Carregando retrógrado de Nervos, folhetos, e raízes nervosas com corantes fluorescentes
19 de abril de 2012
Nós descrevemos uma técnica simples e de baixo custo para a introdução de elevada concentração de corantes fluorescentes e de cálcio sensíveis em neurónios ou qualquer tracto neuronal, utilizando uma pipeta de sucção de polietileno.
O objetivo geral deste procedimento é introduzir uma alta concentração de corante fluorescente ou sensível a íons em neurônios ou em qualquer trajeto neuronal utilizando uma técnica simples e de baixo custo. Isso é realizado produzindo primeiro dois tipos de pipetas, tipo um e tipo dois. Em seguida, conecta-se uma tubulação flexível de elastômero à pipeta tipo um e aplica-se pressão positiva para aspirar o trajeto neuronal-alvo para dentro da pipeta tipo um, verificando-se que um bom selamento foi alcançado.
Em seguida, insira a pipeta tipo dois dentro da pipeta tipo um e use a pipeta tipo dois para aspirar o LCR A residual da pipeta tipo um. Então, introduza o corante, mas sem bolhas de ar, na pipeta tipo um. O passo final é incubar os neurônios no escuro entre seis e 20 horas.
No final, após a remoção da pipeta tipo um, o preparo está pronto para estudos in vitro, eletrofisiológicos ou morfológicos. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como aplicação em banho, injeção BOS e eletroporação, é que o D é entregue a uma população neuronal definida. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da neurociência, como atividade, conectividade, morfologia e distribuição de neurônios definidos.
De modo geral, a técnica exige prática, especialmente para garantir que o corante não seja diluído dentro da pipeta tipo um e que nenhuma bolha de ar seja introduzida nela. Inicie este procedimento aquecendo o tubo de polietileno na chama de uma lâmpada de álcool para produzir duas pipetas curtas com pontas afuniladas. Primeiro, puxe uma pipeta curta tipo um com uma ponta pequena capaz de segurar firmemente a raiz ou o trajeto alvo.
Em seguida, puxe uma pipeta do tipo dois com um eixo mais longo e mais fino e uma ponta muito fina, que possa ser inserida na pipeta do tipo um até sua ponta. Posteriormente, conecte a pipeta do tipo dois a uma agulha calibre 19 com clip EC. Então, coloque a medula espinhal isolada em um banho.
Sobreponha com A CSF gelado durante todo o processo de carregamento. Depois disso, coloque a pipeta do tipo um em um suporte de eletrodo de forma que sua abertura traseira possa ser facilmente conectada a uma seringa por meio de uma tubulação flexível. Neste procedimento, primeiramente aspire o CSF para dentro da pipeta do tipo um utilizando uma seringa.
Em seguida, desenhe o trato axonal ou raiz a ser preenchido. Depois, remova o tubo flexível da abertura traseira. Em seguida, acople a pipeta do tipo dois a outra seringa.
Insira-o na pipeta tipo um, que está segurando um trato axonal ou raiz neuronal sob o microscópio. Use a seringa acoplada à pipeta tipo dois para aspirar o LCR A de forma que o LCR A residual cubra apenas o trato axonal. Em seguida, retire a pipeta tipo dois da pipeta tipo um.
Monitore o nível de A CSF por alguns minutos para verificar uma boa vedação no trato axonal ou nos nervos. Em seguida, dissolva o corante em A CSF ou em Triton X 100 a 0,2% em água bidestilada. Aspire-o para dentro da pipeta do tipo dois aplicando uma pressão negativa fraca à seringa acoplada, tomando cuidado para não aspirar bolhas de ar.
Em seguida, insira a pipeta tipo dois, contendo o corante, na solução residual de LCR A na pipeta tipo um e libere lentamente o corante no LCR A, aplicando pressão positiva suave à seringa. Certifique-se de não introduzir bolhas de ar nem causar o deslocamento do tecido-alvo do interior da ponta. Se uma bolha de ar for introduzida na pipeta tipo um durante a injeção do corante, remova a bolha avançando a ponta da pipeta tipo dois próximo à bolha e, em seguida, aplicando suavemente uma pressão negativa fraca usando a seringa acoplada.
Após a liberação de uma quantidade suficiente de corante, retire a pipeta do tipo dois. Em seguida, incube o tecido no escuro por seis a 20 horas, dependendo do tipo de experimento. Após um tempo suficiente para preenchimento, retire suavemente o eletrodo do tecido.
Então, o tecido está pronto para imageamento ou histologia. Abaixo há um diagrama esquemático que mostra o carregamento simultâneo de três dextranos fluorescentes conjugados diferentes em motoneurônios, aferentes sensoriais e interneurônios espinais; os motoneurônios e os aferentes sensoriais sacrais foram preenchidos retrogradamente com Dextrano Azul Cascade e Dextrano Texas Vermelho através das raízes ventral e dorsal, respectivamente. O dextrano fluorescente verde foi carregado nos interneurônios espinais cujos axônios ascendem através do funículo ventral.
É mostrada aqui uma imagem confocal de uma seção da medula espinhal sacral na qual os neurônios foram marcados retrogradamente. Observe que os aferentes sensitivos marcados são principalmente ipsilaterais. Com algumas projeções contralaterais, os neurônios motores marcados são ipsilaterais à raiz ventral preenchida, enquanto os interneurônios marcados são contralaterais a ela, conforme indicado pela seta.
