Name: Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um In Vitro Sangue Cérebro Modelo Barreira (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprenda a gerar linhas celulares endoteliais cerebrais imortalizadas de camundongos neonatos usando antígeno T médio de polioma. Este método padronizado facilita pesquisas sobre distúrbios neuroinflamatórios e isquêmicos.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG sob o número concessão FO 315/4-1 e SFB DFG 688.

1. Isolation of Brain microvasos <ol><li> Para cada preparação utilizar 5-10 ratinhos neonatais de ambos os sexos (3-5 dias de idade). </li><li> Euthanize um rato de acordo com locais IACUC / veterinário recomendações, remover o cérebro imediatamente, e transferir para um prato de Petri contendo a solução seguinte: 15 mM de Hepes (pH 7,4), 153 mM de NaCl, 5,6 mM de KCl, 2,3 mM CaCl 2 x 2H 2 O, 2,6 mM MgCl 2 x 6H 2 O, 1% (w / v) BSA (daqui em diante referido como tampão A). </li><li> Salvo indicação em contrário, todos os procedimentos de isolamento deve ser efectuado à temperatura ambiente (RT) (22-24 ° C), sob a câmara de fluxo laminar. Cortar o cérebro (cérebro sem cerebelo e tronco cerebral), após remoção das meninges e fragmentos capilares, em tampão A, utilizando um bisturi esterilizado. Pipetar o tecido fragmenta cima e para baixo usando uma pipeta de 10 ml até não aglomerados aparecer. Transferir a suspensão para um tubo Falcon de 50 ml e centrifugar a 250 xg durante 5 min à TA. </li></ol> Nota: Meninges pode ser identificado como membranas finas, transparentes na superfície do tecido cerebral. Eles podem ser removidos cuidadosamente com uma pinça estéril. <ol start="4"><li> Descartar o sobrenadante. </li><li> Dissolve-se o sedimento em 4,5 ml de tampão A com 1,5 ml de 0,75% (w / v) de colagenase / dispase (Roche) e incubar durante 45 min a 37 ° C num banho de água (ocasionalmente agitação). </li><li> Ao mesmo tempo, preparar as placas de 12 poços por revestimento de quatro poços com colagénio IV (0,1 mg / ml dissolvido em 50 mM de ácido acético). Deixa-se aderir durante 1 hora. </li><li> Parar a digestão através da adição de 15 ml de tampão gelado A. Ressuspender o pellet cuidadosamente. </li><li> Centrifugar a suspensão a 250 xg durante 10 min a RT. </li><li> Descartar o sobrenadante. </li><li> Para remover a mielina, adicionam-se 10 ml de 25% (w / v) de BSA (Sigma, pureza&gt; 98%) e centrifuga-se a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. 25% de BSA deve ser dissolvido em 1x PBS (PAA Laboratories) e filtrada através de 0,2 f ^ Milter). </li><li> Cuidadosamente descarte do sobrenadante, dissolve-se o sedimento em 10 mL de tampão A e transferir para um tubo Falcon novo. </li><li> Centrifugar a suspensão a 250 xg durante 5 min à TA. O sedimento resultante contém as células endoteliais. </li><li> Lavar duas vezes o colagénio IV revestido placa de 12 poços com PBS. </li><li> Ressuspender o sedimento em 4 ml de meio de crescimento (DMEM contendo FCS a 10%, 50U/ml de penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina) e de placa de suspensão celular em dois poços, 2 ml em cada poço. Adicionar a puromicina a uma concentração final de 4 | ig / ml e incubar durante 45 min a 37 ° C numa incubadora de cultura de células. Este passo permite a remoção de células aderentes rapidamente Nota:. Puromicina é adicionado, durante 24 horas. Apenas o cérebro ECs podem metabolizá-la, para outros tipos de células puromicina é tóxico 14. </li><li> Transferir o meio de 2 ml, contendo células não aderentes a partir da etapa 1,14 em dois poços frescas (estes poços contêm a fracção CE). Encher os poços com células aderidas de step 1,14 com 2 ml de meio fresco (estes poços conter outros tipos de células, por exemplo, f ibroblastos, astrócitos e podem ser cultivadas em paralelo e utilizado para comparação da morfologia). </li><li> Alterar o meio no dia seguinte. </li></ol> 2. Imortalizando o cérebro células endoteliais microvasculares <ol><li> Cultivar a GP + E-86 (Neo GPENeo) 15 fibroblastos, que segregam um vírus deficiente