Dois métodos de formação de heterocários Descobrir Fatores de restrição HCV

O objetivo deste procedimento é investigar o impacto dos fatores de restrição na conclusão do ciclo de replicação do vírus da hepatite C em uma determinada linhagem celular, utilizando dois métodos que dependem da formação de hécades. No primeiro método, inicie cultivando células hepáticas humanas, bem como células empacotadoras HeLa A e Hep 56 1D. Em seguida, transfete o RNA do vírus da hepatite C ou HCV-RNA nas células hepáticas por eletroporação. Posteriormente, fusione a linhagem celular com replicação de HCV com a respectiva linhagem celular empacotadora por meio de polietilenoglicol. No segundo método de fusão, o primeiro passo é a produção de um estoque de HCV com alto título.

Diferentes linhagens celulares são então cultivadas em co-cultura e a fusão celular é induzida pela transfeção da glicoproteína do vírus espumante protótipo. Em seguida, os heterocarions são infectados com o VHC. Após qualquer dos métodos de formação de heterocarions, é realizada microscopia fluorescente para confirmar a fusão, e a produção de partículas infecciosas é quantificada.

A principal vantagem desta técnica é que ela é útil para triagem de um grande painel de linhagens celulares e células primárias quanto à expressão de fatores de restrição dominantes específicos de HV. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a especificidade de espécies e noms do HCV. A demonstração visual deste método é fundamental para facilitar a compreensão dos conceitos subjacentes aos dois sistemas de fusão antes da indução da fusão celular por polietilenoglicol.

Células HUH 7.5 são transfectadas com H-C-V-R-N-A seguindo protocolos padrão e cultivadas por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no dia seguinte. Recolha as células HUH 7.5 transfectadas que abrigam o replicon subgenômico, bem como as células empacotadoras heal R e he 56 1D. Essas células empacotadoras foram modificadas para expressar ectopicamente as proteínas do VHC: core, E1, E2, P7 e NS2. Após a tripsinização, re-suspenda as células em meio DMEM completo e dilua as suspensões celulares para as seguintes concentrações: HUH 7.5 para cinco vezes 10 à quinta células por mililitro e células heal e hep 56 1D para duas vezes 10 à quinta células por mililitro.

Em seguida, prepare uma placa de cultura de seis poços com dois a três lamínulas de vidro estéreis por poço. Para análise adicional da eficiência de fusão, combine um mililitro de células HUH 7.5 transfectadas com um mililitro de células empacotadoras e semeie em um poço da placa de seis poços. Incube por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, verifique a densidade celular.

A densidade celular deve variar entre 60 e 80% de confluência antes da indução da fusão celular, para que as células estejam em proximidade próxima, permitindo a fusão das membranas celulares. Aspire o meio das células em co-cultura e lave uma vez com um mililitro de PBS. Em seguida, adicione cuidadosamente 500 microlitros de polietilenoglicol pré-aquecido a 40% ou PEG 1.500. Adicione 500 microlitros de PBS a outro poço de células em co-cultura como controle. Incube por cinco minutos a 37 graus Celsius para induzir a formação de heterocariontes. Aspire o PEG e adicione cuidadosamente dois mililitros de PBS. Após um minuto, aspire o PBS e adicione dois mililitros de PBS fresco. Lave com PBS de três a cinco vezes, por um minuto a cada lavagem, para remover o excesso de PEG.

Finalmente, adicione dois mililitros de DMEM, meio completo, a cada poço e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas. 48 horas pós-fusão. Colete cada SNAT e filtre através de um filtro de 0,45 mícron. Após a coleta do SNAT da cultura celular, a eficiência de fusão pode ser determinada por imunofluorescência. Lave os poços contendo lamínulas de vidro uma vez com um mililitro de PBS durante um minuto.

Fixe as células com 600 microlitros de paraformaldeído a 3% em PBS por 15 minutos. Lave três vezes com PBS por um minuto por lavagem após a lavagem final. Use pinças para transferir cuidadosamente as lamínulas para uma placa de 24 poços com células permeabilizadas com 500 microlitros de Triton X-100 a 0,5% em PBS por cinco minutos.

