Name: Indução de Sinais de adesão dependentes Usando ultra-som de baixa intensidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a induzir formação de adesões focais e ativação de Rac1 em fibroblastos usando ultrassom de baixa intensidade pulsado. Este método permite estudar mecanismos celulares para acelerar reparo tecidual.

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Este trabalho foi financiado pela Wellcome Trust 088419 concessão para MDB e patrocínio da Smith &amp; Nephew UK Ltd.

1. As superfícies de revestimento com o ligando Matrix <ol><li> O ultra-som será aplicado a células em 3,5 cm de poços, quer como pratos individuais ou como uma placa de 6 poços. Para ensaios bioquímicos ligando revestimento, directamente sobre o plástico. Para imunofluorescência, vidro fervura lamelas três vezes em água e MilliQ lugar 4 lamelas para o fundo de cada poço. </li><li> As superfícies de vidro deve ser derivatizados para assegurar revestimento ligante eficiente. Dissolver sulfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide éster em PBS a 1 mM. Adicionar 2 ml a cada poço e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lave as superfícies derivatizados 3 vezes com PBS. </li><li> Casaco, quer de vidro ou de plástico não tratada derivatizado com o ligando de integrina. Aplicar 2 ml de 10 ug / ml integrina ligand9, dissolvido em PBS contendo Ca 2 + e Mg 2 + a cada poço e incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Preparar monoparticulate BSA por aquecimento BSA a 1%, dissolvido em PBS, a 85 ° C durante 13 minutos. Permitirarrefecer e então passar através de um filtro de 0,45 mícrons. </li><li> Lavar-ligando superfícies revestidas com 3 vezes com PBS e bloqueio com BSA a monoparticulate durante 30 minutos. </li></ol> 2. Preparação de Células <ol><li> Para controlar o ambiente da matriz ao longo da experiência, a síntese de proteína deve ser bloqueada por adição de 25 cicloheximida ug / ml a 80% confluentes de fibroblastos durante 2 horas. </li><li> Lavar cicloheximida células tratadas com PBS e destacar do frasco de cultura utilizando 0,5 mg / ml de tripsina / EDTA. </li><li> As células destacadas de colheita por centrifugação a 500 xg durante 5 minutos. </li><li> Ressuspender as células em DMEM/25 mM de HEPES, 25 ug / ml cicloheximida. </li><li> Contar densidade celular da suspensão usando um hemocitómetro e diluir até 105 ml-1. </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante 20 minutos para recuperar a integrina de superfície. </li><li> Enxaguar o ligando-revestido, BSA-bloqueados poços 3 vezes com PBS. </li><li> Ml de sementes 2 da suspensão de células em cada poço. </li><li> Allocélulas w para espalhar durante 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 3. Estimulação ultra-som <ol><li> Aqueceu-se a matriz emissor de ultra-som e gel de acoplamento para 37 ° C. </li><li> Aplique uma gota do tamanho de ervilha de acoplamento gel para cada emissor. </li><li> Teste que cada emissor é funcional usando um detector de ultra-som diodo indicador. </li><li> Colocar os poços na matriz emissor. Retornar matriz para 37 ° C, 5% de CO 2 a temperatura e deixa-se equilibrar durante 10 minutos. </li><li> Ligue o sinal de ultra-som. </li><li> O sinal de ultra-som desactivará após 20 minutos, imitando o regime terapêutico. Se os tempos mais curtos de estimulação são necessárias, as chapas devem ser removidos da matriz no momento apropriado de pontos. Em todos os casos usar não estimulada placas, como controlo negativo. </li></ol> 4. Análise de Adesão Focal por imunofluorescência <ol><li> Para a análise de formação de adesão focal, aplicar o sinal de ultra-som 20 minutose então permitir que as estruturas para desenvolver durante mais 40 minutos, mantendo as células a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Aspirar meios de comunicação e fixar as células mediante a aplicação de 2 ml de paraformaldeído a 4% em PBS. Incubar durante 14 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar paraformaldeído e lavar três vezes com PBS, aplicando o PBS suavemente para baixo da borda do poço para evitar a geração de forças de cisalhamento. </li><li> Transfira cada lamela a partir dos 3,5 cm bem a uma placa de 24 cavidades para a coloração de imunofluorescência subsequente. </li><li> Têmpera paraformaldeído residual mediante a aplicação de 0,5 ml 0,1 M glicina em PBS a cada um dos 24 poços. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirado glicina e enxaguar três vezes com PBS. </li><li> Permeabilise células mediante a aplicação de 0,5 ml de Triton 0,5% X-100 (w / v) em PBS. Incubar durante 4 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirado Triton X-100 e enxaguar três vezes com PBS. </li><li> Bloquear mediante a aplicação de 0,5 ml de 3% (w / v) de BSA em PBS. Incubar durante uma noite a 4 &amp; dpor exemplo; C. </li><li> Stain vinculina contendo adesão focal com hVIN-1 anticorpo diluído 1:400 em bloco de BSA. Incubar durante uma hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar três vezes com PBS. </li><li> Aplicar fluoróforo (DyLight 488) anticorpo secundário conjugado (diluído 1:200) e actina mancha com TRITC-faloidin conjugado (diluído 1:200) no bloco de BSA. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lavar três vezes com PBS, e uma vez com água. </li><li> Montar em uma lâmina de vidro em uma posição invertida usando Prolongar montagem Gold. </li></ol> 5. Quantificação de Rac1 Ativação por Pull-down Ensaio <ol><li> Para a análise de Rac1 activação, aplicar o sinal de ultra-som de 20 minutos para as células a 37 ° C, 5% de CO 2. Ao avaliar os tempos de resposta mais longos do que 20 minutos, aplicar o sinal de ultra-som durante 20 minutos e manter as células a 37 ° C, 5% de CO2 durante o tempo restante para permitir que a resposta para se desenvolver. </li><li> Aspirar e mídia local bems em gelo. Lavar os poços com 2 ml de PBS frio e aspirado. Garantir qualquer PBS residual é removido, deixando poços inclinado para 1 minuto, seguido por aspiração completa. </li><li> Lisar as células em gelo com 35 uL de tampão de lise (10% de glicerol, 20 mM de Hepes pH 7,4, 140 mM de NaCl, 1% de NP40, 0,5% desoxicolato de sódio, 4 mM de EGTA, 4 mM de EDTA, 1 × inibidor da protease completa) por poço. Neste exemplo, 6 poços são utilizados por ponto de tempo para gerar uL 210 de lisado de células. Mais poços ou menos podem ser utilizados, mas o volume total deve lisado total de ~ 200 uL. </li><li> Células Scrape cuidadosamente com raspador de células a fim de assegurar a lise das células completas e deixar poços inclinado durante 1 minuto para permitir lisado para a piscina. </li><li> Transferir para um lisado gelada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (pooling lisados ​​a partir de regime de tratamento mesma) e centrifugação a 21.000 xg durante 2 minutos a 4 ° C para sedimentar os restos celulares. </li><li> Transferir 180 uL de lisado de gelada tubos de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 130 ul de tampão de lise e 25 uL PAK-glutpérolas de agarose athione 10. Manter restante lisado bruto a -20 ° C para a separação de gel subsequente. </li><li> Capturar Rac1 activo sobre os grânulos de agarose de glutationa-PAK pela rotação tubos durante 40 minutos a 4 ° C. </li><li> Colheita de agarose grânulo conjugados por centrifugação a 2000 × g durante 1 minuto a 4 ° C. </li><li> Lavagem grânulo conjuga três vezes com 500 uL de tampão de lise, a colheita grânulos por centrifugação a 2000x g sobrenadante e descartando depois de cada lavagem. Cuidadosamente remover qualquer tampão de lavagem restante lise com uma pipeta de 200 uL. </li><li> Eluir cada amostra por adição de 35 uL de tampão de carregamento de SDS-PAGE e incubar a 85 ° C em um bloco de aquecimento com agitação durante 5 minutos. Remover grânulos por centrifugação a 21.000 xg durante 1 minuto. </li><li> Resolver eluato grânulo por SDS-PAGE, transferência para nitrocelulose e sonda para a Rac1. </li></ol> 6. Os resultados representativos Neste protocolo, descrevemos a indução de vinculina-manchaed adesões focais e Rac1 atividade por ultra-som. Para a experiência de adesão focal, a posição de linha de base é que os fibroblastos, distribuídos sobre um ligando de α β 5 1-integrina não formam vinculina contendo aderências (Fig. 3A), a menos que um receptor de fibronectina em segundo lugar, sindecam-4, está envolvida por adição de ligando solúvel (Fig. 3B) 3,4. No entanto, a estimulação com ultra-som induz a formação de adesão focal para a mesma extensão como acoplamento de sindecam-4 (Fig. 3C), indicando que a estimulação de ultra-som pode substituir determinados componentes