em replicação com polioma oncogene T em meio DMEM contendo 10% de FCS inactivado pelo calor, 50U/ml de penicilina / estreptomicina e 2 mg / ml de G418 ( . PAA Laboratories) em frascos revestidos de gelatina Nota: Polyoma meio de transfecção oncogene T faz com vantagem o crescimento de células endoteliais sobre os não-CEs que conduz a uma monocamada homogénea de células com morfologia endotelial 4 a 6 semanas de cultura. GPENeo não estão disponíveis comercialmente e pode ser obtido como material público compartilhado (consulte publicações originais 4,16). </li><li> Para usar o meio contendo vírus para<html> imortalização, cultivar as células GPENeo em meio isento de G418 por 24 h. </li><li> Remover 10 ml do sobrenadante e adicionar GPEneo Polybrene (brometo Hexadimetrina) (Sigma) a uma concentração final de 8 mg / ml, esterilizar por filtro de 0,45 um para remover os fragmentos celulares. </li><li> Remover o meio de crescimento das culturas da CE preparados na Parte 1 e juntar 2 ml de sobrenadante GPEneo mistura / Polybrene nas cavidades. Repetir no dia seguinte utilizando um fresco GPEneo mistura sobrenadante / Polybrene Nota:. Polybrene é usado para fazer os poros na parede da célula para facilitar a infecção com as partículas virais). </li><li> Remover o sobrenadante GPEneo mistura / Polybrene no dia seguinte, lava-se as células duas vezes com PBS e manter as células em meio de crescimento em mudança a cada 3 dias. Após confluência, as células divididas 1:2 no colagénio IV placas revestidas. </li><li> Tipicamente, estáveis ​​endoteliais cerebrais linhas (CEND) células devem ser obtidas 4-5 semanas mais tarde. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Cultivando as células cerebrais microvasculares endoteliais <ol><li> Descongelar as células de cryoaliquot em banho de água e transfere-se 15 ml-Falcon com 10 ml de meio de pré-aquecido. </li><li> Centrifugar a suspensão a 250 xg durante 5 min à TA. </li><li> Remover meio, transferir o sedimento em a revestido de colagénio IV T 25 cm2 frasco de cultura de células pré-aquecida com meio de crescimento (densidade celular para revestimento deve ser de pelo menos 1 x 10 4 células / ml). </li><li> Alterar meio no dia seguinte e depois de as células alcançaram a confluência (normalmente após 5 dias) dividir as células. </li></ol> 4. A divisão de células-CEND (Nota: A divisão deve ser feita apenas uma vez por semana, evitar a divisão Superior 1:4). <ol><li> Remover meio, lavar as células com PBS. </li><li> Adicionar 3 ml de tripsina-EDTA aquecido solução (PAA Laboratories) (T 75 cm2 do frasco), incubar a 37 ° C e esperar até que as células da camada é dispersa (geralmente dentro de 5 a 15 min). </li><li> Adicionar 5 ml omeio de crescimento f, pipetar cima e para baixo, e transferir para um novo colágeno IV revestido frasco. </li></ol> 5. A congelação das células CEND <ol><li> Obter a suspensão de células, tal como descrito no passo 4 </li><li> Centrifugar a suspensão a 250 xg durante 5 min à TA. </li><li> Ressuspender o sedimento de células (obtidas a partir de 1 75 centímetros T 2 frasco) em 6 ml de meio de congelação (95% de meio de crescimento, 5% DMSO). </li><li> Dividir a suspensão de células em 1,5 ml de quatro crio-se alíquotas Nota:. Uma alíquota de crio-podem ser semeadas no frasco T 25 cm 2. </li><li> Armazenar os crio-alíquotas sob vapor de nitrogênio líquido a temperatura. </li></ol> CEND meio de crescimento: 450 ml de DMEM, FCS a 10%, 10 ml de L-glutamina, 2% de MEM-Kit, 2% de NEAA, 10 piruvato natrium ml, 50 U / ml de penicilina / estreptomicina 6. Resultados representativos As células CEND cerebEND e foram caracterizados por imunomarcações de um endotelialnd BBB marcadores, bem como por meio de medições de resistência eléctrica transendotelial (TEER) e permeabilidade. O CEND cerebEND e tinha uma morfologia semelhante à de culturas primárias de cérebro ECs, com as monocamadas de células compactadas alongadas que exibiram inibição de crescimento a confluência. As células expressaram níveis detectáveis ​​de bem claudina-5 occludin e