Posteriormente, lave três vezes com PBS, aplique 250 microlitros da solução de anticorpo primário a cada poço. Utilize o anticorpo anti-NS5A numa concentração de 0,5 microgramas por mililitro e o anticorpo monoclonal humano anti-E2 numa concentração de 6,4 nanogramas por mililitro. Incube por 45 minutos à temperatura ambiente; após 45 minutos, lave três vezes com PBS.

Em seguida, adicione 250 microlitros de anticorpos secundários a cada poço; anticorpos secundários de cabra anti-murino ou anti-humano IgG conjugados à Alexa Fluor 546 ou Alexa Fluor 488 são utilizados numa concentração de dois microgramas por mililitro. Incube por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após 30 minutos, lave uma vez com PBS.

Posteriormente, corar os núcleos celulares com 250 microlitros de DPI diluído na proporção de um para 3000 em PBS. Incubar por um minuto à temperatura ambiente no escuro, lavar quatro vezes com PBS e uma vez com água. Por fim, montar as lamínulas de cabeça para baixo sobre uma gota de FloraMount em uma lâmina de microscópio e deixar secar no escuro.

Para iniciar este procedimento, colete e prepare suspensões simples de células dos seguintes tipos: linhagem celular hepática humana Luna NA, que não expressa endogenamente CD81; células empacotadoras He r; e células Hep 56 1D que expressam estavelmente CD81 humano. Co-cultive as células Luna n com as células He r numa proporção de um para um e com as células Hep 56 1D HCD81 numa proporção de um para dois, obtendo uma densidade celular total de 1,5 × 10⁵ células por 12.

Incube bem por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no dia seguinte. Transfete as células temporariamente com uma proteína envelope PFE altamente fusogênica utilizando lipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante. Trinta horas após a transfeção com a glicoproteína PFE, inocule os heterocarões com 350 microlitros de um estoque viral previamente preparado a uma MOI de aproximadamente 2,3.

Incubar por 12 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono na manhã seguinte. Lavar uma vez com PBS e adicionar um mililitro de meio completo DMEM por poço, incubando por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 48 horas, coletar o sobrenadante das culturas de heterocariões, filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,45 mícron. Em seguida, utilizar o sobrenadante para inocular células HUH 7.5 que foram semeadas em placas de 96 poços no dia anterior, em um ensaio de diluição limitante, incubando por 72 horas antes de quantificar a produção de partículas virais infecciosas.

O procedimento para visualizar eventos de fusão deve ser concluído seis horas antes da lavagem do co-cultivo. Adira as células uma vez com cinco mililitros de PBS e, em seguida, adicione quatro mililitros da solução DI apropriada por placa de 10 centímetros. Incube as células por 45 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Lave as células uma vez com cinco mililitros de PBS por um minuto e, então, adicione meio completo DMEM. Incube por seis horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono antes da semeadura. Adicione um lamínula a cada poço da placa de 12 poços, depois semeie e transfecte as células conforme mostrado anteriormente. Trinta horas após a transfeção, lave cuidadosamente as células com um mililitro de PBS por um minuto e, em seguida, fixe as células com 250 microlitros de paraformaldeído a 3% por 15 minutos à temperatura ambiente.

Lave as células uma vez com um mililitro de PBS durante um minuto e, em seguida, cora-as com dappy por um minuto após lavar as células uma vez com PBS e uma vez com água. Monte lâminas, lâminas de proteção e lamínulas no primeiro enfoque para investigar o impacto dos fatores de restrição na conclusão do ciclo de replicação do HCV. Em heterocarons, células HUH 7.5 foram primeiramente transfectadas temporariamente com um replicon subgenômico que expressa um transgene de luciferase e proteínas não estruturais do HCV, e então co-cultivadas e fundidas com linhagens celulares que expressam as proteínas estruturais core e proteínas acessórias do HCV. Um resultado representativo é mostrado nesta figura: células imunomarcadas utilizando anticorpos monoclonais contra a proteína estrutural E2 e a proteína não estrutural NS5A.