da via de sinalização de fibronectina-dependente 5. O principal obstáculo com este protocolo está eliminando a formação de adesão focal na ausência de estimulantes. Inibição da síntese de proteínas incompleta por cicloheximida irá permitir a deposição de matriz que é suficiente para que as células auto-estimular. Superlotação de células pode também conduzir a baixo nível de adesão focal formation e uma má resposta ao ultra-som como crosstalk entre célula-célula e célula-matriz de contatos vai complicar um experimento que foi projetado para isolar um único estímulo. Como um desenvolvimento do ensaio básico que mostram a mesma experiência, repetiu com fibroblastos que faltam sindecam-4 (Fig. 4). Estes fibroblastos ainda respondem aos ultra-sons (Fig. 4C), mas não respondem ao sindecam-4 ligando (Fig. 4B). O experimento utilizando Sdc4 - / - fibroblastos demonstra que o ultrassom pode realmente ignorar a necessidade de receptores de fibronectina certas, e ilustra como o protocolo simples podem ser desenvolvidos para obter informações adicionais sobre a via de sinalização. Para a experiência bioquímica demonstramos que ultra-som pode induzir activação de Rac1, utilizando um ensaio de pull-down que é uma adaptação do método descrito por Del Pozo et al. 10. Precipitação do activo Rac1 0, 10, 30 e 60 minutos após iniciação de estimulação de ultra-som revela que Rac1 picos de actividade em 10-30 minutos, antes de retornar à linha de base (Fig. 5). Blotting lisados ​​bruto para vinculina garante carregamento equivalente entre os pontos de tempo. O resultado assemelha-se a ativação de Rac1 pelo engajamento de sindecam-4 3, mas é um pouco mais prolongada do que a ativação pela fibronectina. Portanto 8-10 repete são normalmente necessários para a obtenção de dados significativos. Ativação de Rac1 é responsável por compromisso de células para a formação de adesão focal e nascentes adesões focais começam a se formar em 10-30 minutos, coincidindo com Rac1 ativação. Uma vez iniciado, essas aderências continuará a amadurecer em placas de adesão das grandes mostradas nas Figuras 3 e 4. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" /> Figura 1. A forma de onda de ultra-som. O ultra-som é composto por um sinal intermitente 1,5 MHz que, devido à baixa amplitude (30 mW / cm &lt;sup&gt; 2, média espacial, a média temporal) não tem efeito de aquecimento. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" /> Figura 2. Representação esquemática do fluxo de trabalho para preparação e estimulação de células com ultra-som. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" /> Figura 3. Indução ultra-som de formação de adesão focal em fibroblastos. Os fibroblastos foram espalhados sobre o fragmento de integrina de ligação da fibronectina (A) antes da estimulação com o fragmento de sindecam-4-a ligação da fibronectina (B) ou de ultra-som (C). Após 60 minutos de estimulação, as células foram fixadas, coradas para vinculina e actina, e fotografada pela epifluorescência. Barra = 10 uM. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" /> Figura 4. Indução ultra-som de formação de adesão focal em fibroblastos falta sindecam-4. <em&gt; Sdc4 - / - fibroblastos foram espalhados sobre o fragmento de integrina de ligação da fibronectina (A) antes da estimulação com o fragmento de sindecam-4-a ligação da fibronectina (B) ou de ultra-som (C). Após 60 minutos de estimulação, as células foram fixadas, coradas para vinculina e actina, e fotografada pela epifluorescência. Embora Sdc4 - / - fibroblastos foram fibronectina insensível, ultra-som ainda induziram a formação da adesão focal, indicando que o ultrassom ignora engajamento receptor matriz. Barra = 10 uM. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" /> Figura 5. Ativação de Rac1 por ultra-som. As células foram estimuladas durante 0, 10, 30 e 60 minutos, com 6 poços utilizados por ponto de tempo. A quantidade de GTP-Rac1 presentes em amostras de um curso de tempo Rac1 pull-down ensaio foi visualizada por incubação com anticorpo anti-Rac1 sobre uma western blot (imagem de cima). Quantificação da intensidade da banda (média de 8-10 repetições) revela aumento Rac1 umctividades resultante a partir do sinal de ultra-som com 10 e 30 minutos, antes de retornar para níveis basais de 60 minutos (gráfico). As barras de erro representam SEM

