necrose dos hepatócitos na zona pericentral poderia mudar a pressão de oxigênio e afetar a expressão da enzima na zona periportal. Em conclusão, os nossos métodos ópticos para hemodinâmica hepáticas de medição e consumo de oxigênio pode revelar mecanismos relacionados à doença hepática.

Um sistema óptico foi desenvolvido para visualizar a microcirculação hepática com eritrócitos marcados com FITC e para medir a pressão parcial de oxigénio no microvasos com laser assistida phosphorimetry. Este método pode ser usado para investigar os mecanismos fisiológicos e patológicos, analisando a estrutura microvascular, o diâmetro, a velocidade de fluxo de sangue, e tensão de oxigénio.

Visualização e análise do fluxo sangüíneo e consumo de oxigênio na microcirculação hepática: aplicação para um modelo Hepatite Aguda

Existe uma discrepância considerável entre a oferta e a demanda de oxigênio no fígado, pois o consumo hepático de oxigênio é relativamente alto, mas cerca de 70% de ...

Um sistema óptico foi desenvolvido para visualizar a microcirculação hepática com eritrócitos marcados com fluorescência e para medir a pressão parcial de oxigênio nos microvasos com imagem de fosfo por assistência a laser. Este método pode ser utilizado para investigar mecanismos fisiológicos e patológicos mediante a análise da estrutura microvascular, do diâmetro, da velocidade do fluxo sanguíneo e da tensão de oxigênio. Na microcirculação hepática, o sangue flui dos ES portais para os Es centrais, criando um gradiente de oxigênio entre os dois.A concentração de oxigênio no fígado afeta tanto a expressão enzimática quanto a patologia, tornando a análise do fluxo sanguíneo e a medição de oxigênio temas importantes de pesquisa. Nosso método experimental envolve a administração intravenosa de hemácias marcadas com fluorescência.Para visualizar a microcirculação utilizando fluorescência para a medição da pressão parcial de oxigênio, administramos por via intravenosa porfirina de paládio, que emite fosforescência na corrente sanguínea quando excitada por um laser, em grau dependente da concentração de oxigênio ao redor. Esse processo permite a análise quantitativa do oxigênio; a mediç

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