VE-caderina proteínas que estavam localizados nas junções célula-célula, como se mostra por meio de imunofluorescência (Figura 3) 4,5. A cultura de células em soro CEND reduzida meio conduziu a um aumento na TEER (de 150 Ωcm 2 na presença de 10% de soro a 500 Ωcm 2 na presença de 2% de soro), que foi potenciada pela adição de hidrocortisona (800 Ωcm 2), ou a insulina (1.000 Ωcm 2) 4. As monocamadas de CEND cultivadas em soro reduzido, médio, durante 21 dias teve TEER de 900 Ωcm 2 (Figura 4). TEER foi medida utilizando um conjuntocontendo eletrodos atual passes e tensão de medição (Instrumentos de Precisão mundo). Para comparação, o primário microvascular cerebral ECs tem sido relatada a ter valores de TEER 200-600 Ωcm 2 e uma linha celular de ratinho comercialmente disponíveis bEnd.3 tinham valores de TEER 100-140 Ωcm 2 (para revisão recente veja Abbot 2005 e Toth et al., 2011 17,18). Além disso, a passagem de macromoléculas, tais como a não-carregada de FITC-dextrano de massas moleculares 4, 10, 70 e 500 kDa, ou de fluoresceína (300 Da) através da monocamada de CEND em meio de 2% de FCS a diferenciação ao longo de 4 horas foi reduzida em comparação com as células de controlo mantidas em meio de crescimento contendo FCS a 10%: fluxo paracelular foi reduzida para 30% das células de controlo para a fluoresceína, a 26% para FITC-dextrano 10 e 70 kDa, e de fluxo foi reduzido para 4,5% de células de controlo de FITC -dextrtan 500 kDa. Semelhante a TEER valores, a permeabilidade era no nível mais baixo, em que as células cultivadas na presença de glicocorticoids 4 (GC). Em outros estudos, identificamos os genes alvo de glicocorticóides, occludin, claudina-5 e VE-caderina no endotélio vascular cerebral 4,7,9. GC tratamento conduziu a um aumento na expressão destas proteínas e para o rearranjo de VE-caderina com o citoesqueleto. O regulamento GC-mediada direta da junção apertada proteínas occludin e claudina-5 aparece através de elementos de resposta GC em suas regiões promotoras 4,7,19. Além disso, claudina-5 foi identificado como um alvo em estrogénio novel vascular endotélio 10. Endoteliais subjacente disfunção muitas doenças diferentes. Nós cultivadas sob o CEND oxigênio / glicose privação (POG) condições. OGD levou à interrupção da função BBB, o que pode ser reconstituído após o tratamento combinado com o inibidor de proteassoma GC e bortezomib 12. OGD condições levou a um forte aumento da captação de glicose e na expressão de Transpor glucoseters em cerebEND, que pode ser atenuado pela adição de MK801, um inibidor não competitivo de NMDA do receptor-13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> Figura 1. Morfologia das células endoteliais microvasculares cerebrais (CEND) uma semana após o isolamento. Imagens de microscopia de luz foram tomadas sob a 6x (A) e 15x de ampliação (B). As colónias formadas ilha de células endoteliais são visíveis. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> Figura 2. Morfologia do cérebro células endoteliais microvasculares (CEND) um mês após o isolamento e imortalização. Imagens de microscopia de luz foram tomadas sob a ampliação 15x. A confluentes, monocamada de células endoteliais homogénea pode ser observado. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> Figura 3. Microvascul cérebro imortalizadoar as células endoteliais expressam claudina-5, occludin e VE-caderina. CEND células foram cultivadas em colagénio IV revestidos lamelas e coradas com anticorpos contra claudina-5 (A), occludin (B) e VE-caderina (C). As imagens foram feitas usando um microscópio Zeiss Axioscop2 sob a ampliação 40x. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> Figura 4. Medição da resistência eléctrica transendotelial (TEER) das CEND monocamada. CEND foram cultivadas em filtros de colagénio IV revestidos Transwell (tamanho de poro de 0,4 um). Depois de atingir a confluência, as células foram mantidas em meio contendo FCS a 2%. TEER foi medido após 7, 14 e 21 dias por meio de um conjunto que contém os eléctrodos de corrente e de tensão de passagem de medição.

