Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é isolar células endoteliais humanas de alta qualidade e usá-las para examinar os mecanismos que regulam a transmigração de neutrófilos, condições de subfluxo. Isso é feito primeiro isolando e plaqueando as células endoteliais da veia umbilical humana. O segundo passo é dividir as células em câmaras IBD.

Em seguida, neutrófilos humanos recém-isolados são profundidos através de células endoteliais ativadas, resultando em adesão firme e transmigração de neutrófilos. A etapa final é quantificar a transmigração usando microscopia de vídeo. Em última análise, a microscopia fluorescente e de campo claro pode ser usada para avaliar a transmigração de neutrófilos através de células endoteliais ativadas.

O isolamento das células endoteliais é fácil de descrever, mas difícil de aprender em parte porque as etapas principais requerem a visualização do cordão umbilical. Por esse motivo, a demonstração visual desse método é fundamental. Este método nos ajudará a entender questões-chave no campo da inflamação, como como o recrutamento de leucócitos acontece sob condição de fluxo e como as células endoteliais se comportam sob condição de fluxo será melhor. Compreendido.

Embora este método possa fornecer informações sobre o recrutamento de neutrófilos durante a inflamação. Também pode ser aplicado a populações raras de leucócitos, como células natural killer e eosinófilos. Demonstrando este procedimento junto com Ritu Sharma está Hong Jang, um técnico em meu laboratório Pelo menos uma hora antes do procedimento preco, e então incubar um frasco T 75 com gelatina a 37 graus Celsius.

Em seguida, inicie o procedimento de isolamento das células endoteliais na capela de fluxo laminar usando uma tesoura para cortar um cordão umbilical de uma placenta. Depois de colocar luvas estéreis, examine atentamente o cordão e descarte todas as partes que contenham coágulos sanguíneos ou sejam danificadas pelo clampeamento do cordão durante o parto. Em seguida, identifique as duas artérias e a única veia presente no cordão.

Em seguida, insira suavemente uma cânula com uma torneira de parada bidirecional presa a ela em uma extremidade da veia e, em seguida, coloque uma braçadeira ao redor da cânula para mantê-la firmemente na posição. Uma das partes mais complicadas do procedimento é perfundir o cordão umbilical. Para garantir que isso seja feito com sucesso, perfunda o cabo com excesso de buffer e observe o fluxo até que ele fique limpo.

Perfunda a veia com tampão de cordão até que o fluxo esteja claro e, em seguida, prenda a extremidade do cordão. Ocasionalmente, durante a perfusão, um pequeno orifício é revelado porque os médicos removeram o sangue do cordão umbilical do cordão umbilical. Nessas situações, os hemostáticos podem ser usados para bloquear o orifício e a perfusão pode continuar enquanto isola as células endoteliais.

É extremamente importante cronometrar com precisão o tratamento com colagenase. Muito pouco tempo e poucas células endoteliais serão colhidas por muito tempo e podem ocorrer células musculares lisas contaminantes ou danos às células endoteliais. Em seguida, perfunda a veia com colagenase quente recém-preparada.

Feche a torneira de parada e incube o cordão em um béquer contendo tampão de cordão quente. Após 10 minutos, remova e massageie suavemente o cordão para soltar as células endoteliais do lúmen da veia. Drene a solução em um tubo contendo cinco mililitros de meio de células endoteliais ou ECM, lavando o cordão com tampão de cordão duas vezes para remover as células restantes.

Agora gire as células por 10 minutos a três 50 vezes G.At temperatura ambiente, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet. Em 10 mililitros de meios de células endoteliais, transfira as células para o frasco T 75 revestido com gelatina e cultive, as células endoteliais durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de CO2. No dia seguinte, agite suavemente o frasco para desalojar os glóbulos vermelhos.

Em seguida, remova o sobrenadante e lave a cultura de células endoteliais com HBSS quente. Após a remoção do HBSS, alimente as células com 10 mililitros de ECM quente. Em seguida, examine as células ao microscópio para garantir que os glóbulos vermelhos foram removidos e para avaliar o grau de confluência e morfologia das células endoteliais.

