Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes

O objetivo geral deste procedimento é identificar e localizar os principais sítios de pausa traducional de uma mRNA traduzida em um sistema de tradução livre de células. Isso é realizado primeiramente clonando o gene de interesse sob o controle de um promotor transcricional T sete. Em seguida, o mRNA é transcrito e purificado.

Em seguida, a tradução in vitro é realizada na presença de mRNA e aminoácidos radioativos para marcar a proteína sintetizada e os polipeptídeos em formação. Por fim, os polissomos são isolados utilizando centrifugação por velocidade de sedimentação, e as cadeias em formação isoladas são separadas por eletroforese em gel. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram polipeptídeos em formação de diferentes comprimentos por meio de eletroforese SDS-PAGE e autorradiografia, indicando assim a presença de sítios de pausa ao longo do mRNA de interesse.

A principal vantagem desta técnica em relação aos nossos métodos existentes, como o ensaio de proteção de núcleo micrococal, é que ela é extremamente simples, rápida e eficiente, e permite a determinação e identificação dos principais sítios de tradução ao longo de qualquer MNA em um dado sistema celular. Este método pode ajudar a responder algumas das questões fundamentais no campo da tradução e do dobramento proteico translacional, como a forma pela qual fatores celulares, tais como o uso de códons, a abundância de TNA e/ou a estrutura secundária do mRNA, podem afetar a cinética da tradução. Este método pode ainda aprofundar nossa compreensão das relações entre a cinética da tradução e as etapas-chave na via de dobramento proteico pós-traducional.

A implicação desta técnica estende-se à compreensão do processo de dobramento proteico in vivo, que é amplamente considerado ocorrer co-translationamente durante a tradução no ribossomo, embora o presente estudo envolva tradução livre de células de gama bi cristalina utilizando extrato celular comercialmente disponível. Esta técnica também pode ser aplicada para identificar IDEs traducionais em potencial em praticamente qualquer proteína, utilizando extrato competente para tradução preparado a partir de qualquer fonte celular. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades em duas etapas principais do protocolo.

O primeiro é o estabelecimento do tempo total necessário para realizar a reação de tradução, o que garantiria que a maioria dos polipeptídeos em formação permanecesse ligada ao ribossomo. E o segundo é encontrar um sistema de eletroforese apropriado para separar a maioria dos polipeptídeos em formação, cuja escolha depende do tamanho da proteína em estudo. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando decidimos analisar a cinética traducional das moléculas de globina na década de oitenta, em relação ao modelo proposto de dobramento co-translation de globina.

A não uniformidade da tradução da globina foi observada pela primeira vez por PRO e Maurice em 1974, ao utilizar cromatografia de exclusão por tamanho CLO das cadeias NAS e da globina. No entanto, sua análise não possuía a precisão desejável; Pro e mais observaram quatro sítios principais de potência de tradução durante a tradução da globina. Posteriormente, nossa análise permitiu revelar cerca de 10 sítios adicionais de potência e construir um modelo detalhado do dobramento translacional da globina. A demonstração visual deste método é fundamental, pois a técnica descrita aqui envolve o isolamento de polissomos e a análise do polipeptídio nascente utilizando gel Tri S Ds page.

Ambas essas etapas são fundamentais para obter resultados de alta qualidade e reprodutíveis. A demonstração do progel será realizada por um estudante de pós-graduação do laboratório Myelo, Sujata For, na transcrição in vitro de RNA mensageiro. Comece com um gene de interesse que tenha sido clonado sob um promotor T sete e/ou SP seis; utilizando uma enzima de restrição apropriada, linearize o molde de DNA a jusante do códon de término e/ou da extremidade três linha do RNA mensageiro.

Uma amostra da digestão com enzima de restrição é submetida à eletroforese em gel de agarose para verificar se o DNA está completamente linearizado. Após determinar a concentração ideal do molde de DNA, utilize um kit de transcrição para transcrever in vitro o RNA mensageiro de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, utilize a precipitação com cloreto de lítio para purificar o mRNA.

