Name: Um Modelo de Tubo de Falópio Humanos para Investigação de C. trachomatis Infecções (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo ex vivo de tubas uterinas humanas para estudar infecções por C. trachomatis. Este método permite analisar danos celulares e respostas inflamatórias em tecido humano.

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Este trabalho foi financiado pela DFG-Cluster de Excelência &quot;Inflamação na Interfaces&quot; (RA-Se, RA-D). Somos gratos pela excelente assistência técnica de Kristin Wischnat.

1. Preparação de Chlamydia trachomatis Ações D Serovar <ol><li> Infect confluente 175 centímetros 2 balão de cultura de células HeLa contendo-229 células com 4 ml C. D trachomatis no SPG buffer. </li><li> Incubar durante uma hora a 37 ° C durante agitação constante. </li><li> Adicionar 20 ml de DMEM com FCS 10% e 240 uL Cicloheximida. </li><li> Incubar numa incubadora humidificada durante 48 h, a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Adicionar 5 ml pérolas de vidro estéreis, agitação forte para retirar e destruir C. trachomatis abrigando HeLa-229 células. </li><li> Recolher o sobrenadante e adicionar mais 5 ml de pérolas de vidro estéreis. </li><li> Rocha três vezes durante 1 min para destruir todas as células HeLa-229 e libertação C. trachomatis. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1000 RPMI e 4 ° C para se livrar de detritos celulares. </li><li> Recolher o sobrenadante para a infecção de 8 a 10 175 cultura de células cm 2 balões g confluenterown com HeLa 229 células. </li><li> Incubar a cada frasco com 4 ml de tampão SPG e 4 ml de sobrenadante infecção anterior durante uma hora a 37 ° C com agitação constante. </li><li> Depois de uma hora adicionar 15 ml de DMEM com FCS 10% e 230 uL cicloheximida seguido por 48 h de incubação a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Adicionar 5 ml pérolas de vidro estéreis, agite para retirar e destruir C. trachomatis abrigando HeLa-229 células. </li><li> Recolher o sobrenadante e adicionar mais 5 ml de pérolas de vidro estéreis. </li><li> Rocha três vezes durante 1 min para destruir todas as células HeLa-229 e libertação C. trachomatis. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1000 RPMI a 4 ° C para se livrar de detritos celulares. </li><li> Recolher o sobrenadante. </li><li> Encha 40 ml de sobrenadante em tubos de 50 ml Falcon, centrifugar durante 99 min com 11.000 RPMI. </li><li> Após centrifugação descartar o sobrenadante e lava-se o sedimento com 1 ml de tampão SPG. </li><li> Homogeneizar asedimento em 1 ml e SPG uL alíquota de 20 em um 1 5 ml, tubo Eppendorf loja, a -70 ° C até à utilização. A actividade biológica do stock preparada foi confirmada em uma estabelecida HeLa-229 modelo de infecção da célula. </li></ol> 2. Preparação da trompa de Falópio Humanos <ol><li> Armazenar humanos trompas de Falópio (HFT) de mulheres submetidas a histerectomia imediatamente após a cirurgia em RPMI contendo FCS a 5% sem antibióticos em 4 ° C até preparação. O protocolo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Lübeck (09-153). As mulheres incluídos no estudo (idade 34 até 53) não tinha história de C. antes trachomatis infecção. Tecido das trompas de Falópio foi coletada no periparto de esterilização, a pedido da mãe durante a cesariana ou durante histerectomias devido a fibróides uterinos sintomáticos na fase lútea. Todos HFT foram negativas para o C. trachomatis por PCR. </li><li> Dissecar a HFT numa placa de Petri contendo meio RPMI com5% de FCS sem antibióticos. Durante o processamento todo o tecido deve ser submersa em meios para evitar a secagem. </li><li> Corte e descarte do tecido conjuntivo e tecido destruído durante a cirurgia. </li><li> Após a dissecção abrir o HFT cuidadosamente com um bisturi de pequeno porte. </li><li> Para mais experiências preparar pedaços de tecido no tamanho de 0,5 cm x 0,5 cm até 1 cm x 1 cm. </li><li> Para a infecção espécime HFT loja em 1 ml de RPMI contendo FCS 5% sem antibióticos. Espécimes HFT foram infectadas com 5.5x10 5 IFU (unidades formadoras de inclusão) de C. trachomatis. </li><li> Incubar espécime HFT em 37 ° C, 5% de CO 2 e 21% de O 2, bem como em 37 ° C, 5% de CO 2 e 2% de O2 durante 24 h. </li><li> Após período de incubação coletar amostra e loja em fixador Monti para pelo menos três dias a 4 ° C até SEM / TEM preparação. </li></ol> 3. Preparação de amostras para TEM HFT <ol><li> ParaMET remover espécime de fixador Monti e cortar 2 x 2 mm a 4 x 5 pedaços mm. O tecido restante pode ser utilizada para MEV. </li><li> Lavar peças com tampão de cacodilato de sódio, pH 7,35 para 1 h. </li><li> Incubar em 1% (w / v) de tetróxido de ósmio em água destilada. durante a noite. </li><li> Remover o excesso de tetróxido de ósmio por lavagem min 6x5 em tampão de cacodilato de sódio, pH 7,35. </li><li> Remover a água por incubação em concentrações crescentes de etanol em água (v / v) (30% durante 2 h, 40% durante 2 h, 50% durante 2 h, 60% durante 2 h, 70% durante a noite, 80% para 2 h, 90% durante 1 h, 95% durante 1 h, 100% durante 1 h. </li><li> Lavar a etanol para 2 x 15 min em óxido de propileno e subsequentemente transferidos para uma mistura de 50% (v / v) araldite recentemente preparado (incluindo todos os componentes) em propileno e incubar durante a noite. </li><li> Transferência para araldite preparada de fresco (incluindo todos os componentes) durante pelo menos 1 h. </li><li> Transferir para moldes de incorporação de planos e preencher com araldite. </li><li> Deixe endurecer por aralditepelo menos 48 horas a 60 ° C </li><li> Após o corte da amostra incorporado corte semi cortes finos (700 nm) em um ultramicrótomo usando facas de vidro ou uma histo faca de diamante e manchar com mancha de Richardson. </li><li> Corte cortes ultrafinos de (aprox. 