Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Este experimento demonstra a eletroporação in ovo do mesencéfalo de embriões de galinha para estudar o efeito da expressão gênica exógena no desenvolvimento do mesencéfalo e na diferenciação de neurônios dopaminérgicos. Primeiro, injete o mesencéfalo de embriões de galinha estágio 11 de Hamburger-Hamilton com o plasmídeo de DNA desejado, a fim de direcionar especificamente o DNA exógeno para a vesícula em desenvolvimento do mesencéfalo. Em seguida, utilizando eletrodos pequenos personalizados, eletropore a vesícula do mesencéfalo para entregar o DNA exógeno especificamente aos progenitores neurais do mesencéfalo.

Em seguida, colete embriões no estágio 23 com boa expressão de M cherry no mesencéfalo e gere cortes transversais ideais do mesencéfalo. Em última análise, a análise de imunomarcação para marcadores de neurônios dopaminérgicos, como a tirosina hidroxilase, pode demonstrar a diferenciação de progenitores neurais em neurônios dopaminérgicos maduros induzida pela expressão de genes de interesse. A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos existentes de eletroporação in ovo é que este protocolo pode alcançar uma eletroporação específica da membrana para estudar a diferenciação de neurônios dopaminérgicos.

Embora este método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento do mesencéfalo, ele também pode ser aplicado a outras partes do sistema nervoso para realizar análises de mapeamento de linhagem e para investigar a regulação da expressão gênica. Para obter embriões na fase 11 de Hamburger-Hamilton, posicione cada ovo fertilizado de lado e marque o topo com um traço de lápis. Em seguida, coloque as bandejas sobre um agitador em um incubador umidificado previamente aquecido.

Verifique a umidade e o nível de água a cada 24 horas, 41 horas após a fertilização. Remova os ovos da incubadora e armazene à temperatura ambiente. Limpe a superfície de cada ovo com etanol 70% e seque.

Agora posicione dois pedaços de fita adesiva transparente de quatro centímetros lado a lado sobre um ovo, formando um retângulo grande sobre o traço feito a lápis. Alise a fita contra o ovo para moldar a janela com uma seringa de 10 mililitros acoplada a uma agulha de 18 polegadas. Fure a casca do ovo inclinando a agulha para longe da gema, de modo a não perturbar nem danificar o embrião.

Retire cinco mililitros de albúmina do ovo. Limpe a agulha com etanol 70%. Seque a agulha antes de perfurar o próximo ovo.

Insira as configurações para o puxador de micropipetas marrom flamejado. Em seguida, puxe tubos capilares de parede fina para agulhas de injeção com uma pipeta P 10. Aspire de cinco a dez microlitros de solução de plasmídeo em uma ponteira capilar de ponta longa.

Em seguida, carregue lentamente a agulha de vidro em uma coluna contínua, na ausência de bolhas de ar. Coloque a agulha carregada no porta-agulhas acoplado ao micromanipulador e microinjetor. Agora, sob um microscópio estereoscópico, utilizando um fundo escuro para melhor visualizar a agulha, corte a agulha no ponto em que o líquido verde termina, usando tesoura de mola.

Corte uma janela de dois a dois centímetros e meio de diâmetro a partir do orifício anterior da agulha. Para extrair a albumina. Gire o ovo com uma das mãos enquanto corta.

Lembre-se de limpar a tesoura com um lenço de papel descartável saturado com etanol 70% entre um ovo e outro. Prossiga para observar o embrião de galinha sob um microscópio estereoscópico. Se necessário, visualize o embrião injetando tinta da Índia 20% filtrada em 0,22 micrômetro em PBS sob o embrião de galinha. Posicione o embrião paralelamente ao trajeto da agulha, com a cabeça voltada para longe da agulha.