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<li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin%2C+an+endothelial+anticoagulant+protein%2C+is+absent+from+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362(1986).</li>
<li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540(2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O processo descrito pode ser utilizado para o isolamento de microvascular CEs a partir de diferentes estirpes de ratinho, bem como a partir de diferentes estirpes de ratinho knock-out para estudar as alterações específicas na função do endotélio vascular. Como um método de imortalização utilizou-se a transformação com oncoproteína de poliomavírus murino, Polioma meio antigénio T. Ele transforma rapidamente imaturos células endoteliais in vivo e in vitro 20,21,22. Outros métodos de imortalização das células endoteliais descritos na literatura incluem, por exemplo, a imortalização com antigénio T grande de SV40 do Simian Virus vacuolar 40 23, o produto do gene E1A do adenovírus 24 ou sobre-expressão da subunidade catalítica da telomerase humana 3. A imortalização com PymT é específico para a ECs murino imaturo, que permite a obtenção de uma cultura CE homogénea a partir de ratinhos neonatais em curto espaço de tempo. Imortalização altera as propriedades das células e poos resultados obtidos com os e linhas celulares imortalizadas, deve ser comparada com as células primárias ou com as experiências in vivo com ratinhos. PymT CE imortalizada foi descrito para expressar níveis elevados de actividade fibrinolítica resultantes de aumento da produção de activador do plasminogénio tipo urocinase-e diminuição da produção de activador do plasminogénio inibidores 25. A comparação directa de PymT bEND5 linha celular imortalizada com primário CEs revelou que tanto em modelos in vitro BBB são adequados para estudos de adesão de células T 26. As linhas celulares estabelecidas de acordo com o processo descrito pode ser utilizado no número de passagem baixa para manter as propriedades de barreira pela expressão elevada de BBB e CE proteínas juncionais, como as células perdem estas propriedades durante o envelhecimento. Assim, após a perda de propriedades de barreira, a preparação de uma nova linha de células deve ser considerada. Densidade de plaqueamento de células deve ser elevada para os ECs, como este é crítica para a proliferação de células. Isto deve ser considerado durante o processo de isolamento, bem como a manutenção do ECs imortalizado. Cada linha de células de novo deve ser testada para as suas propriedades de barreira e de possíveis contaminantes, com outros tipos de células. Monocamadas EC podem ser coradas com anti-antigénio músculo galactocerebrósido, anti-glial fibrilar ácida e proteína anti-liso como anticorpos primários para excluir a contaminação com oligodendrócitos, astrócitos e pericitos 4,27. Para impedir a contaminação pela vasculatura meningal, a expressão da trombomodulina pode ser testado, o que é expresso em todos os leitos vasculares com a excepção do cérebro 28. Curiosamente, as linhas celulares imortalizadas microvasculares endoteliais isoladas de diferentes regiões do cérebro diferem nas suas propriedades de barreira e de susceptibilidade a estímulos pró-inflamatórios. Como um exemplo, as linhas de células cerebrais e cerebelares CEND cerebEND podem ser mencionados 4,5. CerebEND mostrou, em comparaçãopara CEND, menores níveis de expressão dos principais componentes da junção apertadas claudina-1 e occludin. No entanto, os níveis de claudina-3 e -12 foram maiores no cerebEND. A função da barreira de células cerebEND sofreu muito mais sob o tratamento com o mediador inflamatório, TNFa do que as propriedades de barreira de células CEND fez 5. Vulnerabilidade cerebelar superior a estímulos inflamatórios, podem ser observados in vivo em doentes com esclerose múltipla e na sua experimental do modelo animal, a encefalomielite auto-imune 29. Estes resultados interessantes mostrar a necessidade de gerar e caracterizar indivíduo em modelos in vitro de diferentes regiões do cérebro, de modo a melhorar o direccionamento da droga futuro para o cérebro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Pureza&gt; 98% </td></tr><tr><td> colágeno IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5533 </td><td> 50 ug / ml em 50 mM de ácido acético </td></tr><tr><td> Colagenase / Dispase </td><td> Roche </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetil-sulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Soro Fetal de Vitelo (FCS) </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15110-1333 </td><td> concentração final de 10%, inactivado pelo calor (30 min a 56 ° C) </td></tr&gt; <tr><td> L-glutamina </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> Armazenamento: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> Armazenamento: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Piruvato de Na- </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Neomicina (G418) </td><td> PAA Laboratories </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> Os aminoácidos não essenciais (AEN) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> O armazenamento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> Armazenamento: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene (brometo Hexadimetrina) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 107689 </td><td> 0,8 mg / ml em PBS, a armazenagem à temperatura de -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0,05%, EDTA a 0,02% em PBS </td></tr></tbody></table>

