O α-teste: Rapid livre de células CD4 enumeração Utilizando saliva total

Existe uma necessidade urgente de uma enumeração acessível de CD4 para monitorar a doença pelo HIV em regiões com recursos limitados. Este vídeo demonstra um teste de triagem de baixo custo e de atendimento imediato, no qual as contagens de CD4 são determinadas com base na presença do inibidor de proteinase Alfa um PI na saliva. Para isso, primeiramente é fornecido ao sujeito ou paciente um pastilha de limão para estimular a exsudação de fluido seroso para dentro da saliva.

A saliva é coletada em um copo de amostra e transferida para uma placa de ensaio de 96 poços. Em seguida, adiciona-se uma quantidade saturante da proteinase elastase pancreática suína à saliva, onde ela se liga e inibe a alfa um pi. Depois, adiciona-se o substrato cromogênico para elastase.

Toda elastase remanescente não ligada cliva o substrato, resultando em uma mudança de cor de incolor para amarelo. Adiciona-se o azul Kumasi aos poços para corar a proteína total e são realizadas medições colorimétricas utilizando um leitor de microplacas. Por fim, determina-se a razão entre a inibidora de alfa-1 protease e a proteína total, que é utilizada para avaliar com precisão as contagens de CD4 com base em um valor de índice.

Existem diversas vantagens dessa técnica em comparação com o método existente, que é a citometria de fluxo. O ensaio pode ser realizado em campo sem a necessidade de coletar sangue, o que é traumático e caro, sem o uso de anticorpos monoclonais, que são onerosos, sem exigir formação técnica e sem a necessidade de refrigeração ou transporte de amostras. Este método supera uma barreira crítica para a intervenção na AIDS e deverá ter um impacto significativo no custo e nos desfechos de saúde dos pacientes, bem como na frequência da transmissão do HIV, todos eles com grande impacto sobre a economia global.

Este método pode fornecer informações sobre como o Alpha e o PI regulam o número de células T CD4 por meio da aderência e migração, mas também pode ser aplicado a outros sistemas, como a forma como outros inibidores proteicos regulam a aderência e a migração celular de outros tipos celulares. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando descobrimos que o Alpha 1-PI estava tão baixo em pacientes com HIV que, na verdade, limita a quantidade de células T CD4 que chegam ao sangue. Inicie este protocolo preparando as soluções de trabalho necessárias para cada microplaca que será utilizada.

Prepare 60 mililitros de tris 0,05 molar, salina tamponada ou TBS, em um pH de 7,8. Além disso, para cada microplaca, prepare seis mililitros de elastase pancreática suína tipo um ou PPE. Agite bem a suspensão de PPE e, em seguida, dilua-a em TBS até uma concentração de aproximadamente 0,01 unidade por mililitro.

Em seguida, prepare uma solução estoque 0,1 molar do substrato colorimétrico SA three NA em DMSO. Esta solução estoque deve ser usada imediatamente ou armazenada a menos 20 graus Celsius, caso seja usada imediatamente. Prepare seis mililitros de uma solução de trabalho para cada microplaca, diluindo-a na proporção de um para 100 em TBS. Por fim, prepare uma solução estoque de 10% de kumasi blue brilhante R two 50 em TBS e use-a imediatamente ou armazene-a a menos 20 graus Celsius, se for usada imediatamente.

Prepare seis mililitros para cada microplaca diluindo o estoque um em 1000 em TBS. Ao manipular saliva, é importante tomar precauções apropriadas, como usar luvas e jaleco de laboratório, com o sujeito de pesquisa ou paciente na posição ereta. Coloque um SGO na boca para estimular a exsudação sérica.

O papel do paciente com HIV nesta demonstração está sendo desempenhado por um assistente de pesquisa. Um bala de limão sem açúcar é conveniente para pacientes com HIV tipo 1, que frequentemente são edêntulos e incapazes de mastigar chiclete, engolindo conforme necessário durante os primeiros três minutos e coletando saliva da boca inteira em um copo de amostra durante os próximos três minutos. Isso fornecerá aproximadamente dois mililitros de saliva.

Se a saliva não for usada imediatamente, armazene-a a menos 80 graus Celsius no dia do processamento e incube o espécime a 37 graus Celsius. Após descongelamento, a saliva pode ser armazenada entre 2 e 4 graus Celsius por até três dias. Cada amostra e controle será plaqueada em tríplica em uma placa de fundo plano de 96 poços para montar o ensaio com 130 microlitros de TBS em cada poço de amostra e poço controle.

Em seguida, evite o muco, que é viscoso e não contém exsudato sérico. Transfira 20 microlitros de saliva para cada um dos três poços de teste e três poços de controle negativo. Em seguida, adicione 20 microlitros de TBS aos poços de controle positivo, misturando com pipetagem.