70 nm), utilizando uma faca de diamante e transferência para grades de cobre (por exemplo 150 mesh quadrado). </li><li> Stain ultra-finas secções com acetato de uranilo a 0,5% (w / v) em água destilada. seguido por 3% (w / v) de citrato de chumbo em água destilada. em um Stainer secção automático. Alternativamente, as secções podem ser corados manualmente, deixando grades 15 min em uma solução saturada de acetato de uranilo centrifugada em água destilada. seguido por citrato de chumbo 0,3% (w / v) em água destilada. </li></ol> 4. Preparação da amostra HFT para MEV <ol><li> Para remover SEM amostra de fixador Monti, orientar com epitélio voltado para cima em uma folha de cortiça 1,5 x 1 cm e fixar a posição usando agulhas de insetos. </li><li> Transferência espécime em cortiça para cestos metálicos adequados elave durante 30 min em tampão de cacodilato de sódio, pH 7,35. </li><li> Remover a água por incubação de amostra em concentrações crescentes de acetona / água misturas (v / v) 30% durante 6 h, 40% durante 6 h, 60% durante 8 h, 70% durante a noite, a 80% durante 2 h, 90% para 2% e 100 h durante a noite (ser extremamente cautelosos para manter espécime continuamente submerso). </li><li> Transferência para acetona a 100% fresco e amostra seca por secagem por ponto crítico (temperatura 40 ° C, pressão 80 bar). </li><li> Remover as agulhas, cortiça e espécimes cola com o epitélio voltado para cima sobre SEM montagem exemplar equipado com um guia de carbono condutora utilizando cimento de carbono condutora. Use prata condutora de líquido para aumentar a condutividade entre o suporte ea guia de carbono condutora. </li><li> Preparar um revestimento de ouro, platina ou paládio condutora da amostra, utilizando um revestidor por crepitação. </li></ol> 5. A coloração do Semi Seções finas com Stain Richardson <ol><li> Vamos semi seções finas seca em slide. </li><li> Stain secções com coloração solução a 60 ° C durante 1-2 min. </li><li> Lave em água destilada. </li><li> Trechos secos e lamela. </li></ol> 6. Os resultados representativos Dentro do modelo de infecção da trompa de Falópio humano fomos capazes de visualizar as diferenças na morfologia epitelial entre os controles não infectados (Figura 1) e do C. trachomatis - tubos infectados (Figura 2) sob condição normóxica. Característicos diferenças morfológicas implícita patógeno induzida por inchaço e lise de células epiteliais de trompas que não puderam ser detectados em controlos não infectados. Usando meias seções delgadas e microscopia eletrônica de transmissão pudemos provar C. intracelular formação trachomatis inclusão no tecido infectado ex vivo tubo falópico humana (Figura 3, 5), mas não em controles não infectados (Figura 4). Como concentração de oxigênioções no trato genital feminino já são baixas em condições fisiológicas 11, e diminui ainda mais durante um processo inflamatório que também investigou o nosso modelo sob condições de hipóxia. Os resultados preliminares indicam que o modelo é útil para analisar o crescimento clamídia e descendentes em diferentes concentrações de oxigênio. Chlamydia induzida danos em células epiteliais tem de ser separado de artefactos que são mediadas através da preparação e manuseamento descuidado das trompas de Falópio antes da infecção (Figura 6). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) de uma Falópio não infectado humano após um dia de incubação em meio de controle (seta verde mostrar ciliado célula seta azul mostra não-ciliado célula). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Eletrônica de varredura micros<html> cópia de varredura (MEV) de um ex C. trachomatis vivo infectado trompa de Falópio humana uma infecção pós dia (seta branca inclusão marca de ruptura). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Semi lâminas delgadas mostram típicas inclusões intracelulares (setas brancas) 1d após a infecção do tubo de falópio humana com C. ex vivo trachomatis. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="A Figura 4" /> Figura 4. Microscopia de transmissão de electrões (TEM) de um não-infectada tubo falópico humano após uma incubação dias em meio de controlo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="A Figura 5" /> A Figura 5 microscopia electrónica. De transmissão (TEM) de uma ex vivo C. trachomatis infectado trompa de Falópio humana uma infecção pós dia (setas brancas marcar inclusões clamídia). ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="A Figura 6" /> Figura 6. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) do epitélio trompa de Falópio danificada através da preparação e manuseio descuidado de amostra (branco setas marca destruído o tecido epitelial).