<ol><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li>
<li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li>
<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li>
<li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li>
<li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li>
<li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li>
<li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive%2C+low-intensity+pulsed+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li>
<li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific%2C+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter%2C+prospective%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li>
<li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li>
<li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li>
<li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII%2FIIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li>
</ol>

Andrew Harrison é um funcionário da Smith &amp; Nephew UK Limited.

Neste protocolo que descrevem o método pelo qual um tratamento que é normalmente aplicado a pacientes humanos pode ser utilizado em baseados em células experimentos. O objetivo final é entender o mecanismo molecular de ação ultra-som para que a terapia pode ser refinado. Neste protocolo, usamos fibroblastos embrionários (MEFs) como um sistema de célula de modelo, mas ultra-som tem sido também foi encontrado para ser eficaz em primárias fibroblastos de prepúcio humano 5, as células estaminais mesenquimais, osteoblastos e condrócitos 6. Usamos Rac1 activação como um ensaio bioquímico exemplo, mas o método pode ser utilizado igualmente para testar regulação da fosforilação da proteína ou a formação de complexos de proteína por imunoprecipitação. Para o exemplo de imunofluorescência que demonstram um efeito sobre a formação de ultra-som de adesão focal, mas redistribuição de qualquer molécula poderia ser examinado. Por exemplo, pode-se testar o recrutamento de factores citosólicos para a membrana plasmática, colocalisation de proteins em vesículas de tráfico ou examinar o efeito do ultra-som sobre a organização do fuso mitótico. Até agora, confinado-nos a testar fibronectina dependentes de vias, por efeito de ultra-som em células em colagénio, ou na presença de factores de crescimento podem ser testados para construir uma imagem de ultra-som como afecta o comportamento das células em um meio complexo que mais assemelha uma situação in vivo. Um desafio maior será o de testar o efeito de ultra-som usando lapso de tempo de imagem, onde a presença do emissor bloqueando o caminho da luz e vibrações ultra-sons a partir dos presentes adicionais obstáculos técnicos. No entanto, o facto de a aplicação terapêutica requer apenas 20 minutos de estimulação por dia sugere que a análise do comportamento celular após uma explosão de estimulação pode muito bem ser produtivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> sulfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide éster </td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td> 25 estoques mM dissolvidos em água pode ser armazenada a -20 ° C </td></tr><tr><td> 6-bem placa de cultura de tecido </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td> Plástico de outras empresas pode revestir mal </td></tr><tr><td> 13 mm de lamela de vidro </td><td> Suprimentos Ltd.SLS laboratório científicos </td><td> MIC3336 </td><td> Vidro de outras empresas pode revestir mal </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, Ca 2 + 2 + Mg </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50K integrina ligando (fragmento de fibronectina) </td><td> Construir descrição e préparação em 9, 11 </td><td></td><td> Ligandos alternativos de matriz pode ser usada para interrogar outras vias </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td> Cicloheximida </td><td> Sigma </td><td> C7698 </td><td> Podem ser armazenados como estoque 10mg/ml em água </td></tr><tr><td> DMEM/25 mM de HEPES </td><td> Sigma </td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td> Exógena 4000 + </td><td> Smith &amp; Nephew Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel de acoplamento de ultra-som </td><td> Smith &amp; Nephew Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHS indicador </td><td> Smith &amp; Nephew Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hVIN-1 </td><td> Sigma </td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488-conjugado anti-rato </td><td> Stratech Científico </td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-faloidin marcado &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar reagente Antifade Ouro </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> inibidor de protease completo (EDTA livre) </td><td> Roche </td><td> 056 489 001 </td><td> 100 × estoque feita a partir de comprimido armazenado a -20 ° C </td></tr><tr><td> PAK-esferas de agarose de glutationa </td><td> Construir descrição e preparação em 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Apollo Científico </td><td> BI8181 </td><td> Faça estoque 1M e pH para 7,4 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pescador </td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td> Sigma </td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td> Desoxicolato de sódio </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

indução de sinais de adesão dependentes usando ultra-som de baixa intensidade

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Em organismos multicelulares, o comportamento das células é ditada por interacções com a matriz extracelular. Consequências da matriz engajamento alcance da regulação da migração e proliferação celular, a secreção e até mesmo a diferenciação. Os sinais subjacentes cada um destes processos complexos surgem a partir das interacções moleculares dos receptores da matriz extracelular sobre a superfície da célula. As integrinas são os receptores prototípicos e fornecer uma ligação mecânica entre a matriz extracelular e do citoesqueleto, bem como o início de alguns dos cascatas de adesão dependente de sinalização. No entanto, está se tornando cada vez mais evidente que os receptores transmembrana adicionais funcionar juntamente com as integrinas para regular tanto a integrina a si mesmo e sinais a jusante. O mais elegante destes exemplos é o proteoglicano transmembranar, sindecam-4, que coopera com α β 5 1-integrina durante a adesão a fibronectina. Modelos in vivo demonstrcomeu a importância da sindecam-4 de sinalização, como sindecam-4 mata-mata-ratos apresentam retardo de cicatrização devido à migração de fibroblastos 1,2 ineficiente. Em animais de tipo selvagem, a migração de fibroblastos em relação uma ferida é desencadeada pelo aparecimento de fibronectina que fugas a partir de capilares danificado e é depositado por macrófagos em tecido lesionado. Portanto, há grande interesse em descobrir estratégias que aumentam a fibronectina dependentes de sinalização e poderia acelerar processos de reparação. Os componentes integrina mediadas e sindecam-4-mediada de fibronectina dependentes de sinalização podem ser separados por células estimulantes com fragmentos fibronectina recombinantes. Embora acoplamento integrina é essencial para a adesão celular, certos fibronectina dependentes de sinais são regulados por sindecam-4. Sindecam-4 activa o sinal Rac1 protrusiva 3, faz com que a integrina redistribuição 1, os gatilhos recrutamento de moléculas do citoesqueleto, tais como vinculina, para focaladerências 4, induzindo assim a migração direcional 3. Nós olhamos para estratégias alternativas para a ativação de tais sinais e descobriu que de baixa intensidade ultra-som pulsado (LIPUS) podem imitar os efeitos da sindecam-4 engajamento 5. Neste protocolo, descrevemos o método através do qual 30 mW / cm 2, 1,5 ultra-som MHz, pulsado a 1 kHz (Fig. 1) pode ser aplicado a fibroblastos em cultura (Fig. 2) para induzir activação Rac1 e formação de adesão focal. A estimulação de ultra-som é aplicada a um máximo de 20 minutos, como esta combinação de parâmetros, foi encontrada a ser mais eficaz para a aceleração da reparação de fracturas clínica 6. O método utiliza fragmentos recombinantes de fibronectina para envolver α β 5 1-integrina, sem envolvimento do sindecam-4, e requer a inibição da síntese de proteínas por cicloheximida para bloquear deposição de matriz adicional pelos fibroblastos., O efeito positivo of ultra-som sobre os mecanismos de reparo é bem documentada 7,8, e compreendendo o efeito molecular do ultra-som na cultura que deve ser capaz de refinar a técnica terapêutica para melhorar os resultados clínicos.