Em seguida, utilize eletroforese em gel de acrilamida ou aros para verificar sua pureza. Prepare uma reação de tradução in vitro de 100 microlitros em água livre de nucleases adicionando uma mistura de aminoácidos de um milimolar, sem metionina, 10 unidades de inibidor de RNA, 20 microcuries de metionina radioativa 35 s e lisado de reticulócito de coelho. Em seguida, pré-aqueça a reação incubando-a a 30 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, adicione dois microgramas de mRNA e incube a 30 graus Celsius por cinco minutos para interromper a reação, colocando então no gelo para isolar os polipeptídeos recém-sintetizados ligados aos ribossomos. Coloque a reação de tradução sobre 4,5 mililitros de glicerol a 30% em tampão HCl pH 7,6 contendo cloreto de potássio e cloreto de magnésio e centrifugue usando um rotor TLA 110 a 100.000 × g por uma hora a 4 graus Celsius. A seguir, remova cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, reconstitua o pellet de polissomos contendo os polipeptídeos recém-sintetizados em um pequeno volume de tampão tris 1 milimolar, HCl pH 7,6 contendo 0,5 miligramas por mililitro de ribonuclease A e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Para aumentar a hidrólise da ligação peptídica, éster tRNA, adicione hidróxido de sódio até uma concentração final de 10 milimolar à reação e incube por mais 30 minutos. Separe os polipeptídeos recém-formados em gel de SDS-PAGE com tris-tris, em seguida fixe e seque os géis. Submeta os géis à auto-radiografia, seguida de imagem de fosfóro para detecção dos polipeptídeos recém-formados.

O movimento alterado dos ribossomos induzido por mudanças na concentração de tRNA deve levar a alterações na distribuição dos tamanhos dos polipeptídeos nascentes que se acumulam durante a tradução, bem como às suas intensidades relativas, as quais refletem a duração da pausa neste ponto. Polipeptídeos nascentes da proteína gama B cristalina foram isolados e separados por eletroforese SDS-PAGE Tris-Trisina. Os diferentes comprimentos e intensidades dos polipeptídeos nos sistemas RRL e E. coli indicam que o deslocamento dos ribossomos ao longo do mRNA nesses dois sistemas segue cinéticas de tradução distintas.

Por exemplo, observe a faixa proeminente de 17,7 kilodaltons no lisado de e coli, ausente no sistema de lisado de reticulócito de coelho. A cristalina gama B possui códons de arginina em tandem frequentes em sistemas de mamíferos, mas sabidamente extremamente raros e lentamente traduzidos em e coli, sugerindo que essa faixa seja causada pela pausa do ribossomo em desses códons raros em tandem, conforme mostrado aqui.

Nenhuma banda pode ser observada na ausência de mRNA, e o tratamento com puromicina remove a maioria das cadeias nascentes dos polissomos. Além disso, o tratamento prolongado com puromicina remove todas as cadeias nascentes, confirmando que os produtos polipeptídicos observados são cadeias nascentes associadas aos ribossomos, e não proteínas ribossomais menores (MRPs) que co-sedimentam com os polissomos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um a dois dias. A duração do procedimento depende principalmente do tempo da etapa de centrifugação e da eletroforese de peptídeos nascentes em gel.

Ao realizar este procedimento, é importante interromper imediatamente a reação de tradução após o tempo de incubação. Para evitar a liberação do polipeptídeo nascente do ribossomo, é obviamente essencial evitar o uso de RNAs em qualquer etapa. A contaminação por RNAs pode afetar a eficiência de tradução do extrato e provocar a liberação do polipeptídeo nascente do ribossomo ao seguir este procedimento.

Outros objetivos, como por exemplo, os efeitos de proteínas ligantes de mRNA na eficiência do movimento do ribossomo em uma mensagem específica, também podem ser testados após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de dobramento de proteínas explorarem o papel da tradução imposto pela presença de códons raros no dobramento proteico traducional. Esta técnica foi previamente empregada para testar o papel de substituições de íons potássio no movimento do ribossomo em uma mensagem e no dobramento proteico traducional.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar sítios de potencial translacional apresentados pelo mRNA, isolando polipeptídeos recém-sintetizados ligados ao ribossomo. Não se esqueça de que o trabalho com isótopos radioativos e aminoácidos marcados, como, por exemplo, a metionina-³⁵S, exige precauções especiais e deve sempre ser levado em consideração ao realizar este procedimento.