Name: Carregando retrógrado de Nervos, folhetos, e raízes nervosas com corantes fluorescentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprenda a carregar retrógradamente neurônios com corantes fluorescentes usando pipetas de polietileno. Esta técnica simples e de baixo custo permite visualizar atividade, conectividade e morfologia neural em preparações de cordão espinhal isolado.

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<p class="jove_content"&gt; Este trabalho foi financiado pelo programa intramural do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame no National Institutes of Health. Gostaríamos também de agradecer ao Dr. George Mentis por suas contribuições anteriores para o método e os dados da Figura 3.</p

Dextranos fluorescentes têm sido utilizados como ferramentas de anatómicos e para geração de imagens actividade neuronal 1-4. Campos et al, (2009) 4 publicou um protocolo para aplicação de íons e sensíveis à tensão corantes tratos axonais com um foco sobre a medula espinhal como um sistema modelo. Descrevemos aqui um procedimento mais detalhado para a aplicação de corante fluorescente e / ou iões de sensível para as raízes de corte ventral, raízes dorsais ou qualquer tracto neuronal da medula espinal para estudos in vitro optophysiological e morfológicas. 1. Tipo I e tipo II Pipetas Comece puxando duas seções curtas de tubos de polietileno (PE90, Clay Marca Adams) sobre a chama de uma lamparina de álcool para produzir 7 pipetas com pontas afiladas. Uma pipeta (Tipo I) deve ser curto (3-7 mm) com uma pequena ponta que pode firmemente manter a raiz alvo ou do tracto (diâmetro externo: 0,2-0,4 mm, diâmetro interior: 0,1-0,3 mm). Em seguida, puxe uma pipeta segundo (Tipo-II) com um mais longo (8-12 cm) mais fino do eixo, e uma ponta muito fina (diâmetro externo: 0,2-0,3 mm, diâmetro interior: 0,1-0,2 mm), que pode ser inserido no Tipo I pipetar, tanto quanto sua ponta. A pipeta segundo diluente será usado para aspirar e introduzir fluido cerebrospinal artificial (aCSF) e solução de corante, respectivamente a partir da pipeta Tipo-I. 2. Posicionamento do Tipo-I Pipetar Dissecar e isolar a medula espinhal 8,9 e colocá-lo em um banho, com superfused aCSF refrigerados (~ 16 ° C) durante todo o processo de carregamento. Coloque o Tipo-I pipetar em um porta-eletrodo (H1/12 porta eletrodo, Narishige) para que a sua abertura nas costas pode ser facilmente conectado a uma seringa (1ml U-100 seringa de insulina, Becton Dickinson ou equivalente) através de um tubo flexível (PharMed BPT, Cole-Parmer, # AY242002, 10 cm) (Fig.1A-B). 3. Aplicação Dye <ol><li> Usando a seringa, primeiro desenharaCSF para a pipeta de tipo-I (Fig.1b; 2A) seguido pelo trato axonal ou raiz para ser preenchido (Fig. 2B). A tubagem flexível deve então ser removido a partir da abertura para trás. A pipeta-Type II está ligado a outra seringa e inserido no Tipo I pipetar segurando o tracto axonal ou raiz. Usando a seringa ligado à pipeta de tipo II, aspirado aCSF de modo que o aCSF residual apenas cobre o tracto axonal (Figura 1C; 2C-D). Em seguida, retirar a pipeta de tipo II a partir da pipeta tipo-I. Monitorar o nível aCSF por alguns minutos para verificar uma boa vedação no trato axonal ou nervos (ver Seção 3 em Solução de problemas para &quot;selo bom&quot;). </li><li> Dissolve-se o corante em aCSF ou 0,2% de triton X-100 em água destilada duas vezes e retirá-la para a pipeta-Type II tendo em atenção a não incluir bolhas de ar. Inserir a pipeta de tipo-II contendo o corante para a pipeta de tipo-I e para dentro da solução aCSF residual (2E Fig.). Lentamente, liberteo corante no aCSF usando pressão positiva suave (Fig. 2F). Tenha cuidado para não introduzir quaisquer bolhas de ar ou causar deslocamento do tecido-alvo a partir do interior da ponta. Retirar a pipeta do tipo II, após uma quantidade suficiente de corante foi liberado (3-5 uL de solução de corante). </li></ol> 4. Incubação Incubar o tecido no escuro entre 6 a 20 horas, dependendo do tipo de