Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um In Vitro Sangue Cérebro Modelo Barreira

O objetivo geral deste procedimento é obter um cultivo homogeneizado de células endoteliais cerebrais imortalizadas. Isso é realizado primeiramente isolando os cérebros de camundongos neonatos e obtendo uma suspensão simples de células. O segundo passo é imortalizar as células com o antígeno T médio do poliomavírus.

Em seguida, as células crescem por cerca de quatro semanas até que uma monocamada endotelial homogênea seja formada. O passo final é caracterizar a nova linhagem celular utilizando técnicas como imunomarcação, Western blot e Q-Q-P-C-R. As implicações dessa técnica estendem-se a terapias para distúrbios cerebrais neuroinflamatórios ou isquêmicos, pois podem ser obtidas avaliações pré-clínicas de terapias e insights sobre a fisiopatologia.

Quem demonstrará o procedimento será a Dra. Elaine Salvador, pós-doutoranda do meu laboratório. Após remover o cérebro de um camundongo neonato com idade entre três e cinco dias e transferi-lo para uma placa de Petri contendo tampão A, são necessários os cérebros de cinco a dez camundongos para cada preparação, enquanto se trabalha em uma cabine de fluxo laminar. Remova o cerebelo, o tronco encefálico, as meninges e os fragmentos de capilares de cada cérebro.

Em seguida, transfira os cérebros para uma segunda placa de Petri contendo o tampão A. Use um bisturi estéril para cortar os cérebros em pequenos pedaços e, então, use uma pipeta de 10 mililitros para aspirar e expelir o tecido e o tampão até que não haja mais agregados visíveis. Neste momento, transfira a suspensão para um tubo cônico de 50 mililitros após centrifugar o tecido cerebral a 250 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e dissolva o pellet em 4,5 mililitros de tampão A com 1,5 mililitro de 0,75% peso por volume.

Colagenase dis pace. Incube o tecido e a solução de colagenase por 45 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação ocasional. Enquanto isso, prepare as placas de cultura de tecidos revestindo quatro poços de uma placa de 12 poços com uma solução estéril de 0,1 miligramas por mililitro.

O colágeno quatro e o ácido acético 50 milimolar permitem que o colágeno adira às cavidades à temperatura ambiente durante uma hora. Após o período de incubação de 45 minutos, interrompa a digestão do tecido cerebral adicionando 15 mililitros do tampão A e re-suspenda completamente o pellet nesta solução. Em seguida, centrifugue a 250 vezes G durante 10 minutos e descarte o sobrenadante.

Em seguida, para remover a mielina do preparo, adicione 10 mililitros de BSA estéril a 25% peso por volume em PBS ao tecido e centrifugue a 1000 ×g por 20 minutos a 4 °C. Após a centrifugação, descarte cuidadosamente o sobrenadante e dissolva o precipitado em 15 mililitros do tampão A, transfira para um novo tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue novamente a 250 ×g por cinco minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, lave a placa revestida com colágeno tipo IV duas vezes com PBS.

Após a segunda lavagem, deixe dois dos poços vazios e adicione dois mililitros de meio de crescimento nos outros dois poços. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular, composto principalmente por células endoteliais, em quatro mililitros de meio de crescimento contendo quatro microgramas por mililitro de puromicina, e plaque dois mililitros da suspensão celular em cada um dos dois poços vazios revestidos com colágeno. Incube a 37 graus Celsius por 45 minutos para eliminar as células não endoteliais que aderem rapidamente. Em seguida, aspire o meio de crescimento dos dois poços que não contêm células e descarte-o.

Em seguida, transfira o meio contendo as células não aderidas, que inclui a fração de células endoteliais, para estes dois poços. Reponha os poços anteriores com dois mililitros de meio fresco. Esses poços contêm outros tipos celulares, como fibroblastos e astrócitos, e podem ser cultivados em paralelo e utilizados para comparações da morfologia.