Este protocolo descreve a estimulação da cultura de fibroblastos de baixa intensidade, com ultra-sons pulsada, que impulsiona a formação de adesão focal e Rac1 activação imitando acoplamento do receptor de matriz transmembranar, sindecam-4. Esta abordagem permite a investigação de uma técnica de sucesso clínico no nível celular, proporcionando assim as oportunidades de refinamento da terapia.

Indução de Sinais de adesão dependentes Usando ultra-som de baixa intensidade

Em organismos multicelulares, o comportamento celular é ditado pelas interações com a matriz extracelular. As consequências do engajamento com a matriz variam de...

O objetivo geral deste procedimento é compreender os mecanismos moleculares pelos quais o ultrassom pulsado de baixa intensidade ou o lipo influenciam a migração celular e, assim, aceleram a reparação tecidual. Isso é realizado primeiramente tratando as células com cyclo heide por duas horas para impedir a expressão de novo de proteínas e, consequentemente, a autoestimulação das células. O segundo passo do procedimento consiste em espalhar células destacadas por duas horas sobre superfícies que foram revestidas com um ligante de matriz cuidadosamente definido.O terceiro passo é estimular as células com ultrassom, acoplando por meio de gel as placas de cultura celular aos emissores de ultrassom. Os resultados podem mostrar alterações na formação de adesões focais devido à estimulação por ultrassom, por meio da coloração das células para culina e actina, e alterações temporais na ativação da proteína Rack1 por meio do ensaio de precipitação com RAC1 ativo e posterior western blotting. Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da sinalização de adesão, como se a manipulação física das células pode substituir estímulos químicos, tais como fatores de crescimento ou actina fibrilar?E como essa manipulação física inicia a migração celular? As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de feridas crônicas, pois, ao compreender como o ultrassom pode afetar o comportamento celular, poderemos aperfeiçoar tratamentos para acelerar o fechamento de feridas em indivíduos com defeitos na cicatrização, como pacientes idosos ou diabéticos. Para ensaios bioquímicos, revestir diretamente os poços de placas plásticas de 3,5 centímetros com ligante de integrina.Para imunofluorescência, ferva lâminas de vidro três vezes em água milli Q. Em seguida, posicione quatro lâminas em cada placa de 3,5 centímetros e derive as lâminas de vidro para garantir um revestimento eficiente do ligante, adicionando dois mililitros de sulfa MBS a um milimolar a cada poço, deixe a reação prosseguir por 30 minutos à temperatura ambiente e, então, lave as superfícies derivatizadas três vezes com PBS. Agora, recubra o vidro derivatizado com dois mililitros do ligante de integrina.Adicione o ligante a cada poço e incube as placas durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, prepare BSA monoparticulada aquecendo BSA a 1%, dissolvida em PBS, a 85 graus Celsius por 13 minutos. Deixe esfriar e, em seguida, filtre através de um filtro de 0,45 mícron. Primeiro, lave as superfícies revestidas com ligante três vezes com PBS e, em seguida, bloquee as superfícies com a BSA monoparticulada preparada por 30 minutos.Para controlar o ambiente da matriz durante todo o experimento, a síntese proteica deve ser bloqueada pela adição de 25 microgramas por mililitro de cyclo heide a fibroblastos com 80% de confluência por duas horas. Lave as células tratadas com cyclo heide com PBS, trise as células e recupere-as em pellet. Re suspenda as células em solução A-D-M-E-M numa concentração final de 10.000 células por mililitro com o auxílio de um hemocitômetro.Agora, incubar as células ressuspendidas a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, lavar as placas três vezes com PBS antes de semear dois mililitros da suspensão celular em cada uma. Deixar as células se espalharem por duas horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, começando pelo aquecimento do arranjo do emissor de ultrassom e do gel de acoplamento.Uma vez aquecido, aplique uma gota do tamanho de uma ervilha de gel acoplador em cada emissor para testar se cada emissor está funcional. Usando um detector de diodo indicador de