experiência. Uma vez que o tempo suficiente tiver sido autorizado para o enchimento, suavemente afastar o eléctrodo a partir do tecido de deixar o tecido pronto para imagiologia ou histologia. Solução de problemas <ol><li> Se o tecido alvo não entra facilmente para dentro da ponta da pipeta de tipo-I ou é solto, uma vez dentro, em seguida, o diâmetro da ponta é o tamanho errado. Se isto ocorrer, puxar e utilizar uma pipeta diferente. </li><li> Antes de adicionar o corante para a aCSF na pipeta de tipo I, certificar-se que aCSF suficiente permanece de modo que ele pode ser alcançado com oTipo II-pipeta (Fig. 2D). Caso contrário, uma abertura de ar irá existir uma vez que o corante é adicionado. Se isso acontecer, não adicione o corante e retire o trato axonal da pipeta e depois desenhá-la de volta com aCSF suficiente para ser alcançado pela pipeta Tipo-II. </li><li> Se o nível de aCSF nos aumentos de tipo-I de pipeta-se depois aspirado com a pipeta de tipo II, isto significa que o selo com o tecido não é boa. Utilizar um eléctrodo diferente, caso contrário, o corante será diluído durante o procedimento de etiquetagem. </li><li> Se uma bolha de ar é introduzido na pipeta Tipo I durante a injecção do corante, escorrer para fora da bolha com o avanço do tipo II estreita ponta da pipeta para a bolha e suavemente a aplicação de uma pressão negativa fraca utilizando a seringa em anexo. </li></ol> 5. Os resultados representativos Motoneurônios Para ilustrar uma aplicação do método, simultaneamente carregados, aferentes sensoriais espinhais e interneurônios com três DEXT diferenteran-conjugados corantes fluorescentes (Fig. 3A). Como ilustrado na fig. 3B, três classes de neurônios são rotulados; aferentes sensoriais (vermelho), interneurônios projetando no funículo ventral (verde) e motoneurônios (azul). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemático, mostrando Pipetar tipo I e tipo II de montagem. (A) Um tipo I pipeta (luz azul) é colocado sobre um suporte de eléctrodo de modo que é volta de abertura pode ser facilmente ligado ao tubo de elastómero flexível (B) e em que uma pipeta de tipo-II pode ser inserido (C). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig2.jpg" /> Figura 2. Esquemático, mostrando o processo de carregamento de motoneurônios com corantes fluorescentes. (A) Uma pipeta tipo I é colocado perto da raiz ventral para ser preenchido. (B) A sucção é aplicada à pipeta para desenhar aCSF para a pipeta seguido pela raiz. (C-D) Desligar a tubagem de elastómero flexível a partir do servidor de Tipo I pipeta e reduzir a quantidade de aCSF mediante a aplicação de sucção, para a pipeta-Type II. (E) Introduza a ponta da pipeta-Type II contendo o corante dissolvido na aCSF restante na pipeta de tipo-I. (EF) Lentamente encher a pipeta tipo I com o corante e depois remover a pipeta-Type II. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig3.jpg" /> Figura 3. A aplicação do procedimento de enchimento para o cabo de rato isolado da coluna vertebral. (A) esquemático, mostrando a três Tipo I pipetas usadas para encher diferentes classes neuronais na medula espinal. Motoneurônios (azul; Cascade azul dextrano) e sacrais aferentes sensoriais (cor vermelha;-Texas Red dextran) foram backfilled através das raízes ventral e dorsal, respectivamente. Fluoresceína dextrano foi usado para carregar interneurônios espinhais (verde) cujos axônios ascender através do funículo ventral (VF). 1 mg de cada corante dextrano (MW 10.000; Molecular Probes)foi dissolvido em 6 de água destilada uL contendo 0,2% de Triton X-100 (B). Imagem confocal de uma secção do cordão sacral da medula espinal de um em que os neurónios foram retro-rotulado como descrito em A. Note que os aferentes sensoriais rotulados são principalmente ipsilateral com um projecções poucos contralateral. Os motoneurónios rotulados são ipsilateral à raiz ventral cheia ao passo que os interneurónios rotulados são contralateral ao lado do preenchimento (ponta de seta). Barra de calibração 200 um.