Fure lentamente o tubo neural com um ângulo de 45 graus na junção entre o mesencéfalo e o rombencéfalo. Inicie a injeção com os microinjetores pico spritzer configurados com duração de 25 milissegundos. Ajuste o tempo conforme necessário, preenchendo apenas a vesícula neural que representa o mesencéfalo com DNA plasmidial contendo corante verde rápido.

Após recuperar a agulha de injeção, coloque três gotas da solução de penicilina-estreptomicina sobre o embrião. Verifique as configurações do eletroporador B-T-X-E-M-C oito 30 para uma eletroporação eficiente. Na posição do mesencéfalo ventral, posicione os pequenos eletrodos de platina em formato de L, personalizados, no mesmo nível horizontal do fundo do tubo neural, de modo que o mesencéfalo embrionário fique centralizado entre os dois eletrodos.

Pressione o interruptor de pedal BTX uma vez e observe as bolhas de ar geradas ao redor dos eletrodos. Após cada eletroporação bem-sucedida, remova cuidadosamente os eletrodos do ovo e limpe os eletrodos. Com uma toalha umedecida em etanol 70%, coloque outras três gotas da solução de penicilina-estreptomicina sobre o embrião.

Agora cubra a janela com um pedaço de fita adesiva transparente de cinco centímetros por cinco centímetros. Sem tocar no conteúdo do ovo, feche bem o ovo e coloque os ovos de volta no incubador com as plataformas giratórias desligadas. Quando o estágio desejado for alcançado, colete os embriões vivos em uma placa de Petri comum contendo PBS para cada condição.

Em seguida, um microscópio de dissecação fluorescente. Analise os embriões colhidos quanto à expressão de mCherry e transfira os embriões positivos para poços individuais de uma placa de 24 poços. Adicione a cada poço um mililitro de paraformaldeído a 2%, recém-preparado, e incube por três horas a quatro graus Celsius.

Lave os embriões fixados em PBS 3 vezes, colocando os embriões em sacarose 15% até que afundem após a equilibração. Repita a equilibração em sacarose 30%, depois incorpore cada embrião em OCT, orientando adequadamente os embriões para gerar cortes transversais ótimos do mesencéfalo para análises subsequentes.

Prepare cortes criostáticos de 18 mícrons de espessura do mesencéfalo espesso para análises posteriores no ensaio de eletroporação in ovo no mesencéfalo de embrião de galinha. Embriões de galinha estágio 11 são injetados com um coquetel de plasmídeos contendo o marcador fluorescente m-cherry, genes de interesse e um rastreador corado com verde rápido para acompanhar o processo de injeção. Após a eletroporação do mesencéfalo, os embriões são incubados por mais tempo e os embriões positivos para m-cherry são coletados, fixados e embutidos.

Em seguida, são preparadas seções criostáticas do mesencéfalo. As amostras são analisadas por imunomarcação com marcadores do mesencéfalo, como a tirosina hidroxilase, em embriões de galinha injetados e eletroporados com sucesso. A expressão de m-cherry é tipicamente visível na região do mesencéfalo após desenvolvimento adicional, utilizando a expressão de m-cherry como marcador de injeção.

Os embriões que exibem expressão adequada de m cherry são então fixados, incluídos e orientados para preparar cortes criostáticos do mesencéfalo. Aqui, a especificação do destino dopaminérgico em progenitores neurais eletroporados é examinada pela colocalização de m cherry e do gene marcado com flag com o marcador de neurônio dopaminérgico tirosina hidroxilase. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como restringir regionalmente a expressão gênica aos progenitores de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo embrionário, incluindo como injetar construtos de DNA especificamente na região do mesencéfalo e como realizar a eletroporação com precisão utilizando eletrodos pequenos e personalizados seguindo este procedimento.

Outros métodos, como o bloqueio mediado por RNI ou a expressão de potenciadores ligados a genes repórter, podem ser utilizados para estudar a função gênica e a regulação gênica em regiões específicas e tipos celulares do sistema nervoso.