Continue a trocar o meio a cada três dias até que as células atinjam a cofluência. Nesse ponto, divida as células usando uma solução de tripsina e EDTA. Em seguida, colha as células destacadas e ressuspenda-as na ECM.

Finalmente, cubra cada poço de uma câmara IBD com gelatina. Remova o excesso de gelatina e adicione 1,5 vezes 10 aos seis por mililitro da suspensão de células endoteliais em cada poço da câmara. Comece induzindo a regulação positiva da adesão e ativação da expressão da superfície celular da molécula, incubando as células endoteliais com um estimulante apropriado enquanto as células endoteliais estão sendo ativadas.

Isole os neutrófilos do sangue periférico de voluntários humanos saudáveis por centrifugação por densidade, conforme publicado anteriormente, e suspenda as células a uma concentração de um vezes 10 elevado a seis por mililitro em HBSS mais albumina humana. Depois de configurar o microscópio, conecte a câmara IBD contendo as células endoteliais estimuladas ao tubo do microscópio. Selecione a objetiva de contraste de fase 10 x e, em seguida, ajuste a bomba de seringa para retirar e iniciar o fluxo de HBSS na tensão de cisalhamento desejada.

Pare brevemente o fluxo girando a torneira de parada de três vias no lado da saída para a posição desligada e mudando a linha de entrada de HBSS para neutrófilos isolados. Inicie o fluxo novamente girando a torneira de parada de volta para a posição ligada. Em seguida, comece a gravar usando uma câmera CCD conectada a um gravador de DVD.

Inicie o cronômetro. Quando os neutrófilos entrarem na câmara após quatro minutos, volte para HBSS para evitar a fixação de novos neutrófilos. Se os dados para rolagem total de interações e adesão firme forem desejados, use um contraste de fase de 10x.

Objetivo de criar imagens de seis campos aleatórios por 10 segundos cada entre os minutos quatro e cinco. Por fim, mude para uma objetiva de 40x e registre um único campo de visão no momento de interesse. Após a perfusão de neutrófilos em 10 minutos, colete entre cinco e 10 campos de visão aleatórios.

As células endoteliais não estimuladas não suportam o recrutamento de neutrófilos. Portanto, as figuras a seguir mostram neutrófilos interagindo com células endoteliais estimuladas por TNF alfa. Observe o neutrófilo aderente conforme indicado pela ponta da seta amarela e o neutrófilo transmigratório conforme indicado pela ponta da seta branca.

A transmigração de neutrófilos pode ocorrer nas junções celulares ou através das próprias células endoteliais. Para diferenciar essas duas condições, as células endoteliais foram marcadas com um anticorpo coerente anti VE. Como visto aqui no vermelho, a transmigração é pontuada como ocorrendo paracelular ou transcelularmente.

Neste modelo, praticamente toda a transmigração é paracelular, como demonstrado por esta figura que mostra a sobreposição das duas figuras anteriores. Neste primeiro de três gráficos, as interações dos neutrófilos foram examinadas e medidas usando o software de imagem J. Observe que significativamente mais interações de células endoteliais de neutrófilos ocorreram entre neutrófilos e células endoteliais ativadas por TNF alfa do que com as células endoteliais não estimuladas de controle.

O total de células que interagem foi ainda caracterizado como rolante ou firmemente aderente ou transmigratório como antes. Significativamente mais transmigração de neutrófilos ocorreu nos poços contendo células endoteliais ativadas após o isolamento das células endoteliais. Os outros métodos, como western blotting, PCR em tempo real e resistência endotelial, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais relacionadas à biologia celular endotelial após o desenvolvimento.

Este método ajudará os pesquisadores no campo da inflamação e biologia vascular a entender como o recrutamento de leucócitos acontece sob condição de fluxo em um sistema modelo humano. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células endoteliais da veia umbilical humana e usá-las para estudar a transmigração de neutrófilos em condições de fluxo usando uma câmara de idade.