geração de uma murine cérebro imortalizado linha celular endotelial microvascular como um<em&gt; in vitro</em&gt; sangue cérebro modelo barreira

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

As células epiteliais e endoteliais (CE) são a construção de barreiras paracelular que protegem o tecido a partir do ambiente externo e interno. A barreira hemato-encefálica (BHE), constituído por CE, astrócitos finais pés, pericitos e a membrana basal é responsável pela protecção e homeostase do parênquima cerebral. Modelos in vitro BBB são ferramentas comuns para o estudo da estrutura e função da BHE a nível celular. Um número considerável de diferentes modelos in vitro BBB foram estabelecidos por pesquisa em diferentes laboratórios até à data. Normalmente, as células são obtidas a partir de bovinos, suínos, rato ou ratinho tecido cerebral (discutido em detalhe na revisão por Wilhelm et al. 1). Amostras de tecido humano estão disponíveis apenas em um número restrito de laboratórios ou empresas 2,3. Embora as preparações de células primárias são demorados e as culturas de EC pode variar de lote para lote, o estabelecimento de imortalizada CE lines é o foco de interesse científico. Aqui, apresentamos um método para estabelecer um imortalizado cérebro microvascular linha CE do cérebro de rato neonatal. Descreve-se o procedimento de listagem passo-a-passo a reagentes e soluções utilizados. O método estabelecido pelo nosso laboratório permite o isolamento de uma linha celular imortalizada endotelial homogénea dentro de 4-5 semanas. As linhas de células cerebrais microvasculares endoteliais denominado CEND 4 (a partir de córtex cerebral) e cerebEND 5 (a partir de córtex cerebelar), foram isolados de acordo com este procedimento no laboratório Förster e têm sido eficazmente utilizados para explicação de diversos processos fisiológicos e patológicos no BBB. Usando CEND cerebEND e demonstrámos que as células respondem a glucocorticóides 4,6-9 e estrogénio-tratamento 10, bem como a pró-infammatory mediadores, tais como TNFalfa 5,8. Além disso, estudou-se a patologia de múltiplas sclerosis 11 e hipóxia 12,13 na CE-nível. O CEND e linhas cerebEND pode ser considerado como uma boa ferramenta para o estudo da estrutura e função das respostas celulares, BBB de ECs a diferentes estímulos ou interacção da CE com linfócitos ou células cancerosas.

Este método descreve como isolar e imortalizar células endoteliais microvasculares de cérebro de rato. Descreve-se um protocolo de passo-a-passo a partir da homogeneização do tecido cerebral, as etapas de digestão, a semeadura e imortalização das células. Normalmente, leva cerca de cinco semanas, para se obter uma homogeneidade, linha celular imortalizada microvascular endotelial.

Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sangue Cérebro Modelo Barreira

Células epiteliais e endoteliais (EC) constroem barreiras paracelulares que protegem o tecido do ambiente externo e interno. O...

