Name: Caracterização de mecanismos moleculares de Em vivo RUV catarata induzida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: Aprenda a induzir catarata em ratos usando radiação ultravioleta e analisar mecanismos moleculares com PCR em tempo real e imunohistoquímica. Este modelo animal é essencial para estudar cataractogênese.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Karolinska KID-financiamento Autoridade de Protecção, sueco Radiação, Instituto Karolinska Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, Olho St. Erik Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.

1. A exposição à radiação ultravioleta <ol><li> 15 min antes da exposição, anestesiar uma ratazana Sprague-Dawley do sexo feminino, com uma mistura de 90 mg / kg de Ketalar (cetamina), e 10 mg / kg de Rompun (xilazina) por injecção intraperitoneal. </li><li> Colocar o animal em um limitador de rato e apertar as correias até a imobilização do rato sem provocar um aperto do tronco 13. </li><li> Instilar Mydriacyl (tropicamida), 10 mg / ml, em ambos os olhos dos ratos para induzir midríase. </li><li> Colocar o animal para que um olho está posicionado de encontro a um estreito feixe de RUV a 300 nm 14 nm com 10 largura total a metade do valor máximo e proteger o olho contralateral com fita adesiva preta. </li><li> Exponha o rato unilateralmente limiar sub-dose de 1 kJ / m 2 RUV-B a 300 nm para 15 min 15. </li></ol> 2. Dissecação <ol><li> Após pré-determinado intervalo de pós-exposição (1, 5, 24 e 120 horas), o sacrifício do rato de seis semanas de idade (peso &lt;200 g) por carbon asfixia e dióxido de deslocamento das vértebras cervicais. </li><li> Enuclear olhos. Depois disso, coloque a córnea do olho para baixo, lado posterior para cima. Em seguida, o perfurador de um furo através da aplicação de um mínimo de uma cânula de calibre 27 e empurre tangencialmente à esclerótica para evitar danificar a lente que é muito próximo da esclera. Em seguida, usar um par de tesouras de cirurgia oftálmica para cortar circunferencialmente logo atrás do limbo até que a porção posterior da esclerótica pode ser levantada. Depois, levante a lente com uma pinça sem corte curvas. </li><li> Remover restos do corpo ciliar do equador do cristalino sob um microscópio, mantendo a lente na solução de sal equilibrada de não mais do que 5-10 minutos. </li></ol> 3. RT-PCR quantitativa <ol><li> Colocar uma lente em uma mistura de 350 ul de tampão de lise RA1 (NucleoSpin ARN II de ARN total isolado kit) e 3,5 ul de β-mercaptoetanol em 2 ml de tubo Eppendorf. </li><li> Manter a lente nesta mistura durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Homogeneizar a lente comuma agulha até que apenas o núcleo duro do cristalino é deixada entre a lente (córtex e da cápsula da lente são lisadas em tampão de lise). Remover o núcleo a partir da mistura. </li><li> Armazenar as amostras imediatamente a -70 ° C. </li><li> Descongelar as amostras e seguir o protocolo &quot;purificação RNA total a partir de células cultivadas e tecidos&quot; (NucleoSpin RNA II RNA total isolamento kit). </li><li> Armazenar as amostras de ARN a -70 ° C. </li><li> Para verificar a remoção suficiente de DNA de cada amostra, execute uma PCR sob as seguintes condições (passo 1: 95 ° C durante 2 min; passo 2 durante 40 ciclos de: 95 ° C durante 20 segundos, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 20 segundos; passo 3: 72 ° C durante 7 min) com os iniciadores de ADN específicos de p53, para a frente 5&#39;-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 &#39;e inverso 5&#39;-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3&#39; e a Taq DNA polimerase (dNTPack), de acordo com a fabricação protocolo. O produto de PCR esperado é 243 pares de bases. </li><li> Executar uma electroforese em gel de agarose 1,5% para detectar ADN do produto de PCR específico de 243 pares de bases. Para preparar1,5% de agarose gel em tampão TBE ter 3,75 g de agarose e resolvê-lo em 250 ml de tampão TBE. Adicionar brometo de etídio (0,5 mg / ml) em 500 ul de 500 ml de solução a 1,5% de gel de agarose. Aquece-se a mistura num forno de microondas owen e agitar para resolver a agarose. </li></ol> Nenhuma das amostras tem de revelar quaisquer produtos de PCR específicos de DNA em electroforese em gel de agarose a 1,5%. <ol start="9"><li> Medir a concentração de amostras de RNA (1 ul) e a razão entre a absorvância da amostra a 260 nm (RNA) e 280 nm (de proteína) em um espectrofotômetro ND-1000 NanoDrop. Se o RNA relação à proteína de RNA absorvância da amostra é de 2,0 ou mais, em seguida, a amostra de RNA é puro. Se a razão de absorvância da amostra de RNA é menor do que 2,0, refazer o RNA etapa de purificação de 3,5. </li><li> Tomar um volume de amostra de ARN correspondente a 1 ug e sintetizar cDNA após a 1 ª Strand Kit protocolo de síntese de ADNc (1 st Strand Kit de síntese de ADNc por RT-PCR). </li><li> Armazenar as amostras de cDNA a -20 ° C(Por um período de um ou mais anos, armazenar a -70 ° C). </li><li> Executar quantitativa PCR em tempo real em iCycler única cor MyiQ Real Time sistema de detecção de PCR. Carga triplicados em placa de 96 poços com 1 ul da amostra de cDNA, TaqMan Gene Expression Mix Master, TaqMan Gene Expression Assay por caspase 3, de acordo com as instruções para a fabricação. Carga triplicados em outra placa de 96 poços com 1 ul da amostra de cDNA, TaqMan Gene Expression Mix