As imagens nos painéis superiores mostram que, após o tratamento com PEG, sinais para MS cinco A e D dois foram detectados simultaneamente no mesmo citoplasma, indicando autofusão. Em contraste, os painéis inferiores mostram que, quando as células em co-cultura foram tratadas com PBS, nenhuma fusão foi induzida. Assim, nenhuma colocalização de sinais foi observada. Para quantificar a infectividade viral produzida a partir de heterocarions, o sobrenadante foi coletado das co-culturas 48 horas após a indução da fusão e utilizado para inoculação de células HUH 7.5 ingênuas para ensaios subsequentes de luciferase.

Neste gráfico, são exibidos os valores médios de três experimentos independentes. A barra horizontal cinza representa o fundo para unidades relativas de luz ou RLU determinadas em células HUH 7.5 não infectadas. Notavelmente, quando células replicantes HUH 7.5 foram fundidas com linhagens celulares ingênuas ou tratadas com PBS como controle, nenhuma infectividade foi detectada nos fluidos de cultura.

No entanto, quando a fusão celular entre as linhagens celulares HUH 7.5 com replicon e as linhagens empacotadoras foi induzida por PEG, partículas virais infecciosas foram liberadas nos fluidos de cultura. Isso indica que a produção do vírus requer fusão celular e expressão de proteínas virais nas linhagens celulares empacotadoras, notavelmente não apenas os heterocariontes das células de hepatoma humano HUH 7.5, mas também heterocariontes com células hepáticas humanas não hepáticas e de camundongo permitiram a liberação do vírus, indicando que o montagem e a liberação não são dominantes inibidos por possíveis fatores de restrição nesses tipos celulares. Em uma abordagem alternativa, a fusão de células somáticas foi induzida pela expressão de uma glicoproteína viral após o cultivo das células.

Os heterocarions foram visualizados corando linhagens celulares separadas com corantes marcadores celulares antes do co-cultivo e da transfeção com as células proteicas genéticas; as células foram fixadas e coradas com DPI 30 horas após a transfeção, sendo mostrado um resultado representativo nesta figura. A fusão de dois tipos celulares é indicada por um heterocarion com distribuição homogênea dos corantes no citoplasma, conforme ilustrado aqui. Em contraste, as imagens no painel inferior mostram a ausência de células com citoplasma duplamente corado, indicando a ausência de fusão celular.

Este gráfico final mostra que todos os fatores de entrada do VHC são expressos apenas em culturas heterocarióticas de células Luna N com células hela ou Hep 56 1D que expressam o CD 81 humano. Neste caso, as culturas foram inoculadas com partículas infecciosas do VHC. Os fluidos das culturas foram coletados 48 horas depois e a liberação de novas partículas a partir dos heterocarions foi determinada por ensaio de diluição limitante, utilizando células-alvo HUH 7.5 não infectadas previamente; os valores médios de três experimentos independentes são mostrados, e a barra horizontal cinza representa o limite de detecção do ensaio.

Como controle, células lunar N foram fundidas com células lunar N, o que resultou em níveis muito baixos de HCV infeccioso, próximos ao limite de detecção. Resultados semelhantes foram obtidos quando células lunar N foram fundidas com células HEP 56 1D ingênuas. Em ambos os casos, o CD 81 humano estava ausente, de modo que o HCV não pôde infectar produtivamente os heteros.

Em contraste, observou-se a produção *de novo* de progênie viral infecciosa aproximadamente dez vezes maior que o fundo do ensaio em células lunar 10 infectadas com heer e em células lunar hand fundidas com células HEP 56 1D que expressam CD 81 humano. Isso indica que o VHC completou com sucesso seu ciclo de replicação em RetroCars, descartando assim a expressão de fatores de restrição dominantes nessas linhagens celulares. Uma vez dominado, o procedimento experimental completo pode ser realizado em uma semana, se for executado corretamente.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar heterocariões para a identificação de possíveis fatores de restrição de HV. Não se esqueça de que trabalhar com o vírus da hepatite C pode ser extremamente perigoso e precauções, como alta biossegurança, devem sempre ser consideradas ao realizar este procedimento.