<ol><li>Nance, D. M., Burns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextrans+as+sensitive+anterograde+neuroanatomical+tracers%3A+applications+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls.</a> Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).</li>
<li>Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextran-amines+used+as+axonal+tracers+in+the+nervous+system+of+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo.</a> J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).</li>
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<li>Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+patterns+of+vestibular-mediated+synaptic+inputs+to+axial+and+limb+motoneurons+in+the+neonatal+mouse+assessed+by+optical+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording.</a> J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).</li>
<li>Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+functional+synaptic+connections+between+medullary+reticulospinal+neurons+and+lumbar+descending+commissural+interneurons+in+the+neonatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse.</a> J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Não temos nada a divulgar.</p

<p class="jove_content"&gt; Descrevemos aqui um protocolo simples e de baixo custo para a introdução de corantes em neurônios, nervos e tratos espinhais. Este método envolve a exposição identificados vias anatómicas a uma solução altamente concentrada de corante para a duração do processo de carregamento. Isso resulta em marcação retrógrada do site de destino com fundo pouco em comparação com microinjeções, aplicação de banho e técnicas de eletroporação. No entanto, o método é limitado aos locais no sistema nervoso, onde um tracto de axónios po...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td colspan="2"<strong&gt; Nome do material</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Comentários</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="2"&gt; Tubulação</td&gt;<td&gt; PE90 (DIxDE: 0,034 &quot;x0.050&quot;; Thikness Wall: 0,008 &quot;)</td&gt;<td&gt; Clay Adams Marca Intermedic</td&gt;<td&gt; 427421</td&gt;<td&gt; Por Tipo I e Tipo II pipetas</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NSF-51 (DIxDE: 1/16x1/8; parede Thikness: 1/32)</td&gt;<td&gt; PharMed BPT, Cole-Parmer</td&gt;<td&gt; AY242002</td&gt;<td&gt; Para Tubos flexíveis</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Seringa</td&gt;<td&gt; Seringa de insulina 1ml U-100</td&gt;<td&gt; Becton Dickenson</td&gt;<td&gt; 329650</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agulha</td&gt;<td&gt; 19G x1-1/2 &quot;Needle Hub metal</td&gt;<td&gt; Monoject</td&gt;<td&gt; 200136</td&gt;<td&gt; Conexão Tipo II pipeta para seringa</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Álcool Lâmpada</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Torneira</td&gt;<td&gt; Torneira de três vias com adaptador Luer Deslizamento Masculino</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corp</td&gt;<td&gt; 2C6241</td&gt;<td&gt; Use com seringa</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="3"&gt; Titular</td&gt;<td&gt; Titular H-1 eletrodo</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; H-1/12</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Estande Magnet</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; GJ-8</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Micromanipulador</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; M-3333</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinças</td&gt;<td&gt; S &amp; T DUMONT suíço 00632-11</td&gt;<td&gt; DUMONT</td&gt;<td&gt; JF-5 TC</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"&gt; * Esses são materiais sugeridos. Pode ser substituído com quaisquer produtos compatíveis</p

carregando retrógrado de nervos, folhetos, e raízes nervosas com corantes fluorescentes

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Marcação retrógrada de neurónios é um método padrão 1,2 anatómica que também tem sido utilizado para carregar o cálcio e sensíveis à voltagem corantes em neurónios 3-6. Geralmente, os corantes são aplicados na forma de cristais sólidos ou por injecção sob pressão local usando pipetas de vidro. No entanto, isto pode resultar na diluição da intensidade de rotulagem de corante e reduzida, particularmente quando são necessárias várias horas para a difusão do corante. Aqui demonstramos uma técnica simples e de baixo custo para a introdução de corantes fluorescentes e de iões de sensível em neurónios utilizando uma pipeta de sucção de polietileno cheio com a solução de corante. Este método oferece uma maneira fiável para a manutenção de uma elevada concentração do corante em contacto com axónios em todo o procedimento de carga.

Nós descrevemos uma técnica simples e de baixo custo para a introdução de elevada concentração de corantes fluorescentes e de cálcio sensíveis em neurónios ou qualquer tracto neuronal, utilizando uma pipeta de sucção de polietileno.

Carregando retrógrado de Nervos, folhetos, e raízes nervosas com corantes fluorescentes

A marcação retrógrada de neurônios é um método anatômico padrão1,2 que também tem sido utilizado para carregar corantes sensíveis ao cálcio e à voltagem em neurônios3-6. ...