Master, TaqMan Gene Expression Assay por 18s, de acordo com as instruções para a fabricação (TaqMan Gene Expression Assay Protocol). Diluir em série de uma fracção de cDNA a partir de três escolhidos aleatoriamente não expostas lentes. Executar diluições em série juntamente com o cDNA a partir de amostras em uma placa de 96 poços. </li><li> Utilizar o método de curva padrão para a quantificação dos resultados. O número de ciclos a fluorescência limiar é utilizado como a medida em software MyiQ. Uma curva padrão de expressar o número de ciclos de limiar como uma função da concentração relativa de calibrador é eslecido para as diluições em série em cada uma das placas. cDNA a partir de três amostras não tratadas foi de lente usada para calibração. Relacionar o número limite de ciclos para cada amostra com a curva padrão para se obter a concentração relativa da amostra de cDNA medido. Finalmente, obter o nível de expressão dos genes alvo através da relação entre a concentração relativa do alvo de cDNA para os 18s de controlo interno de cDNA. </li></ol> 4. A coloração imuno-histoquímica <ol><li> Fixação <ol><li> Dissecar o olho em PBS (Tampão fosfato salino, pH 7,4). </li><li> Colocar o olho em um tubo cheio com paraformaldeído a 4% (PFA) em frio de gelo durante 20 min. Prepare PFA 4% no dia anterior. Armazenar a 4 ° C até à sua utilização. PFA é fresco por cerca de uma semana. </li><li> Remover PFA com uma micropipeta. Em seguida, lava-se com PBS arrefecido em gelo durante 20 min. </li><li> Colocar o olho em sacarose a 30%, a +4 ° C durante a noite. </li><li> Colocar o olho em um copo cheio de temperatura de corte ideal (outubro) e médio (Tissue-Tek). Colocar o olho em posição adequada para o corte. </li><li> Congelar em OCT médio sobre gelo seco. </li><li> Armazenar a -70 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Seccionamento <ol><li> Posicione o olho para crio-corte em um plano apropriado. </li><li> Corte três 5 mm de espessura médio-sagital secções de uma porção central de cada uma das lentes. Descartar pelo menos seis trechos entre seções seqüenciais para evitar manchar os mesmos núcleos em diferentes seções. </li><li> Uma vez que a seção tenha sido cortada, coloque delicadamente um slide em cima dela. A seção deve, então, ficar com o slide. </li><li> Deixar as lâminas secar ao ar antes da utilização. As lâminas podem ser armazenadas a -20 ° C até serem necessárias. </li></ol></li><li> Fluorescência imunohistoquímica <ol><li> Deixe as amostras atingir a temperatura ambiente (5-10 min). </li><li> Desenhar bordas em torno dos espécimes com uma caneta PAP-(Invitrogen). </li><li> Deixe que a fronteira seco durante algum tempo (10 min). </li><li> Rotular as lâminas de microscópio. </li><li> Rehidratar em 1 × PBS durante 15 min. </li><li> Permeabilizar a solução padrão para bloco de 30 min. </li><li> Adicionar anticorpo primário (caspase-3 de coelho, policlonal de anticorpos clivados Asp175 9661; tecnologia de sinalização celular, Inc) diluída 1:3.000 em solução bloco padrão. </li><li> Armazenar numa câmara humidificada a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lavar com PBS por pipetagem (3 x 5 min) ou por imersão num banho de grandes dimensões (&gt; 15 min, 1-2 alterações). </li><li> Adicionar anticorpo secundário (anticorpo de coelho anti secundária com um espectro de absorção / emissão específico) diluído 1:300 em solução de bloqueio padrão. </li><li> Lavar com PBS por pipetagem (3 x 5 min) ou por imersão num banho de grandes dimensões (&gt; 15 min, 1-2 alterações). </li><li> Limpe PAP pen-manchas. </li><li> Armazenar numa câmara húmida à temperatura ambiente durante 3 hr. Evitar a exposição à luz. </li><li> Adicionar uma gota de Vectashield e colocar uma lamela sobre a lâmina. Evite fazer bolhas. </li><li> Deixe secar a camada Vectashield (~ 20 min). </li><li> Mantenha seções in no escuro até a análise. </li><li> Todas as secções de controlo são tratados, na ausência de anticorpo primário. </li><li> Olhe para os resultados dentro de algumas horas sob um microscópio de fluorescência. </li><li> Conte núcleos de células epiteliais &quot;de um arco lateral nuclear para outro lado arco nuclear de cada lente. Aplicar o filtro padrão azul para ver todos os núcleos lente epitelial em azul e um filtro padrão que se encaixa a emissão do anticorpo secundário para ver os núcleos caspase-3 positiva em verde. </li><li> Registar o número de todos os núcleos lente epiteliais e o número de núcleos positivos. Conte as células três vezes para cada seção. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brian, G., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cataract+blindness%3A+challenge+for+the+21+st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Cataract blindness: challenge for the 21 st century.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).</li>
<li>Jose, J. G., Pitts, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependency+of+cataracts+in+albino+mice+following+chronic+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure.</a> Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).</li>
<li>Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cataract+in+the+rat+after+exposure+to+radiation+in+the+300+nm+wavelength+region.+A+study+of+the+macro-%2C+micro-+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+%28Copenh%29%22%5BJournal%5D)">Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure.</a> Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).</li>