O objetivo geral deste procedimento é obter um cultivo homogeneizado de células endoteliais cerebrais imortalizadas. Isso é realizado primeiramente isolando os cérebros de camundongos neonatos e obtendo uma suspensão simples de células. O segundo passo é imortalizar as células com o antígeno T médio do poliomavírus.Em seguida, as células crescem por cerca de quatro semanas até que uma monocamada endotelial homogênea seja formada. O passo final é caracterizar a nova linhagem celular utilizando técnicas como imunomarcação, Western blot e Q-Q-P-C-R. As implicações desta técnica estendem-se à terapia de distúrbios cerebrais neuroinflamatórios ou isquêmicos, pois podem ser obtidas avaliações pré-clínicas de terapias e insights sobre a fisiopatologia.Quem demonstrará o procedimento será a Dra. Elaine Salvador, pós-doutoranda do meu laboratório. Após remover o cérebro de um camundongo neonato com idade entre três e cinco dias e transferi-lo para uma placa de Petri contendo tampão A, serão necessários os cérebros de cinco a dez camundongos para cada preparação, enquanto se trabalha em uma cabine de fluxo laminar. Remova o cerebelo, o tronco encefálico, as meninges e os fragmentos de capilares de cada cérebro.Em seguida, transfira os cérebros para uma segunda placa de Petri contendo o tampão A. Use um bisturi estéril para cortar os cérebros em pequenos pedaços e, então, use uma pipeta de 10 mililitros para aspirar e expelir o tecido e o tampão até que não apareçam grumos. Neste ponto, transfira a suspensão para um tubo cônico de 50 mililitros após centrifugar o tecido cerebral a 250 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e dissolva o precipitado em 4,5 mililitros de tampão A com 1,5 mililitro de 0,75% peso por volume.Colagenase dis pace. Incube o tecido e a solução de colagenase por 45 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação ocasional. Enquanto isso, prepare as placas de cultura de tecidos revestindo quatro poços de uma placa de 12 poços com uma solução estéril de 0,1 miligramas por mililitro.O colágeno quatro e o ácido acético 50 milimolar permitem que o colágeno adira às cavidades à temperatura ambiente durante uma hora. Após o período de incubação de 45 minutos, interrompa a digestão do tecido cerebral adicionando 15 mililitros do tampão A e re-suspenda completamente o pellet nesta solução. Em seguida, centrifugue a 250 vezes G durante 10 minutos e descarte o sobrenadante.A seguir, para remover a mielina do preparo, adicione 10 mililitros de BSA (albumina sérica bovina) estéril a 25% peso por volume em PBS ao tecido e centrifugue a 1000 × g por 20 minutos a 4 °C. Após a centrifugação, descarte cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, dissolva o pellet em 15 mililitros do tampão A e transfira para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugue novamente a 250 × g por cinco minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, lave a placa revestida com colágeno tipo IV duas vezes com PBS.Após a segunda lavagem, deixe dois dos poços vazios e adicione dois mililitros de meio de crescimento aos outros dois poços. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular, composto principalmente por células endoteliais, em quatro mililitros de meio de crescimento contendo quatro microgramas por mililitro de puromicina, e plaque dois mililitros da suspensão celular em cada um dos dois poços vazios revestidos com colágeno. Incube a 37 graus Celsius por 45 minutos para eliminar as células não endoteliais que aderem rapidamente. Em seguida, aspire o meio de crescimento dos dois poços que não contêm células e descarte-o.Em seguida, transfira o meio contendo as células não aderidas, que inclui a fração de células endoteliais, para estes dois poços. Reponha os poços anteriores com dois mililitros de meio fresco. Esses poços contêm outros tipos celulares, como fibroblastos e astrócitos, e podem ser cultivados em paralelo e utilizados para comparações da morfologia.Incube as células durante a noite no incubador de cultura de tecidos no dia seguinte. Substitua por meio fresco e cultive os fibroblastos GPE neo, que secretam um vírus com deficiência de replicação contendo o oncogene T médio do poliomavírus em frascos revestidos com gelatina contendo GPE neomed. A transfeção com o oncogene T médio do poliomavírus causa vantagem de crescimento das células endoteliais em relação às células