Caracterização de mecanismos moleculares de

Este vídeo demonstra um método para induzir cataratas utilizando radiação ultravioleta em ratos. Os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da catarata são posteriormente estudados por meio de PCR quantitativa em tempo real e imunocitoimunoquímica. Primeiramente, o olho de um rato é exposto à radiação ultravioleta para induzir a formação de catarata.

O outro olho serve como controle. Em seguida, as lentes são dissecadas e processadas para obter RNA e avaliar os níveis de expressão da caspase 3 por PCR quantitativo em tempo real ou coradas com um anticorpo contra a caspase clivada 3 para avaliar a expressão e a localização da proteína ativa.

Por fim, os resultados desses ensaios confirmam um aumento no mRNA da caspase-3 e na expressão da proteína ativa no núcleo das células do cristalino após exposição à radiação ultravioleta. A principal vantagem deste protocolo em relação aos métodos existentes é o uso de uma fonte única de radiação ultravioleta de banda estreita e um dispositivo universal de contenção de ratos, permitindo expor de forma segura e precisa os animais a um espectro e dose de UV bem definidos. Além disso, aplicamos técnicas biológicas modernas, como a R-T-P-C-R quantitativa e a imunohistoquímica, para estudar a apoptose no cristalino. Esse método pode fornecer informações sobre os mecanismos moleculares da catarata induzida por radiação ultravioleta.

Também pode ser aplicado a outros modelos experimentais, como cânceres de pele induzidos por radiação ultravioleta, neurociência comportamental em ratos e pesquisas oculares experimentais com foco na apoptose. Inicie este protocolo posicionando uma rata fêmea Sprague dawley anestesiada em um contenção para ratos e, sem comprimir o tronco, aperte os cintos até que o animal esteja imobilizado. Para induzir midríase ou dilatação da pupila, administre uma a duas gotas de uma solução de 10 miligramas por mililitro de cloridrato de tropicamida em cada olho.

Em seguida, aplique pomada no olho não exposto e proteja-o com fita preta para bloquear a radiação ultravioleta. A seguir, posicione o animal no restritor de forma que o olho descoberto fique posicionado para receber um feixe estreito de radiação ultravioleta em 300 nanômetros com largura total em meia altura de 10 nanômetros, gerado por uma lâmpada de mercúrio de alta pressão. Exponha a rata unilateralmente a uma dose sublimiar de um quilojoule por metro quadrado de UVRB durante 15 minutos após a exposição.

Remova a fita do olho não exposto e aplique pomada em ambos os olhos. Devolva o animal à sua gaiola e cubra-o com papel macio para mantê-lo aquecido. Monitore o animal até que ele recupere consciência suficiente para manter a decúbito esternal.

Em seguida, coloque o rato recuperado de volta em sua gaiola com os demais. 1, 5, 24 e 120 horas. Após a exposição, siga o seguinte procedimento.

Coloque o olho enucleado do rato eutanasiado com a córnea voltada para baixo e o lado posterior para cima sobre um tecido de papel macio. Em seguida, trabalhe sob um microscópio estereoscópico. Use uma cânula de calibre 27 para fazer um orifício mínimo, empurrando tangencialmente à esclera para evitar danificar a lente, que está muito próxima da esclera.

Em seguida, usando um par de tesouras para cirurgia oftálmica, corte circunferencialmente logo atrás da córnea até que a porção posterior da esclera possa ser levantada. Depois, com pinças curvas rombudas, levante a lente, coloque-a em uma solução salina balanceada e remova os remanescentes do corpo ciliar da lente. A lente não deve permanecer na solução salina balanceada por mais de 10 minutos.

Após a dissecação, coloque uma lente em um tubo microcentrífuga de dois mililitros contendo 350 microlitros de RA, um tampão de lise do kit de isolamento de RNA total Nucleo Spin RNA Two e 3,5 microlitros de beta-mercaptoetanol. Incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, use uma agulha para homogeneizar mecanicamente a lente até que apenas o núcleo duro permaneça. O córtex e a cápsula da lente serão lisados pelo tampão de lise.

Remova o núcleo da mistura e descarte-o. Armazene as amostras imediatamente a 70 graus negativos Celsius. As amostras podem ser armazenadas por até um ano quando estiverem prontas para prosseguir.

Colete as amostras e purifique o RNA de acordo com o protocolo de RNA total, purificação de células cultivadas e tecidos do kit. Armazene as amostras de RNA a menos 70 graus Celsius. Para verificar a remoção suficiente de DNA de cada amostra, amplifique o DNA utilizando primers específicos para DNA P53 nas seguintes condições.

Passo 1: 95 °C por dois minutos. Passo dois, por 40 ciclos: 95 °C por 20 segundos. 55 °C por 20 segundos.

72 graus Celsius por 20 segundos. Etapa 3: 72 graus Celsius por sete minutos. Após a conclusão da corrida, eletroforese os produtos em um gel de agarose 1,5%.

Para detectar o produto específico de PCR no DNA de 243 pares de bases, certifique-se de incluir amostras controle positivo e negativo. Se o DNA tiver sido removido com sucesso, os produtos de PCR não serão visualizados. Uma banda só deverá ser observada na trilha do controle positivo, utilizando o espectrofotômetro NanoDrop para medir a concentração das amostras de RNA e determinar a razão de RNA para proteína.