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<li>McCarty, C. A., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+epidemiologic+evidence+linking+ultraviolet+radiation+and+cataracts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts.</a> Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).</li>
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<li>Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Expression+and+Apoptosis+In+The+Lens+After+Ultraviolet+Radiation+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+of+visual+science%22%5BJournal%5D)">p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure.</a> Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).</li>
<li>Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+universal+rat+restrainer+for+ophthalmic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new universal rat restrainer for ophthalmic research.</a> Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cataract+after+repeated+exposure+to+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation.</a> Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).</li>
<li>Söderberg, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+ultraviolet+radiation+exposure+to+the+lens+expressed+by+maximum+tolerable+dose+%28MTD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD).</a> Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).</li>
<li>Michael, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+repair+of+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).</li>
<li>Löfgren, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cataract+from+ultraviolet+radiation%22">Cataract from ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).</li>
<li>Ayala, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Influence+of+exposure+patterns+and+oxidation+in+UVR+induced+Cataract%22">Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Safety+limit+estimation+for+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%22">Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+age+and+sex+in+ultraviolet+radiation+cataract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+exposure+time+for+UV+radiation-induced+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<html> Este artigo descreve métodos que permitem estudar eventos moleculares que ocorrem durante a catarata induzida UVR-B. Considerando, que a maioria das informações disponíveis para in vivo UVR catarata induzida foi derivada a partir de experiências sobre albino Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, ​​19, decidimos usar o rato Sprague-Dawley albinos, no presente estudo. Idade dos ratos foi de seis semanas de idade. O gênero foi escolhido para ser fêmea, porque, em contraste com...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Ketalar </td><td> Pfizer </td><td> 150086 </td><td> 50 mg / ml </td></tr><tr><td> Rompun </td><td> Bayer </td><td> 022545 </td><td> 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Simplex Oculentum </td><td> Apoteket, Suécia </td><td> 336164 </td><td> 5 g </td></tr><tr><td> Mydriacyl </td><td> Alcon </td><td> 00352 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Solução salina balanceada </td><td> Alcon </td><td> 0007950055 </td><td></td></tr><tr><td> 3,5 ul β-mercaptoetanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin ARN II de isolamento de ARN total kit </td><td> Macherey-Nagel GmbH &amp; Co, Duren, Alemanha </td><td> 740.955,50 </td><td></td></tr><tr><td> p53 iniciadores de ADN específicos </td><td> biomers.net GmbH </td><td> Feitos </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA polimerase, dNTPack </td><td> Roche </td><td> 04 728 866 001 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de brometo de etídio 0,5 mg / ml </td><td> Sigma </td><td> E1385 </td><td></td></tr><tr><td> Nano Drop-ND-1000 espectrofotômetro </td><td> Produtos Nanodrop </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 st Strand kit de síntese de ADNc por RT-PCR (AMV) </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 11 483 188 001 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler MyiQ única cor em tempo real sistema de detecção de PCR </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td></td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Placa de 96 poços </td><td> Sarstedt </td><td> 72.1979.202 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Gene Expression Master Mix </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4369016 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Gene Expression Assay da caspase 3 </td><td> Applied Biosystems </td><td> Rn00563902_m1 </td><td></td></tr><tr><td> Ensaio TaqMan Gene Expression para maiores de 18 </td><td> Applied Biosystems </td><td> Hs99999901_s1 </td><td></td></tr><tr><td> MyiQ software </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Caspase-3 clivada (Asp175) </td><td> Tecnologia de sinalização celular </td><td> 9661 </td><td></td></tr><tr><td> Anti IgG de coelho </td><td> Abcam </td><td> Ab6798 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio Universal Axioplan 2 Imagem </td><td> Carl Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão TBE 10x </td><td> Promega </td><td> V4251 </td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização de mecanismos moleculares de<em&gt; em vivo</em&gt; ruv catarata induzida

Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract

A catarata é a principal causa de cegueira no mundo 1. A Organização Mundial de Saúde define catarata como uma turvação da lente do olho, o que impede a transferência da luz. A catarata é uma doença multi-factorial associada com diabetes, o tabagismo, radiação ultravioleta (RUV), o álcool, a radiação ionizante, esteróides e hipertensão. Há evidências experimentais 2-4 e epidemiológica forte que 5,6 UVR provoca catarata. Foi desenvolvido um modelo animal para a RUV B catarata induzida em ambos com 7 anestesiados e não anestesiados animais 8. A única cura para a catarata é a cirurgia, mas este tratamento não é acessível a todos. Estimou-se que o atraso de aparecimento da catarata por 10 anos poderia reduzir a necessidade de cirurgia de catarata em 50% 9. Para atrasar a incidência de catarata, que é necessária para compreender os mecanismos de formação de catarata e encontrar estratégia de prevenção eficazgias. Entre os mecanismos para o desenvolvimento de cataratas, a apoptose desempenha um papel crucial na iniciação da catarata em humanos e animais 10. Nosso foco tem sido recentemente apoptose na lente como o mecanismo para o desenvolvimento de cataratas 8,11,12. Prevê-se que uma melhor compreensão do efeito da radiação UV sobre a via de apoptose proporcionará possibilidades para a descoberta de novos fármacos para prevenir a catarata. Neste artigo, nós descrevemos como catarata pode ser induzida experimentalmente pela exposição in vivo a RUV-B. Além disso RT-PCR e imuno-histoquímica estão apresentados como ferramentas para o estudo dos mecanismos moleculares de catarata induzida por radiação UV-B.

As várias fontes de variação nas medidas foram estimadas com uma análise de variância, e verificou-se que, considerando três medidas por animal da variância para as medições foi da ordem de 15% do que para os animais. Assim, tendo em vista a análise da lente inteira, não é possível aumentar a precisão. Testes ortogonal elucidado um contraste estatisticamente significativo para a caspase-3 de mensagem entre 120 intervalo de latência hr vs intervalos mais curtos de latência. In vivo i...

A catarata é a principal causa de cegueira no mundo. Radiação solar ultravioleta (UVR) é o principal fator de risco para o desenvolvimento de catarata. Um modelo animal de longe RUV-B catarata induzida foi desenvolvido. Neste artigo vamos descrever os métodos de investigação de formação de catarata: a exposição a raios ultravioletas, RT-PCR e imuno-histoquímica.

Caracterização de mecanismos moleculares de<em&gt; Em vivo</em&gt; RUV catarata induzida

A catarata é a principal causa de cegueira no mundo 1. A Organização Mundial da Saúde define a catarata como a opacificação do cristalino do olho, a qual...