não endoteliais, levando a uma monocamada homogênea de células com morfologia endotelial. Após quatro a seis semanas de cultivo, as células GPE neo não estão comercialmente disponíveis e podem ser obtidas como material público compartilhado.Após cultivar o GPE Neo Fiberblast por 24 horas, remova 10 mililitros do meio e adicione solução estéril de poli-cérebro até uma concentração final de oito microgramas por mililitro. Passe a mistura do sobrenadante por um filtro de 0,45 mícron para remover quaisquer fragmentos celulares. Agora, aspire o meio das culturas de células endoteliais e adicione dois mililitros da mistura de sobrenadante com poli-cérebro aos poços após incubação durante a noite.Repita este procedimento no dia seguinte com uma nova alíquota da mistura poli-cérebro do sobrenadante no dia seguinte. Remova a mistura poli-cérebro do sobrenadante. Lave as células duas vezes com PBS e, em seguida, adicione meio de crescimento fresco.Continue a trocar o meio de crescimento a cada três dias quando as células atingirem a confluência. Passe as células de um para dois em placas revestidas com colágeno. Quatro placas revestidas. Linhagens estáveis de células endoteliais cerebrais são tipicamente obtidas após quatro a cinco semanas de cultivo subsequente.Quando uma monocamada homogênea de células endoteliais preencher todo o poço. Uma vez obtidas as linhagens celulares estáveis, transfira para frascos de cultura de tecidos revestidos com colágeno IV e realize a passagem das células não mais do que uma vez por semana com tripsina, utilizando três mililitros de tripsina EDTA e incubação a 37 graus Celsius por cinco a 15 minutos, até que a camada celular esteja dispersa. Após a adição de cinco mililitros de meio, semeie os novos frascos, evitando divisões superiores a 1:4.Uma vez que haja células suficientes para obter um frasco T 75 confluente, podem ser preparados crioviales com as células para uso posterior. Para isso, colha as células com tripsina como antes, em seguida centrifugue a suspensão celular a 250 vezes G durante cinco minutos. À temperatura ambiente, re-suspenda o pellet celular em seis mililitros de meio de congelação, depois pipete 1,5 mililitro da suspensão celular em quatro crioviales.Coloque os tubos de criopreservação em um recipiente de congelação Nalgene cheio com isopropanol e mantenha-os por um dia a menos 80 graus Celsius. Finalmente, armazene os tubos de criopreservação em nitrogênio líquido. Deixe o criotubo de células vaporizar em banho-maria e, em seguida, transfira-os para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio de crescimento.Pré-aqueça o meio a 37 graus Celsius e centrifugue o tubo a 250 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após aspirar o meio, re-suspenda o pellet em um volume apropriado de meio de crescimento. Transfira a suspensão celular para um frasco de cultura celular T 25 revestido com colágeno IV contendo meio de crescimento pré-aquecido.A densidade celular para semeadura deve ser de pelo menos um vezes 10 à quarta células por mililitro. Troque o meio no dia seguinte e continue a repicar as células como antes, quando as células atingirem confluência cerca de cinco dias depois; quando estiverem prontas, semeie as células na densidade desejada para seus experimentos subsequentes. As células da extremidade C foram caracterizadas por imunomarcação de marcadores endoteliais e da barreira hematoencefálica.Esta imagem mostra a morfologia das células C e a imunomarcação para a clain cinco. As células C apresentam uma morfologia semelhante à de culturas primárias de ECS cerebrais, com monocamadas de células alongadas e fortemente agregadas que exibiram inibição de crescimento. Na confluência, as células expressaram níveis detectáveis de clain.Aqui, as células CN C foram imunomarcadas com um anticorpo contra occludina. Aqui observamos a expressão das proteínas VE-caderina, que estão localizadas nas junções entre células, novamente, conforme demonstrado por coloração de imunofluorescência. A resistência elétrica transendotelial foi medida utilizando um conjunto contendo eletrodos de passagem de corrente e medição de voltagem.Pode-se observar por meio desta figura que a resistência elétrica transendotelial de células C end aumenta com o tempo em cultura após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem distúrbios cerebrovasculares em um modelo murino.