ultrassom, permita que o gel acople o emissor ao detector. Se o emissor estiver funcional, o DDE acenderá.O dispositivo possui configurações fixas e emitirá ultrassom a 1,5 megahertz pulsado a um quilohertz, com uma intensidade de 30 miliwatts por centímetro quadrado. O dispositivo se desativará automaticamente após 20 minutos. Coloque as placas sobre a matriz do emissor, retorne a matriz a uma incubadora e aguarde 10 minutos para que a temperatura equilibre antes de ligar o sinal de ultrassom na fonte de alimentação.O sinal de ultrassom será desativado após 20 minutos. Imitando o regime terapêutico caso sejam necessários tempos de estimulação mais curtos. As placas podem ser removidas do arranjo no momento apropriado.Para tempos de estimulação mais longos, as placas devem permanecer no arranjo e ser deixadas em desenvolvimento. O emissor poderia ser reiniciado, mas não observamos benefício adicional ao fazê-lo. Em todos os casos, as placas não estimuladas devem ser usadas como controle negativo.Para análise da formação de adesões focais, aplique um sinal de ultrassom por 20 minutos em lamínulas revestidas com S e, em seguida, incube-as por mais 40 minutos a 37 graus Celsius. Isso permite que as adesões focais se desenvolvam. Em seguida, aspire o meio.Aplique dois mililitros de fixador e aguarde 14 minutos. Remova o fixador por aspiração e lave cuidadosamente as células três vezes com PBS. Aplique o PBS ao longo da borda do poço e espalhe a solução suavemente.Após a lavagem completa, transfira cada lamínula do poço de 3,5 centímetros para uma placa de 24 poços para coloração imunofluorescente subsequente. Após o período desejado de estimulação, aspire o meio e lave as células com PBS em gelo; lise as células no tampão de lise apropriado para o ensaio bioquímico escolhido. Normalmente analisamos uma ativação por ensaio de precipitação com ligante efetor.Particularmente, este método pode ser utilizado para análise bioquímica de qualquer via de sinalização. Neste protocolo, descrevemos a indução de vinky e de adesões focais coradas, bem como da atividade de RAC um, por meio de ultrassom para os experimentos de adesão focal. A posição de referência é que fibroblastos espalhados sobre um ligante do integrina alfa cinco beta um não formam adesões contendo finkel, a menos que um segundo receptor de conexão com fibronectina, o sindicato quatro, seja ativado pela adição de um ligante solúvel.No entanto, a estimulação com ultrassom induz a formação de adesões focais em grau semelhante ao do engajamento do syncom quatro, indicando que a estimulação por ultrassom pode substituir certos componentes da via de sinalização de independência do colo de fibrina. Como um aprimoramento do ensaio básico, mostramos o mesmo experimento repetido com fibroblastos que carecem do INDICUM quatro. Esses fibroblastos ainda respondem ao ultrassom, mas não respondem ao ligante do INDICUM quatro.Isso demonstra que o ultrassom pode realmente dispensar a necessidade de certos receptores de fibras aferentes. Para o experimento bioquímico, demonstramos que o ultrassom pode induzir a ativação de RAC 1 por meio de um ensaio de precipitação por "pull-down". A análise de RAC 1 ativo 0, 10, 30 e 60 minutos após o início da estimulação por ultrassom revela que a atividade de RAC 1 atinge seu pico entre 10 e 30 minutos antes de retornar à linha de base. O bloqueio de lisados brutos para culina garante carga equivalente entre os diferentes pontos de tempo.O resultado assemelha-se à ativação de RAC1 pela ligação ao sindicato 4, mas é ligeiramente mais prolongado do que a ativação por fibronectina. Portanto, normalmente são necessárias oito a 10 repetições para obter dados significativos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de eliminar estímulos adicionais de STU bloqueando completamente a síntese proteica com ciclo-heide, evitando a contaminação do meio de cultura no experimento e evitando o excesso de densidade celular que resulte em contatos célula-célula após este procedimento.Outros métodos, como ensaios de ferida por arranhão, podem ser utilizados para investigar questões adicionais, tais como: como o ultrassom inicia a migração celular?

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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