Imobilização planária, irradiação parcial e Transplante de Tecidos

O objetivo geral do experimento a seguir é posicionar uma população de células-tronco saudáveis adjacentes ao tecido ablacionado por células-tronco dentro de um pariano, a fim de analisar os comportamentos das células-tronco e da progênie in vivo durante a regeneração. Isso é conseguido anestesiando e imobilizando um pariano não irradiado ou irradiado com Leafly para posterior manipulação. Em seguida, o parian não irradiado imobilizado é parcialmente protegido com chumbo e, em seguida, irradiado por raios-x, o que produz um parian não ferido com tecido de ablação de células-tronco justaposto ao tecido blindado que permanece carregado de células-tronco.

Alternativamente, um enxerto de tecido retirado de um doador não irradiado pode ser transplantado para um hospedeiro previamente irradiado, a fim de produzir um pariano com uma população isolada de células-tronco. Fally presente dentro de uma célula-tronco. São obtidos resultados de hospedeiros ablalados que mostram populações isoladas de células-tronco adjacentes aos tecidos ablacionados por RNA de montagem inteira in situ duas hibridização para genes marcadores de células-tronco.

Assim, os métodos aqui descritos visam entender melhor as planárias de regeneração, estudando o comportamento das células-tronco tanto no paradigma de transplante quanto no paradigma de irradiação parcial, o que nos permite testar se os tecidos circundantes e os ambientes locais em que essas células-tronco residem, afetam ou afetam o comportamento desses neoblastos ou células-tronco. Durante o processo de regeneração, Um a dois meses antes do experimento, alimente o plin de acordo com o manuscrito que o acompanha. Para obter o tamanho desejado nesta demonstração, são selecionados plin entre um a dois centímetros de comprimento e mais largos que dois milímetros.

Em seguida, eles passam fome de três a sete dias antes do uso. Em seguida, prepare a solução de cloro tona para um anestésico local suave, dissolvendo 0,1 a 0,2% de peso por volume de cloro na água pariana. Em seguida, resfrie a solução em gelo para transplante de tecido com um bico de bunsen, dobre um tubo capilar com 0,75 milímetro de diâmetro interno de um a dois centímetros da extremidade em um ângulo de 90 graus para cortar o tecido do enxerto.

Em seguida, dobre outro tubo capilar com diâmetro externo de 0,7 milímetro a um a dois centímetros da extremidade em um ângulo de 90 graus para criar um orifício no hospedeiro para receber o enxerto. Em seguida, corte o papel de filtro preto watman. Número três, papel de filtro Kim wipe e papel de enrolar cigarro de acordo com os tamanhos indicados no manuscrito que acompanha.

Depois disso, prepare a solução de Holt Fers modificada e a solução de Holt Fretter saturada de Caine. Resfrie os dois a quatro graus Celsius. Em seguida, prenda um lenço dobrado Kim a um quadrado de Paraform.

Coloque-o na placa de resfriamento Peltier ou outro dispositivo de resfriamento sob um microscópio de dissecação. Em seguida, sature o lenço Kim com a solução Holt Fretter gelada. Em seguida, coloque dois retângulos de papel de filtro preto no lenço Kim.

Agora coloque um pedaço de papel de filtro Watman número dois em uma placa de Petri. Umedeça o papel de filtro com a solução Holt Fretter. Em seguida, resfrie o prato no gelo para irradiação parcial.

Coloque um forro de papel maior em um prato maior semelhante ao transplante de tecido. Umedeça o papel de filtro com a solução Holt Fretter. Em seguida, resfrie o prato no gelo.

Neste procedimento, encha uma placa de Petri com solução de cleone resfriada. Pipete a Planária para o prato para transplante. Anestesiar apenas um hospedeiro e um doador de cada vez.

Para irradiação parcial, muitos animais podem ser anestesiados de uma só vez. Em seguida, deixe a paria de molho na solução de cleone por cinco a 10 minutos até que fiquem imóveis. Enxágue o paria pipetando-o em um prato cheio de solução gelada de Holt Fretter.