Se a razão entre RNA e proteína, com base na absorbância da amostra de RNA ou na razão 260/280, for 2,0 ou superior, a amostra de RNA é pura. Em seguida, utilizando um micrograma de RNA, sintetize o cDNA usando um kit de síntese de cDNA de primeira fitante para RT-PCR; armazene as amostras de cDNA a -20 graus Celsius. A seguir, para realizar a PCR quantitativa em tempo real, aplique as amostras em triplicata em uma placa de 96 poços.

Cada poço deve conter um microlitro de amostra de CD NNA combinado com a mistura mestra do ensaio de expressão gênica TAC man para caspase três em uma placa separada. Aplique as mesmas amostras, mas utilizando o ensaio de expressão gênica TAC man para 18 s. Em seguida, para gerar uma curva padrão para análise, faça diluições em série de um microlitro de cDNA de três lentes não expostos escolhidos aleatoriamente.

Realize diluições seriadas juntamente com o cDNA das amostras. Em uma placa de 96 poços, em cada placa. Centrifugue a placa, depois a execute em um termociclador I cycler my iq, sistema de detecção em tempo real com um único corante.

Após a execução, utilizando o software my IQ. Estabeleça uma curva padrão expressando o número de ciclos no limiar como uma função da concentração relativa do calibrador para as diluições seriadas em cada placa. Utilize a curva padrão para determinar a concentração relativa do cDNA da amostra medida usando o número de ciclos no limiar para cada amostra.

Por fim, determine o nível de expressão dos genes-alvo relacionando a concentração relativa do cDNA alvo ao cDNA do controle interno 18 s. Para realizar a coloração imuno-histoquímica, dissecione o olho e coloque-o em PBS após a dissecção. Transfira o olho para um tubo contendo paraformaldeído a 4%, incubando no gelo por 20 minutos.

Usando uma micropipeta, remova o paraformaldeído. Em seguida, transfira o olho para um tubo eppendorf de dois mililitros contendo um mililitro de PBS gelado e incube por 20 minutos em gelo. A seguir, transfira o olho para um tubo eppendorf contendo sacarose a 30%.

Incube a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use pinças para transferir o olho para um copo contendo meio de temperatura de corte ideal ou meio OCT. Posicione o olho em posição reta para o corte em seções.

Em seguida, coloque o copo sobre gelo seco para congelar e armazenar a menos 70 graus Celsius até o uso, para seccionar o olho e análise por microscopia de fluorescência. Comece posicionando o olho embutido em OCT sobre uma porta-objetos no criostato para crioseccionamento. Tente alinhar o lado mais plano da lente do olho paralelamente à borda da lâmina.

Corte três seções médio-sagitais com espessura de cinco mícrons a partir de uma porção central de cada lente. Descarte pelo menos seis seções entre seções sequenciais para evitar corar os mesmos núcleos em seções diferentes. Após o corte de uma seção, coloque suavemente uma lâmina em cima dela.

A seção deve então aderir à lâmina. Deixe as lâminas secarem ao ar antes do uso. As lâminas podem ser armazenadas a menos 70 graus Celsius até o momento de serem usadas para coloração.

Deixe as lâminas retornarem à temperatura ambiente. Em seguida, realize a coloração com anticorpo para identificar a fase três do CAS clivado conforme descrito no documento anexo dentro de algumas horas e examine as lâminas em um microscópio de fluorescência. Conte todos os núcleos das células epiteliais do cristalino.

Registre o número de todos os núcleos epiteliais do cristalino contando as células coradas com DAPI e o número de núcleos positivos para caspase três contando a caspase ativa. Três células marcadas. Conte as células três vezes para cada seção.

A caspase 3 é uma protease principal na fase de execução da apoptose. Microscopia eletrônica de transmissão. Estudos indicam que a radiação ultravioleta induz apoptose no cristalino.

Estudos experimentais sobre apoptose confirmam que a caspase três é um marcador confiável de apoptose. Para determinar se a exposição in vivo à radiação ultravioleta (UVR) induz a expressão da caspase três, a expressão de mRNA na lente cristalina foi medida por QPCR em 1, 5, 24 e 120 horas após a exposição in vivo a um quilojoule por metro quadrado de UVR a 300 nanômetros. A razão média de CASP três, mRNA para 18S-rRNA, entre a lente exposta e a lente contralateral não exposta, foi então representada graficamente para cada ponto temporal.

Esta figura mostra a expressão do mRNA da caspase três ao longo do tempo e demonstra a transcrição da apoptose. O marcador caspase três na lente in vivo após exposição ao teste ortogonal de radiação ultravioleta distante resultou em um contraste estatisticamente significativo no sinal de mRNA da caspase três entre o intervalo de latência de 120 horas e intervalos de latência mais curtos. A expressão da caspase três em uma lente exposta e não exposta também foi comparada por microscopia de imunofluorescência, conforme mostrado nestas imagens 24 horas após a exposição, em que os núcleos estão marcados, indicando a presença da caspase três ativa.

Este método de imunomarcação fornece informações valiosas sobre a distribuição espacial de células epiteliais marcadas com o marcador de apoptose caspase três no cristalino. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir experimentalmente a catarata por V-V-U-V-R e estudar o mecanismo molecular da catarata induzida por cinco UVR, utilizando PCR quantitativo e imunohistoquímica.