Análise da maturação das células dendríticas e migração pulmonar durante a inflamação alérgica das vias aéreas

O objetivo deste procedimento é avaliar a maturação e migração de células dendríticas pulmonares ou DC durante o curso da inflamação alérgica das vias aéreas induzida por Val Boomin em camundongos. Isso é feito primeiro sensibilizando os camundongos com Val Boomin, seguido de desafio das vias aéreas com Val Boomin rotulado. Em seguida, o pulmão e os linfonodos mediastinais são colhidos.

Finalmente, uma suspensão de célula única é preparada a partir dos tecidos pulmonares e linfonodais. Em última análise, o estado de maturação e o número absoluto de células dendríticas da leitura de Pullman encontradas no linfonodo mediastinal após o desafio FITC Val Boomin podem ser avaliados por análise de citometria de fluxo. Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave sobre as respostas imunes pulmonares, como se as células dendréticas sofrem maturação, queda da exposição ao antígeno e se migram para os linfonodos classificados.

E se eles migrarem, então qual é a taxa de migração. Comece adicionando a solução Val Boomin recém-preparada Dropwise na proporção de um para um em um tubo de alúmen durante o vórtice. Mexa a mistura por 30 minutos e, em seguida, encha uma seringa de um mililitro com 0,2 mililitros da mistura.

Usando o polegar no indicador de uma mão, segure o mouse a ser injetado pelo pedaço do pescoço próximo à base do crânio. Em seguida, injete a solução de alúmen Val Boomin na cavidade peritoneal do camundongo com a outra mão. Sete dias após a segunda injeção de Val em alúmen, segure um val anestesiado em animal sensibilizado com alúmen na posição vertical e, em seguida, usando pontas de pipeta estéreis pipeta 100 microlitros e val recém-preparado em solução fxi no NAS do camundongo de forma gota.

Comece conectando um cateter de calibre 20 a um mililitro de seringa. Então, depois de confirmar a eutanásia do camundongo, abra a cavidade torácica do animal até o pescoço para expor e canular a traqueia do camundongo. É absolutamente crítico lavar os pulmões e profundir o coração para garantir que todos os macrófagos alveolares contaminantes e células mononucleares presentes no sangue periférico tenham sido removidos.

E certifique-se de executar essas próximas duas etapas com cuidado e, claro, com mão firme. Agora administre PBS gelado com EDTA três vezes através do cateter para enxaguar o trato respiratório inferior e remover as células dos espaços alveolares. Em seguida, depois de colocar uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de calibre 20, perfunda os pulmões com 10 mililitros de PBS contendo heparina através do ventrículo direito do coração.

A remoção de quaisquer células sanguíneas remanescentes da vasculatura pulmonar é considerada completa quando os pulmões ficam brancos. Em seguida, remova os gânglios linfáticos mediastinais, colocando-os em um prato separado. Evite a têmpera do ajuste minimizando a exposição à luz do tecido.

Em seguida, disseque os pulmões perfundidos e coloque-os em uma placa de Petri usando uma tesoura para picar os pulmões. Em seguida, digerir o tecido pulmonar a 37 graus Celsius em 250 unidades por mililitro de colagenase D. Após 25 minutos de incubação, adicione EDTA à mistura por cinco minutos para interromper a atividade da colagenase. Finalmente, passe os fragmentos de pulmões digeridos por um filtro de células de 100 mícrons e coloque os eritrócitos com tampão hipotônico.

Separe os gânglios linfáticos mediastinais usando agulhas finas e digeri-los com colagenase, como acabamos de demonstrar para os pulmões, seguido de coar o tecido através de um filtro de células após intraperitoneal, sensibilização e via aérea. Val em desafio. A presença de células inflamatórias pode ser avaliada pela coloração de hemat, toína e eosina em cortes pulmonares representativos do controle.

Animais tratados com solução salina, os tecidos são desprovidos de inflamação, conforme demonstrado pelo gráfico superior. Em contraste, as células inflamatórias são difundidas em todas as seções pulmonares de Val em animais sensibilizados e desafiados, como pode ser visto na parte inferior. A coloração de deslocamento ácido periódico e gráfico pode ser usada para avaliar a produção de muco, conforme mostrado neste gráfico inferior.

A indução de inflamação alérgica das vias aéreas após val em desafio em Val em camundongos sensibilizados é confirmada pela presença de muco. Por outro lado, uma completa ausência de produção de muco é exibida pelo controle. Camundongos tratados com solução salina, conforme demonstrado no gráfico superior após val em desafio pulmonar DCS sofrem maturação e subsequente migração para os linfonodos de drenagem.

Aqui, uma análise representativa dos linfonodos mediastinais de camundongos mostra que um aumento modesto, mas consistente, na proporção de células positivas para CD 11 C é detectado em animais sensibilizados e desafiados com Val Boomin em comparação com camundongos tratados com solução salina. Além disso, a análise do número absoluto de células CD 11 C positivas CD 11 B positivas Val Boomin se encaixa em células C positivas dos linfonodos mediastinais de Val em camundongos sensibilizados e desafiados mostra que um aumento várias vezes maior no número de DC ocorre em camundongos desafiados em comparação com animais tratados com solução salina. Depois de assistir a este vídeo, devemos ter uma compreensão muito boa de nossa técnica para analisar a maturação e a migração das células dendríticas pulmonares.

E uma vez que você realmente entenda essa técnica, você pode modificá-la para avaliar as respostas das células dendríticas pulmonares a outros patógenos, bem como a outros fatores experimentais.