Visualização e análise do fluxo sangüíneo e consumo de oxigênio na microcirculação hepática: aplicação para um modelo Hepatite Aguda

Um sistema óptico foi desenvolvido para visualizar a microcirculação hepática com eritrócitos marcados com fluorescência e medir a pressão parcial de oxigênio nos microvasos com imagens de fosfoterapia assistida por laser. Este método pode ser usado para investigar mecanismos fisiológicos e patológicos, analisando a estrutura microvascular, diâmetro, fluxo sanguíneo, velocidade e tensão de oxigênio. Na microcirculação hepática, o sangue flui do ES portal para o Es central, criando um gradiente de oxigênio entre os dois.

A concentração de oxigênio no fígado afeta tanto a expressão enzimática quanto a patologia, fazendo análise do fluxo sanguíneo e medição de oxigênio. Tópicos importantes de pesquisa. Nosso método experimental envolve a administração intravenosa de glóbulos vermelhos marcados com fluorescente.

Para visualizar a microcirculação usando fluorescência para medição da pressão parcial de oxigênio, administramos porfirina de paládio por via intravenosa, que emite fosforescente na corrente sanguínea quando excitada por um laser em um grau dependente da concentração de oxigênio circundante. Este processo permite a análise quantitativa do oxigênio, a pressão parcial medindo a microcirculação hepática mostrou a pressão parcial de oxigênio portal e venal central de 59,8 e 38,9 milímetros de mercúrio, respectivamente, demonstrando a medição efetiva da concentração de oxigênio. Em seguida, aplicamos essa metodologia a um modelo de hepatite.

Encontramos pressão parcial de oxigênio elevada no ES portal senoidal e central, mas um diferencial de pressão diminuído entre o es portal e central. Isso provavelmente se deve à diminuição do consumo de oxigênio na área central do Ven devido à necrose de hepatócitos. Esses resultados mostram que nossa metodologia de uso de um sistema óptico para medir a hemodinâmica hepática e o consumo de oxigênio é capaz de elucidar mecanismos de várias doenças hepáticas na microcirculação hepática.

O gradiente de oxigênio é um parâmetro essencial que envolve a expressão de enzimas nas regiões periportal e paracentral, tipos de doenças hepáticas relacionadas a microdistribuições, por isso é importante quantificar o fluxo sanguíneo e o consumo de oxigênio. Para esclarecer os mecanismos, a vantagem do nosso método é que a medição óptica contínua e sem contato pode quantificar o fluxo sanguíneo, os diâmetros dos vasos blóticos e o gradiente de oxigênio na microcirculação hepática. O sangue total foi retirado de um camundongo doador e os eritrócitos foram lavados duas vezes com PBS por centrifugação a 400 G por cinco minutos.

Em seguida, dissolva dois miligramas de FITC em um mililitro, 100 milimolar de hidrogenofosfato de sódio DI antes de filtrar através de uma membrana de poros de 0,2 mícron. Em seguida, coloque uma solução FITC de um mililitro em um tubo de ensaio junto com uma solução hábil de três milimolares de 0,15 mililitro, um hidrogenofosfato de sódio DI de 0,25 mililitro 180 milimolares e um hidrogenofosfato de sódio DI de 1,5 mililitro de 100 milimolares e bata para misturar. Mantenha-o em temperatura ambiente por duas horas antes de lavar as hemácias manchadas duas vezes com PBS.

Em seguida, coloque uma pequena quantidade de suspensão de hemácias em uma lâmina de vidro e confirme a aparência normal das hemácias e a fluorescência suficiente suspenda 0,1 mililitro de hemácias em 0,9 mililitro de PBS e mantenha-o quatro graus Celsius até o uso em seguida, dissolva 500 miligramas de BSA em 10 mililitros de PBS. Em seguida, adicione 30 miligramas de porfirina de paládio e agite a centrífuga durante a noite, a solução para remover qualquer porfirina de paládio não resolvida e filtre o SUP natin através de uma membrana po de 0,2 mícron eloqüente, um mililitro de filtrado em tubos de ensaio e armazene a menos 20 graus Celsius. Cuidado para evitar congelamento e descongelamento repetidos.

Para visualizar a microcirculação microscopicamente, corte um orifício de 20 milímetros de diâmetro em uma placa de plástico e cubra o orifício com uma tampa de vidro quadrada de 30 milímetros de lado. Espalhe o lobo hepático principal em uma placa de plástico em decúbito ventral após a canulação de uma veia da cauda. Em seguida, use várias seções de três milímetros por oito milímetros de filme plástico para cobrir a área ao redor do lóbulo para evitar o movimento da respiração e da secagem.