Este vídeo demonstra um método para induzir cataratas utilizando radiação ultravioleta em ratos. Os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da catarata são posteriormente estudados por meio de PCR quantitativa em tempo real e imunocitoimunoquímica. Primeiramente, o olho de um rato é exposto à radiação ultravioleta para induzir a formação de catarata.O outro olho serve como controle. Em seguida, as lentes são dissecadas e processadas para obter RNA e avaliar os níveis de expressão da caspase 3 por PCR quantitativo em tempo real ou coradas com um anticorpo contra a caspase clivada 3 para avaliar a expressão e a localização da proteína ativa.Por fim, os resultados desses ensaios confirmam um aumento no mRNA da caspase-3 e na expressão da proteína ativa no núcleo das células do cristalino após exposição à radiação ultravioleta. A principal vantagem deste protocolo em relação aos métodos existentes é o uso de uma fonte única de radiação ultravioleta de banda estreita e um dispositivo universal de contenção de ratos, permitindo expor de forma segura e precisa os animais a um espectro e dose de UV bem definidos. Além disso, aplicamos técnicas biológicas modernas, como a R-T-P

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Uma demonstração formal da dissecação de um olho de rato, resultando em uma montagem de todo o epitélio pigmentar da retina.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

Melanina epidérmica é induzida pela aplicação tópica de forscolina em um modelo murino da humano sensível aos raios UV de pele clara. Manipulação farmacológica de níveis de cAMP na pele e escurecimento da epiderme proteger fortemente contra a inflamação mediada por UV (queimadura solar), como medido pela dose eritematosa mínima (DEM) de ensaio.

A indução farmacológica de melanina epidérmica e proteção contra queimaduras solares em um modelo humanizado Rato

Descreveremos um protocolo detalhado para o ensaio de mutação de cII Lambda selecione em culturas de células de roedores transgênicos ou correspondentes animais tratados com um agente químico/físico de interesse. Esta abordagem tem sido amplamente utilizada para testes de mutagenicidade de substâncias cancerígenas em células de mamíferos.

O Lambda selecione cII sistema de deteção de mutação

Este protocolo demonstra a detecção simultânea de espécies de oxigênio reativa (ROS), células vivas e células mortas em culturas primárias vivas de células superficiais do rato. 2',7'-Diclorofluoresceindiacetato, iodeto de propídio e coloração hoechst são usados para avaliar o ROS, células mortas e células vivas, respectivamente, seguidas de imagem e análise.

Avaliação de danos oxidativos nas células de superfície ocular/células-tronco do rato primário em resposta ao dano ultravioleta-C (UV-C)

Neste relato apresentamos um protocolo que permite ao investigador gerar um modelo de uveíte intraocular em camundongo. Mais comumente referido como uveíte autoimune experimental (EAU), este modelo estabelecido captura muitos aspectos da doença humana. Aqui, descreveremos como induzir e monitorar a progressão da doença usando várias leituras.

Uveíte Autoimune Experimental: Um Modelo de Rato Inflamatório Intraocular

Este artigo descreve os procedimentos utilizados para avaliar a toxicidade da radiação UV e toxinas químicas em uma linhagem celular primária e imortalizada.

Determinação da Toxicidade da Radiação UV e Produtos Químicos em Células Epiteliais Primárias e Imortalizadas da Córnea Humana

Modelos murinos podem ser ferramentas úteis para investigar a biologia do epitélio pigmentado da retina (EPR). Foi estabelecido que camundongos podem desenvolver uma série de patologias do EPR. Aqui, descrevemos um protocolo de fenotipagem para elucidar e quantificar patologias do EPR em camundongos usando microscopia de luz, elétron de transmissão e confocal.

Protocolo para Avaliação e Quantificação de Patologias do Epitélio Pigmentado da Retina em Modelos Murinos de Degeneração Macular Relacionada à Idade

Este método modela a cirurgia de catarata in vivo , removendo as células da fibra do cristalino de camundongos adultos e deixando para trás a bolsa capsular com células epiteliais do cristalino (LECs) anexadas. A resposta à lesão é então avaliada em vários momentos após a cirurgia usando critérios moleculares e morfológicos.

Modelagem de cirurgia de catarata em camundongos

O protocolo descreve um estudo dos efeitos sistêmicos e locais da exposição ao ultravioleta B na pele em camundongos.

Estudando a exposição crônica de camundongos à radiação ultravioleta B 

Detalhamos um novo infravermelho próximo de fluorescência cateter (NIRF) para 2-dimensional imagem intravascular molecular da biologia...

In vivo Near Infrared fluorescência de imagem intravascular (NIRF) Molecular da placa inflamatória, uma Abordagem Multimodal para imagem da Aterosclerose

Aprenda a induzir catarata em ratos usando radiação ultravioleta e analisar mecanismos moleculares com PCR em tempo real e imunohistoquímica. Este modelo animal é essencial para estudar cataractogênese.

Caracterização de mecanismos moleculares de

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