<ol><li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li>
<li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li>
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<li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55(2006).</li>
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<li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li>
<li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li>
<li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li>
<li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li>
<li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Visualização do patógeno-induzido dano ao tecido infectado é árdua e muitas vezes limitado a procedimentos experimentais em camundongos. Nós estabelecemos um modelo de infecção ex vivo em humanos trompas de Falópio para analisar C. infecções do tracto trachomatis fêmea genital superior. Através da utilização deste método, fomos capazes de visualizar C. trachomatis - dano induzido ao epitélio humano tubo de falópio dentro de uma infecção pós dia. Edema celular e lise eram típicas alterações morfológicas que foram observados em C. trachomatis - infectadas trompas de Falópio, mas não em controlos não infectados. Análises em MET revelaram que clamídias implementar um ciclo típico de desenvolvimento intracelular nos tecidos infectados, mostrando inclusões de grande porte com re diferenciadas corpos elementares, mas também inclusões menores, com corpos reticulados ampliadas que podem indicar a persistência. No entanto, o quadro morfológico sozinho não é suficiente para discriminar entre replinfecções icating e persistentes, que são caracterizadas por metabolismo reduzido e uma maior resistência aos agentes antimicrobianos 10. Destruição do epitélio de infectados trompas de falópio ou é devido ao rompimento de C. trachomatis - infectadas células epiteliais após a conclusão do ciclo de desenvolvimento intracelular e libertação de infecciosas corpos elementares ou a libertação de citoquinas pró-inflamatórias 8. Induzida por patógeno dano tecidual e de acolhimento induzidas reações imunes contra C. trachomatis devem ser os principais fatores que levam à perda da função das células epiteliais, fibroblastos e remodelação infertilidade tubária, finalmente, in vivo 8,11. Uma das principais limitações deste modelo é a ausência de células inflamatórias que dificulta a análise dos efeitos secundários para o C. inicial trachomatis infecção do epitélio trompa de Falópio. No entanto, o modelo é apquada para investigar diferentes condições ambientais (por exemplo, o teor de oxigénio) e da resposta do hospedeiro-imune inicial em C. aguda trachomatis 8,9. Existem planos para se estabelecer um modelo para testes de antimicrobianos contra C. trachomatis em toda humanos trompas de falópio e caracterizar os estados metabólicos dos diferentes estágios de desenvolvimento observadas no epitélio das trompas por 2-fótons microscopia de varredura a laser.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-802 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cicloheximida </td><td> Sigma - Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPG Tampão </td><td> vário </td><td></td><td> veja a receita abaixo </td></tr><tr><td> Fixador Monti </td><td> vário </td><td></td><td> veja a receita abaixo </td></tr><tr><td> tampão de cacodilato de sódio </td><td> vário </td><td></td><td> veja a receita abaixo </td></tr><tr><td> Richardson da mancha </td><td> vário </td><td></td><td> veja a receita abaixo </td></tr></tbody></table> Receitas: 1. SPG Tampão <ol><li> Adicionar 75 g de sacarose. </li><li> Adicionar 2,47 g de fosfato dissódico. </li><li> Adicionar 0,36 g de fosfato monossódico. </li><li> Adicionar 0,72 g de ácido glutâmico. </li><li> Preencha a 1 l com água destilada. </li><li> Ajustar o pH a 7,3. </li></ol> 2. 0,1 M de tampão cacodilato de sódio, pH 7,35. <ol><li> Adicionar 42,80 g dimethylarsenic sal sódico do ácido. </li><li> Adicionar 68,46 g de sacarose. </li><li> Preencha a 1 l com água destilada. para obter 0,2 M tampão de cacodilato de sódio. </li><li> Antes de usar solução diluída com água destilada. a desejada concentração e ajustar o pH a 7,35, se necessário. </li></ol> 3. Fixador Monti <ol><li> Adicionar 156 ml 0,12 M de tampão cacodilato de sódio. 3,2 Adicionar 25 ml glutaraldeído 25% em água destilada. </li><li> Adicionar 19 mlParaformaldeído 10% em água destilada. </li><li> Adicionar 3 ml de 3% CaCl 2 em água destilada. </li><li> Ajuste o pH para 7,35 e encha com água destilada. a 312 ml de solução final. </li></ol> 4. Richardson mancha <ol><li> Misturar partes iguais de azul de metileno a 1% em solução aquosa a 1% de bórax e 1% Azur II em água destilada. </li></ol>