Incube as células durante a noite no incubador de cultura de tecidos no dia seguinte. Substitua por meio fresco e cultive os fibroblastos GPE neo, que secretam um vírus com deficiência de replicação contendo o oncogene T médio do poliomavírus em frascos revestidos com gelatina contendo GPE neomed. A transfeção com o oncogene T médio do poliomavírus confere vantagem de crescimento às células endoteliais em relação às células não endoteliais, resultando em uma monocamada homogênea de células com morfologia endotelial. Após quatro a seis semanas de cultivo, as células GPE neo não estão comercialmente disponíveis e podem ser obtidas como material público compartilhado.

Após cultivar o GPE Neo Fiberblast por 24 horas, remova 10 mililitros do meio e adicione solução estéril de poli-cérebro até uma concentração final de oito microgramas por mililitro. Passe a mistura do sobrenadante por um filtro de 0,45 mícron para remover quaisquer fragmentos celulares. Agora aspire o meio das culturas de células endoteliais e adicione dois mililitros da mistura de sobrenadante com poli-cérebro aos poços após incubação durante a noite.

Repita este procedimento no dia seguinte com uma nova alíquota da mistura poli cérebro do sobrenadante no dia seguinte. Remova a mistura poli cérebro do sobrenadante. Lave as células duas vezes com PBS e, em seguida, adicione meio de crescimento fresco.

Continue a trocar o meio de crescimento a cada três dias quando as células atingirem a confluência. Passe as células de um para dois em placas revestidas com colágeno. Quatro placas revestidas. Linhagens estáveis de células endoteliais cerebrais são tipicamente obtidas após quatro a cinco semanas de cultivo subsequente.

Quando uma monocamada homogênea de células endoteliais preencher todo o poço. Uma vez obtidas as linhagens celulares estáveis, transfira para frascos de cultura de tecidos revestidos com colágeno IV e realize a passagem das células não mais do que uma vez por semana com três mililitros de tripsina EDTA e incubação a 37 graus Celsius por cinco a 15 minutos, até que a camada celular esteja dispersa. Após a adição de cinco mililitros de meio, semeie os novos frascos, evitando divisão maior que 1:4.

Quando houver células suficientes para obter um frasco T 75 confluente, podem ser preparados crioviales com as células para uso posterior. Para isso, colha as células com tripsina como antes, em seguida centrifugue a suspensão celular a 250 vezes G durante cinco minutos. À temperatura ambiente, re-suspenda o pellet celular em seis mililitros de meio de congelação e, então, pipete 1,5 mililitro da suspensão celular para dentro de quatro crioviales.

Coloque os tubos de criopreservação em um recipiente de congelação Nalgene cheio com isopropanol e mantenha-os por um dia a menos 80 graus Celsius. Finalmente, armazene os tubos de criopreservação em nitrogênio líquido. Incube o criotubo de células em banho-maria, e então transfira-as para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio de crescimento.

Pré-aqueça o meio a 37 graus Celsius e centrifugue o tubo a 250 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após aspirar o meio, ressuspenda o pellet em um volume apropriado de meio de crescimento. Transfira a suspensão celular para um frasco de cultura celular T 25 revestido com colágeno IV contendo meio de crescimento pré-aquecido.

A densidade celular para semeadura deve ser de pelo menos um vezes 10 à quarta células por mililitro. Troque o meio no dia seguinte e continue a repicar as células como antes, quando as células atingirem confluência cerca de cinco dias depois; quando estiverem prontas, semeie as células na densidade desejada para seus experimentos subsequentes. As células da extremidade C foram caracterizadas por imunomarcação de marcadores endoteliais e da barreira hematoencefálica.

Esta imagem mostra a morfologia das células C e a imunomarcação para a clain cinco. As células C possuem uma morfologia semelhante à de culturas primárias de ECS cerebrais, com monocamadas de células alongadas e justapostas que exibiram inibição de crescimento. Na confluência, as células expressaram níveis detectáveis de clain.

Aqui, as células CN do cóclea foram imunomarcadas com um anticorpo contra a ocludina. Aqui observamos a expressão das proteínas VE-caderina, que estão localizadas nas junções entre células, novamente demonstradas por marcação de imunofluorescência. A resistência elétrica transendotelial foi medida utilizando um conjunto contendo eletrodos de passagem de corrente e medição de voltagem.

Pode-se observar nesta figura que a resistência elétrica transendotelial de células C end aumenta com o tempo em cultura após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem distúrbios cerebrovasculares em um modelo murino.