O objetivo geral deste procedimento é introduzir uma alta concentração de corante fluorescente ou sensível a íons em neurônios ou em qualquer trajeto neuronal utilizando uma técnica simples e de baixo custo. Isso é realizado primeiramente produzindo dois tipos de pipetas, tipo um e tipo dois. Em seguida, conecte um tubo elastômero flexível à pipeta tipo um e aplique pressão positiva para aspirar o trajeto neuronal-alvo para dentro da pipeta tipo um, verificando que um bom selamento foi obtido.Em seguida, insira a pipeta do tipo dois dentro da pipeta do tipo um e utilize a pipeta do tipo dois para aspirar o LCR A residual da pipeta do tipo um. Então, introduza o corante, mas sem bolhas de ar, na pipeta do tipo um. O passo final é incubar os neurônios no escuro por seis a 20 horas.Por fim, após a remoção da pipeta do tipo um, o preparo está pronto para estudos in vitro, eletrofisiológicos ou morfológicos. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como aplicação em banho, injeção BOS e eletroporação, é que o D é entregue a uma população neuronal definida. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da neurociência, como atividade, conectivida

retrograde-loading-nerves-tracts-spinal-roots-with-fluorescent

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Neurociência

O cálcio é um mensageiro onipresente no sistema nervoso, essencial para desencadear a liberação de neurotransmissores e as alterações na força sináptica. Aqui nós demonstramos uma técnica para carregar Ca 2 +-indicadores em terminais nervosos Drosophila. Nós também demonstram a fabricação dos aparelhos necessários e enfatizar os pontos críticos para o sucesso da técnica.

Carregando Drosophila terminais nervosos com indicadores de cálcio

Descrevemos as características estruturais das sinapses Glia-neuromuscular em um romance de preparação dos tecidos dentro para fora-de larvas de moscas ao vivo usando corantes fluorescentes com microscopia confocal. Nós rotulados terminais de neurônios fluorescentes viver com anticorpos primários para HRP, e também visualizar o espaço perisynaptic com Dextranos fluorescente.

Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Imagens ao vivo de axônios da raiz dorsal após rizotomia

Transporte retrógrado de corante fluorescente rotula uma sub-população de neurónios baseado em projecção anatómica. Axônios rotulados pode ser alvo...

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

Fonte: Inal, M. A. et. al., Rastreamento retrógrado de Drosophila neurônios motores embrionários usando corantes fluorescentes lipofílicos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o método de rotulagem retrógrada de Drosophila neurônios motores usando corantes lipofílicos. O corante entra no axônio, viaja retrógrada e rotula os neurônios em verde, permitindo a visualização detalhada de sua morfologia e projeções sob um microscópio confocal.

Marcação retrógrada de neurônios motores de Drosophila usando corantes lipofílicos fluorescentes

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/61742/visualizaizing-the-calcitonin-gene-related-peptide-immunoreactive-innervation-of-the-rat-cranial-dura-mater-with-immunofluorescence-and-neural-tracing'&gt;Wang, J., et al. Visualizando a inervação imunorreativa do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina da dura-máter craniana de ratos com imunofluorescência e rastreamento neural. J. Vis. Exp. (2021). Este vídeo demonstra um método para rastrear as origens dos...

Investigando as origens dos neurônios sensoriais na dura-máter usando microscopia de fluorescência

Apresentamos um protocolo utilizando microscopia de lapso de tempo de excitação de dois fótons para visualizar simultaneamente a dinâmica das lesões de axônio e mielina em tempo real. Este protocolo proposto permite estudos de fatores intrínsecos e extrínsecos que podem influenciar o destino do axônio mielinizado central após a lesão e contribuir para a incapacidade clínica permanente.

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Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

Aqui, descrevemos um método para carregar um corante sensível ao cálcio através do coto nervoso do sapo nas terminações nervosas. Também apresentamos um protocolo para a gravação e análise de transientes de cálcio rápidos nas terminações nervosas periféricas.

Carregando uma tintura de cálcio em terminação de nervo de sapo através do coto nervoso: Registro de transientes de cálcio na união neuromuscular de sapo

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Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised

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Carregando retrógrado de Nervos, folhetos, e raízes nervosas com corantes fluorescentes

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