Nesta etapa, é importante evitar o vortex e a formação de bolhas ao pipetar a saliva, além de evitar pipetar partículas sólidas e muco. Em seguida, agite bem a solução de trabalho da elastase pancreática (PO sign) ou PPE para homogeneizá-la, e então adicione 50 microlitros à amostra, aos poços do controle positivo e aos poços do controle negativo.

Adicione 50 microlitros de TBS. Não é necessário misturar, pois o volume adicionado é suficientemente grande para permitir uma distribuição uniforme na mistura de saliva. Incube a placa por 10 minutos em temperatura ambiente.

Após a incubação, adicione 50 microlitros da solução de trabalho do substrato de elastase SA três NA a cada poço. Em seguida, incube por mais 45 minutos a 23 graus Celsius. Após decorridos 45 minutos, adicione 50 microlitros da solução de trabalho de Kumasi blue a cada poço.

Em seguida, leia a absorbância em um leitor de microplacas a 405 nanômetros para detectar a clivagem de SA três NA e a 595 nanômetros para detectar o azul de kumasi, que representa o teor total de proteína. Para calcular o índice alfa um PI, primeiramente, utilize a seguinte fórmula para obter a absorbância normalizada para cada comprimento de onda, dividindo a diferença entre a média da amostra e a média do controle negativo pela diferença entre a média do controle positivo e a média do controle negativo. Em seguida, para obter o índice alfa um PI, divida a absorbância normalizada a 405 nanômetros pela absorbância normalizada a 595 nanômetros, conforme mostrado aqui, a fim de determinar se o teste alfa pode ser adequado para uso como teste de triagem na assistência imediata para monitorar as contagens de CD4 em regiões endêmicas com recursos limitados.

A saliva estimulada foi coletada de 20 mulheres e 11 homens com HIV tipo 1 que frequentavam uma clínica para atendimento de rotina em Camarões. De acordo com observações preliminares durante o desenvolvimento do teste alfa, utilizando saliva coletada na cidade de Nova York, o índice alfa 1 PI e a saliva coletada em Camarões correlacionaram-se com as contagens de CD4 com um valor de R quadrado de 0,91 e um valor de P inferior a 0,0001. A relação foi definida por uma curva sigmoide de três parâmetros, o que é consistente com a relação dose-resposta. Os intervalos de confiança de 95% e os intervalos de predição são representados por linhas azuis e vermelhas, respectivamente.

Em um estudo anterior, determinamos que as células T CD4 positivas exibem ciclagem sinusoidal com periodicidade de 23 ± 3,5 dias em indivíduos com HIV-1 e em indivíduos com a versão herdada da deficiência de alfa-1-PI, PIZZ, representada aqui. Abaixo, há um exemplo representativo da análise computadorizada da curva de seno da ciclagem de CD4 em um controle saudável não infectado pelo HIV, exibindo periodicidade de 27 dias. A análise computadorizada da curva de seno das alterações nas células T CD4 positivas em seis indivíduos forneceu valores para a amplitude pico-a-pico e o eixo de oscilação, conforme esperado. O eixo de oscilação correlacionou-se com a amplitude, com um valor de R² de 0,96 e um valor de p de 0,009.

Em pacientes com contagens baixas de linfócitos T CD4 positivos, as alterações cíclicas na contagem de células T CD4 foram pequenas, e em pacientes com contagens elevadas de células T CD4 positivas, as alterações cíclicas foram grandes, porque a linha de regressão representada aqui estima o eixo de oscilação, e o eixo de oscilação está correlacionado com a amplitude. A amplitude pode ser calculada para a linha de regressão, a fim de estimar o quanto acima e abaixo da linha de regressão se espera que as células T CD4 positivas variem devido ao ciclo. Sobrepondo a amplitude calculada ao intervalo de confiança, verificou-se que a amplitude indicada pela linha verde está dentro do intervalo de confiança de 95% indicado pela linha azul.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 90 minutos, desde a coleta da saliva até a obtenção do número de células CD4 para o paciente. Este procedimento destina-se a ser usado como um teste de triagem para monitorar as contagens de CD4. Se um paciente apresentar grandes alterações nas contagens de CD4, ele deverá ser acompanhado por citometria de fluxo para garantir que as medidas das contagens de CD4 sejam válidas e para auxiliar nas decisões de tratamento.

No próximo estágio do desenvolvimento, o ensaio em microplaca será transformado em tecnologia de tiras reagentes, o que permitirá a realização de testes sem a necessidade de instrumentos ou eletricidade. É improvável que o HIV seja transmitido pela saliva, mas pacientes com HIV frequentemente têm outras doenças infecciosas, como tuberculose e hepatite C; portanto, não se deve esquecer que trabalhar com saliva, assim como com sangue, pode ser extremamente perigoso devido à presença desconhecida de partículas infecciosas. Sempre devem ser tomadas precauções, como o uso de luvas e outros equipamentos de proteção individual durante a realização deste procedimento.