Análise da maturação das células dendríticas e migração pulmonar durante a inflamação alérgica das vias aéreas

O objetivo deste procedimento é avaliar a maturação e migração de células dendríticas pulmonares ou CD durante o desenvolvimento da inflamação das vias aéreas alérgica induzida por Val Boomin em camundongos. Isso é realizado primeiramente sensibilizando os camundongos com Val Boomin, seguido por desafio nas vias aéreas com Val Boomin marcado com fitsina. Em seguida, os pulmões e os linfonodos mediastinais são coletados.

Finalmente, uma suspensão de células únicas é preparada a partir dos tecidos pulmonar e linfonodal. Em última instância, o estado de maturação e o número absoluto de células dendríticas Pullman read encontradas no linfonodo mediastinal após o desafio com FITC Val Boomin podem ser avaliados por análise citométrica de fluxo. Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais sobre as respostas imunes pulmonares, como se as células dendríticas passam por maturação após a exposição ao antígeno e se elas migram para os linfonodos regionais.

E se eles migrarem, qual é a taxa de migração. Comece adicionando, gota a gota, solução de Val Boomin recém-preparada em uma proporção de um para um em um tubo com alum, sob agitação em vórtex. Agite a mistura por 30 minutos e, em seguida, encha uma seringa de um mililitro com 0,2 mililitros da mistura.

Usando o polegar e o indicador de uma das mãos, segure o camundongo a ser injetado pelo tecido da nuca, próximo à base do crânio. Em seguida, com a outra mão, injete a solução de Val Boomin em alumínio na cavidade peritoneal do camundongo. Sete dias após a segunda injeção de Val em alumínio, segure um animal sensibilizado com Val em alumínio, anestesiado, na posição ereta e, então, utilizando ponteiras de pipeta estéreis, pipete 100 microlitros de solução recém-preparada de Val em fxi sobre o NAS do camundongo, gota a gota.

Inicie fixando um cateter de calibre 20 a uma seringa de um mililitro. Em seguida, após confirmar a eutanásia do camundongo, abra a cavidade torácica do animal até o pescoço para expor e canular a traqueia do camundongo. É absolutamente essencial lavar os pulmões e perfundir o coração para garantir que todos os macrófagos alveolares e células mononucleares contaminantes presentes no sangue periférico tenham sido removidos.

E certifique-se de realizar esses próximos dois passos com cuidado e, é claro, com mão firme. Agora, administre PBS gelado com EDTA três vezes através do cateter para lavar o trato respiratório inferior e remover células dos espaços alveolares. Em seguida, após acoplar uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de 20 calibres, perfunda os pulmões com 10 mililitros de PBS contendo heparina pela via do ventrículo direito do coração.

A remoção de quaisquer células sanguíneas remanescentes da vasculatura pulmonar é considerada completa quando os pulmões ficam brancos. Em seguida, remova os linfonodos mediastinais, colocando-os em uma placa separada. Evite a quenching de FITC minimizando a exposição da tecido à luz.

Em seguida, dissecar os pulmões perfundidos e colocá-los em uma placa de Petri, usando tesoura para picar os pulmões. A seguir, digerir o tecido pulmonar a 37 graus Celsius em 250 unidades por mililitro de colagenase D. Após 25 minutos de incubação, adicionar EDTA à mistura durante cinco minutos para interromper a atividade da colagenase. Por fim, passar os fragmentos de pulmões digeridos através de um filtro celular de 100 mícrons e lisar os eritrócitos com tampão hipotônico.

Separar cuidadosamente os linfonodos mediastinais usando agulhas finas e digeri-los com colagenase, conforme demonstrado anteriormente para os pulmões, seguido por peneiração do tecido através de um filtro celular após sensibilização intraperitoneal e desafio via aérea. A presença de células inflamatórias pode ser avaliada por coloração com hematoxilina e eosina em cortes pulmonares representativos de controle.

Em animais tratados com solução salina, os tecidos estão livres de inflamação, conforme demonstrado no gráfico superior. Em contraste, células inflamatórias estão disseminadas por toda a extensão das seções pulmonares de animais sensibilizados e desafiados com Val, como pode ser observado no gráfico inferior. A coloração com ácido periódico de Schiff pode ser utilizada para avaliar a produção de muco, conforme mostrado neste gráfico inferior.

A indução da inflamação alérgica das vias aéreas após o desafio com Val in em camundongos sensibilizados com Val in é confirmada pela presença de muco. Inversamente, uma ausência completa de produção de muco é exibida pelos controles. Camundongos tratados com solução salina, como demonstrado no gráfico superior, após o desafio com Val in, as DCs pulmonares passam por maturação e subsequente migração para os linfonodos drenantes.

Aqui, uma análise representativa de linfonodos mediastinais de camundongos mostra que um aumento discreto, mas consistente, na proporção de células positivas para CD11c é detectado em animais sensibilizados e desafiados com Val Boomin em comparação com camundongos tratados com solução salina. Além disso, a análise do número absoluto de células positivas para CD11c, CD11b e Val Boomin fit C provenientes dos linfonodos mediastinais de camundongos sensibilizados e desafiados com Val demonstra que ocorre um aumento várias vezes maior no número de DCs em camundongos desafiados em comparação com animais tratados com solução salina. Após assistir a este vídeo, deveremos ter uma compreensão bastante clara da nossa técnica para analisar a maturação e a migração de células dendríticas pulmonares.

E, uma vez que você entenda bem esta técnica, poderá modificá-la para avaliar as respostas de células dendríticas pulmonares a outros patógenos, bem como a outros fatores experimentais.