um modelo de tubo de falópio humanos para investigação de<em&gt; c. trachomatis</em&gt; infecções

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Infecções do trato genital por Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) são as mais freqüentes doenças sexualmente transmitidas em mulheres em todo o mundo. Depuração ineficiente ou persistência dos patógenos pode levar a infecções ascendentes do trato genital e é suposto causar danos inflamatória crônica de 1,2 tecidos infectados. Como consequência, sequelas clínicas graves como a doença inflamatória pélvica (DIP), oclusão tubária e infertilidade pode ocorrer 3,4. A maioria das pesquisas com C. trachomatis foi conduzida em linhas de células epiteliais (por exemplo, células HEp-2 e HeLa-229) ou em ratinhos. No entanto, como com a célula de cultura de modelos baseados, eles nem reflectir a fisiologia do tecido nativo nem a patofisiologia da C. infecções do tracto genital trachomatis in vivo 5. Limitações adicionais são dadas pelo facto de cascatas de sinalização centrais (por exemplo IFN-γ MEDIATed JAK / STAT via de sinalização) que controlam o crescimento intracelular por clamídia diferem fundamentalmente entre ratos e seres humanos 6,7. Nós e os outros, portanto, estabeleceu um conjunto de órgãos modelo trompa de Falópio para investigar interações diretas entre C. trachomatis e humano da trompa de Falópio ex vivo de células 8,9. Para este efeito, humanos trompas de Falópio de mulheres submetidas a histerectomia foram recolhidas e infectados com C. trachomatis serovar D. Dentro de 24 h após a infecção amostra, onde analisadas em microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para detectar Chlamydia trachomatis mediada dano epitelial, bem como C. formação trachomatis inclusão no tecido de Falópio.