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Estabelecimento de modelos humanos da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​pode beneficiar de pesquisa em condições cerebrais associadas com insuficiência certificação. Descrevemos aqui uma técnica melhorada para a preparação de um modelo de certificação de contacto, o que permite coculturing de astrócitos e células endoteliais cerebrais sobre os lados opostos de uma membrana porosa.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

O objetivo do presente estudo foi validar a reprodutibilidade de um modelo in vitro BBB envolvendo um singênico rato co-cultura de células endoteliais e astrócitos. A monocamada de células endoteliais apresentaram alta TEER e baixa permeabilidade LY. Expressão de proteínas TJ específicos, foram avaliadas as respostas funcionais a inflamação e a funcionalidade de transportadores e receptores.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

As células endoteliais microvasculares cerebrais (BMEC) são interconectadas por proteínas juncionais específicas formando uma barreira altamente regulada que separa o sangue e o sistema nervoso central (SNC), a chamada barreira hematoencefálica (BBB). O isolamento de células endoteliais microvasculares cerebrais murinas primárias, conforme discutido neste protocolo, permite estudos in vitro detalhados da BHE.

Isolamento da Primária Murino Cérebro microvascular células endoteliais

Aqui, descrevemos um modelo murino in vitro da barreira hematoencefálica que faz uso de espectroscopia de impedância celular, com foco nas consequências na integridade e permeabilidade das células endoteliais após a interação com células T ativadas.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

A manutenção da cobertura da barreira hematoencefálica é fundamental para a homeostase do sistema nervoso central. Este protocolo descreve técnicas in vitro para delinear os processos fundamentais e patológicos que modulam a cobertura da barreira hematoencefálica.

Ensaios In Vitro para Avaliar Formação e Perturbação de Embarque de Barreira de Sangue-Cérebro

O objectivo do protocolo é apresentar um processo otimizado para o estabelecimento de um modelo barreira hemato - encefálica (BBB) em vitro baseado em células endoteliais cerebrais primários de suínos (pBECs). O modelo mostra grande reprodutibilidade, alta tensão e é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular de fármacos.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

A barreira sangue-cérebro humana impede seletivamente a penetração de moléculas hidrofônicas e patógenos no cérebro. Várias patologias, incluindo meningite e delírio pós-operatório, estão associadas a uma maior permeabilidade da barreira hematoencefálica. Aqui, descrevemos um modelo de cultura celular endotelial para testar a permeabilidade da barreira por travessia microbiana.

Analisando a Permeabilidade da Barreira Hematoencefálica por Travessia Microbiana através de Células Endoteliais Microvasculares

A barreira hematoencefálica (BBB) é uma unidade neurovascular multicelular que regula fortemente a homeostase cerebral. Ao combinar iPSCs humanos e tecnologias de organ-on-chip, geramos um chip BBB personalizado, adequado para modelagem de doenças e previsões de penetrabilidade de medicamentos CNS. Um protocolo detalhado é descrito para a geração e operação do chip BBB.

Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano

Este protocolo detalha um método adaptado para derivar, expandir e criopreservar células microvasculares microvasculares cerebrais obtidas pela diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, e para estudar as propriedades da barreira cerebral no sangue em um modelo ex vivo.

Derivação, Expansão, Criopreservação e Caracterização de Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

Aqui, descrevemos um protocolo, o método de cultura de células endoteliais estendidas (EECM), que permite a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células cerebrais microvasculares semelhantes a células endoteliais (BMEC). Essas células apresentam expressão de moléculas de adesão de células endoteliais e são, portanto, um modelo de barreira hematoencefálica humana adequado para estudar interações de células imunes in vitro.

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas em Células Semelhantes a Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais com Fenótipo Imune Maduro;

Aprenda a gerar linhas celulares endoteliais cerebrais imortalizadas de camundongos neonatos usando antígeno T médio de polioma. Este método padronizado facilita pesquisas sobre distúrbios neuroinflamatórios e isquêmicos.

Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um In Vitro Sangue Cérebro Modelo Barreira (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um

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