Depois disso, imobilize a área do plin pipetando-os nos papéis de filtro pretos saturados com solução de Holt fretter resfriada. Em seguida, oriente-os com o lado ventral para baixo com uma pinça. Agora coloque uma placa de Petri resfriada preparada anteriormente em um balde de gelo que caberá dentro de um irradiador de raios-X de fonte superior.

Organize a área do plin anestesiado em uma placa de Petri movendo os papéis de filtro pretos. Em seguida, transfira-os para o irradiador de raios X de fonte superior e posicione o balde de gelo de forma que a distância do tubo catódico ao paria seja minimizada. Maximizando assim a taxa de dose efetiva.

Em seguida, posicione os escudos de chumbo entre a paria e o tubo catódico para a dose de raio-x. Se a ablação completa de células-tronco de regiões não blindadas for desejada, forneça 30 cinzas ou mais. Imediatamente após a emissão de raios-x, transfira o parian para água parian gelada.

Depois disso, deixe a água pariana aquecer até a temperatura ambiente e os animais se desalojarem do papel de filtro preto. O procedimento de irradiação parcial está agora concluído. Para iniciar este procedimento sob o microscópio de dissecação, organize o hospedeiro anestesiado e a área da plin doadora em filtros pretos retangulares separados no lenço Kim, que já foi resfriado na placa peltier ou mais fria.

Use um tubo capilar de 0,75 milímetro de diâmetro interno para cortar o tampão do enxerto do doador. Em seguida, use um par de pinças para colocá-lo em uma parte fora do caminho do hospedeiro. Em seguida, use um tubo capilar de diâmetro externo de 0,7 milímetro para remover um plugue do hospedeiro.

Em seguida, posicione o enxerto no orifício. Transfira o hospedeiro transplantado no papel de filtro preto retangular para a placa de Petri preparada anteriormente. Molhe um pedaço de papel de enrolar com a solução de Holt Fretter saturada de Caine.

Em seguida, coloque-o em cima do hospedeiro transplantado. Em seguida, molhe quatro pedaços de papel de filtro envolvendo a solução Holter saturada e, caso o submarino hospedeiro transplantado embeba posteriormente quatro maços de corte, Kim limpe a solução Holt Fretter saturada. Coloque-os sobre os papéis de filtro.

Depois disso, feche a tampa. Coloque a placa de Petri no gelo. Em seguida, transfira o doador parian para a água parian para recuperação e regeneração.

Quando todos os transplantes estiverem concluídos, coloque o parian transplantado em uma incubadora de 10 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, transfira-o para uma placa de Petri cheia de água parian. Permita que o parian se desaloje do papel de filtro ou remova-o suavemente com uma pinça e troque a água parian uma vez a cada dois ou três dias depois.

A hibridização in situ de montagem em orifício no parian de controle irradiado, mas totalmente blindado, fixado três dias após a irradiação, mostra uma distribuição de células-tronco indistinguível da do tipo selvagem parian. Por outro lado, para o pariano que estava apenas parcialmente blindado, deixando as partes anterior e posterior expostas, as células-tronco parecem estar abladas das regiões não blindadas. Aqui mostra as vistas dorsal e ventral de um parian transplantado com sucesso.

Três dias após o transplante, o enxerto é claramente visível nas superfícies dorsal e ventral e é circundado por tecido não pigmentado característico na interface enxerto-hospedeiro. No entanto, o transplante malsucedido não exibe tecido de enxerto visível no local do transplante. A hibridização in situ de montagem total revelou a presença de células-tronco apenas dentro ou ao redor do local do enxerto, o que indica o sucesso do transplante Uma vez dominado.

Os transplantes podem ser feitos em menos de cinco minutos cada. Com taxas de sucesso próximas de 90 a 100% e a irradiação parcial pode ser bastante ampliada. Supondo que o tamanho do campo do seu irradiador seja suficientemente grande.