Após este procedimento, métodos adicionais podem ser realizados para responder perguntas fundamentais, como conectividade funcional, inibidor excitatório, tipo sináptico, distribuição e produção de neurotransmissores nos neurônios do campo DI. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurofisiologia da medula espinhal e do tronco encefálico investigarem populações neuronais específicas utilizando corantes sensíveis a íons. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aplicar corantes fluorescentes e/ou sensíveis a íons em neurônios e fibras sensoriais na medula espinhal isolada.
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Visão Geral
Este artigo descreve uma técnica simples e de baixo custo para introduzir altas concentrações de corantes fluorescentes e sensíveis ao cálcio em neurônios ou tratos neuronais. O método utiliza uma pipeta de sucção de polietileno para obter uma introdução eficaz do corante.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imagem Fluorescente
Antecedentes
- Corantes fluorescentes e sensíveis ao cálcio são essenciais para o estudo da atividade neuronal.
- Métodos tradicionais podem ser onerosos ou complexos.
- Esta técnica tem como objetivo simplificar o processo.
- O uso de uma pipeta de sucção de polietileno aumenta a acessibilidade para os pesquisadores.
Objetivo do Estudo
- Introduzir efetivamente altas concentrações de corantes em neurônios.
- Fornecer uma alternativa economicamente viável aos métodos existentes.
- Facilitar uma melhor visualização da atividade neuronal.
Métodos Utilizados
- Produção de dois tipos de pipetas para o procedimento.
- Aplicação de pressão positiva para atrair o trajeto neuronal-alvo para dentro da pipeta.
- Uso de uma segunda pipeta para aspirar o LCR residual.
- Introdução do corante sem bolhas de ar, seguida de incubação no escuro.
Resultados Principais
- A técnica permite a introdução eficaz de corantes em neurônios.
- Podem ser alcançadas altas concentrações de corantes com custo mínimo.
- O tempo de incubação varia de seis a vinte horas para resultados ideais.
- O método é reprodutível e acessível para pesquisadores.
Conclusões
- Este método fornece uma maneira confiável de introduzir corantes em sistemas neuronais.
- Ele melhora a capacidade de estudar a dinâmica e as funções neuronais.
- A abordagem é benéfica tanto para fins de pesquisa quanto educacionais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Essa técnica permite a entrega precisa de corantes fluorescentes e sensíveis a íons a populações neuronais definidas, apoiando a desmistificação mecanicista na validação de alvos e na análise de vias. Ao manter alta concentração de corante durante toda a carga, melhora a confiabilidade do sinal em ensaios funcionais e morfológicos subsequentes. A abordagem de baixo custo e reprodutível aprimora a padronização e escalabilidade dos ensaios em fluxos de trabalho de descoberta precoce.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de tractos neuronais específicos para esclarecer hipóteses de conectividade e função.
- Valor Operacional: Fornece uma população neuronal definida para estudos consistentes de engajamento de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas de fluorescência para avaliar a captação do corante e a eficiência de marcação neuronal.
- Valor Operacional: Apoia a prontidão do ensaio por meio da entrega padronizada e livre de bolhas do corante e protocolos de incubação reprodutíveis.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a modelagem de sistemas relevantes para doenças ao permitir a visualização de populações de motoneurônios, sensoriais e interneurônios em preparações da medula espinhal.
- Valor Operacional: Garante a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio de marcação neuronal confiável para eletrofisiologia e imageamento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se à biologia de descoberta ao permitir a marcação direcionada de neurônios, apoiando a verificação de hipóteses e a elucidação de vias. Avança para triagem ao fornecer preparações prontas para ensaios com resultados quantitativos dependentes do corante. A técnica contribui para análises por meio de métricas mensuráveis de intensidade e distribuição da fluorescência. Apoia a pesquisa translacional ao manter a integridade neuronal para estudos de continuidade pré-clínicos. O reuso em larga escala é viabilizado pelo sistema de baixo custo e adaptável, baseado em pipeta, aplicável a múltiplos tratos neuronais.
- Biologia do Descobrimento: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio da marcação definida de trajetos neuronais.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios mediante a introdução padronizada de corante em alta concentração, sem diluição.
- Análise: Permite medições quantitativas da intensidade de fluorescência e da distribuição neuronal para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao preservar a morfologia e a função neuronais após a marcação.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e de baixo custo para marcação neuronal consistente em diversos modelos experimentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista nos estudos de conectividade e atividade neuronais.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio da padronização da preparação de pipetas e entrega de corantes.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de prosseguir ou interromper ao fornecer dados confiáveis sobre o engajamento de alvos neuronais e modulação de vias.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco por meio de marcação neuronal consistente e de alta fidelidade em todas as fases de descoberta.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microcirurgia e visualização microscópica para manipulação adequada da pipeta e manuseio de tecidos.
- Depende do acesso a tubos de polietileno, sistemas de seringas e microscopia de fluorescência para carregamento e detecção do corante.
- Necessita padronização entre equipes das técnicas de puxamento de pipetas e condições de incubação para garantir consistência na marcação.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método em diferentes tratos neuronais ou sistemas modelo com diâmetros de axônios variados.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de evitar a introdução de bolhas de ar e manter a integridade do selamento durante o carregamento do corante.