Visualize a circulação hepática com um microscópio de transmissão e confirme se não há estase do fluxo sanguíneo no campo de visão por pelo menos 15 minutos. Para observar o fluxo sanguíneo injetar gradualmente. Aponte dois mililitros de hemácias marcadas com fluorescência.

Para medir a pressão parcial de oxigênio, injete 0,2 mililitros de solução de paládio porfirina. As hemácias marcadas com FITC serão responsáveis por um 50º de todas as hemácias em circulação na região visualizada, excitarão o FITC irradiando-o com uma lâmpada de mercúrio passada por um filtro passa-banda de 450 a 490 nanômetros e registrarão a fluorescência com uma câmera CCD. A fosforescência da porfirina de paládio é relativamente fraca e requer um detector de alta sensibilidade e uma sala escura.

Os picos de absorção de porfirina de paládio são de cerca de 410 e 532 nanômetros, e o comprimento de onda do segundo harmônico de 532 nanômetros é recomendado. Este comprimento de onda é produzido por um laser de pulso YAG de neodímio, conecta o feixe de laser a um microscópio invertido e se ajusta de forma que o feixe ilumine o centro do plano focal. A resolução espacial do laser depende do tamanho do ponto, que pode ser ajustado passando o feixe por um orifício.

Conecte um filtro de passagem longa e um tubo fotomultiplicador ao microscópio também para detectar a fosforescência. O PMT deve ser sensível a comprimentos de onda vermelhos, especialmente em torno de 700 nanômetros. Amostra do sinal fosforescente e calcule a constante de tempo de decaimento aplicando uma função exponencial.

Neste experimento, amostramos 500 pontos a 200 kilohertz. Para calibrar, prepare duas soluções de paládio porfirina com uma pressão parcial de oxigênio de 150 e zero milímetros de mercúrio cada. Para a solução de zero milímetros de mercúrio, adicione 1% de dihi de sódio às amostras para criar a condição em que o oxigênio está ausente durante a calibração.

Mantenha um pH de amostra de 7,4 e uma temperatura de 37 graus Celsius. Posicione o mouse no estágio do microscópio e ajuste os microvasos para os quais você deseja visualizar a microcirculação hepática até o ponto do laser rápido camundongos com acesso livre à água durante a noite, injete paracetamol a 200 miligramas por quilograma intraperitoneal 24 horas após a injeção, anestesie o camundongo e exponha o fígado com uma incisão mediana. Se houver hepatite, ela será facilmente visível a olho nu através da necrose na região paracentral.

Nossa medição da pressão parcial de oxigênio e microvasos hepáticos em camundongos mostrou pressões médias de oxigênio para es portais, solos sinusais e vees centrais de 59,8, 48,2 e 38,9 milímetros de mercúrio, respectivamente. Em outras palavras, o gradiente de oxigênio do ES portal para o central indica liberação suficiente de oxigênio das hemácias à medida que passam pelos sinusóides. Preparamos camundongos com hepatite induzida por paracetamol para medir microvasos hepáticos.

Como exemplo de modelo de patologia, descobrimos que as pressões parciais de oxigênio nas veias portais, sinusoidal e central Es foram maiores no grupo paracetamol em comparação com camundongos normais. O diferencial de pressão parcial de oxigênio entre os vees portal e central foi de 20,9 milímetros de mercúrio para camundongos normais e 16,9 milímetros de mercúrio para camundongos modelo de hepatite. O diferencial de pressão parcial de oxigênio entre os vees portal e central foi de 20,9 milímetros de mercúrio para camundongos normais e 16,9 milímetros de mercúrio para camundongos modelo de hepatite.

O gradiente de oxigênio na microcirculação hepática surge principalmente devido ao suprimento de oxigênio do veno portal que é consumido pelos hepatócitos, a necrose de hepatócitos na área venal central causada pelo paracetamol resulta em diminuição do consumo de oxigênio, microcirculação a jusante e, portanto, problemas relacionados à hemodinâmica. O suprimento e o consumo de oxigênio estão envolvidos em muitas formas de doença hepática. Fizemos um modelo de hepatite aguda e encontramos aumento da tensão de oxigênio nos microvasos.

Nosso sistema óptico pode ser usado para investigar mecanismos fisiológicos e patológicos analisando a estrutura microvascular, bem como a distribuição de fluxo e o consumo de oxigênio.