Nós descrevemos um<em&gt; Ex vivo infecção</em&gt; Modelo para a visualização de interações diretas de patógenos bacterianos com células de trompas. O modelo de tecido inteiro órgão foi estabelecido para investigar<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Patologia induzida ao tubo de falópio feminino em &quot;life-like&quot; condições.

Um Modelo de Tubo de Falópio Humanos para Investigação de<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Infecções

As infecções do trato genital por Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) são a doença sexualmente transmissível mais frequente em mulheres em todo o mundo. Ineficiente ...

Chlamydia trachomatis é uma bactéria gram-negativa, obrigatoriamente intracelular. Conhecem-se diferentes sorovares de Chlamydia que causam infecções oculares ou do trato genital. As infecções genitais por Chlamydia trachomatis são a doença sexualmente transmissível mais frequente no mundo.Eles são encontrados com uma prevalência de quase 3 milhões de infecções notificadas na União Europeia entre 1990 e 2009. Quase 400.000 casos foram notificados em 2009. Embora a saúde pública e a educação sexual estejam em constante melhoria, observa-se um aumento na taxa de novas infecções genitais por clamídia, passando de 70.000 casos em 1990 para 400.000 casos em 2009.75% de todas as novas infecções são relatadas em jovens com idade entre 15 e 24 anos. Acredita-se que as sequelas clínicas ocorram devido à eliminação ineficiente dos patógenos, o que pode levar a infecções ascendentes do trato genital inferior para o superior, e subsequentemente causar danos inflamatórios crônicos ao tecido infectado. De 10 a 30% das mulheres infectadas com clamídia traqueal desenvolvem uma doença inflamatória pélvica (DIP), e até 50% dos casos de DIP são atribuídos às infecções por clamídia traqueal.Como consequência, em 50% dos pacientes com infertilidade tubária e em 40% dos pacientes com gravidez ectópica, a clamídia, *C. trachomatis*, é encontrada como o patógeno causador. Em uma mulher saudável e não infectada, o óvulo fertilizado migra através da tuba uterina até o útero, onde se desenvolve até o parto. Em pacientes infectados, a clamídia pode ascender do trato genital inferior até a tuba uterina, desencadeando processos inflamatórios crônicos.Acredita-se que o dano induzido por patógenos nas células epiteliais e a perda de funções epiteliais centrais acabem por causar a obstrução tubária, resultando em transporte reduzido ou completamente abolido do óvulo dos ovários para o útero. Para esse fim, tubas uterinas humanas de mulheres submetidas à histerectomia são coletadas e armazenadas. As tubas são dissecadas e cuidadosamente abertas.De acordo com a configuração experimental, eles são cortados em pequenos espécimes e infectados com corpos elementares infecciosos de *Chlamydia trachomatis* por 24 a 48 horas após os respectivos pontos de tempo. Os espécimes são fixados com fixador de Monty por pelo menos três dias até o processamento posterior. Armazene os tubos uterinos humanos (HFT) de mulheres submetidas à histerectomia imediatamente após a cirurgia.Em RPMI contendo 5% de FCS sem antibióticos, a quatro graus Celsius até o preparo. Disseque o tubo uterino humano em uma placa de Petri contendo RPMI com 5% de FCS sem antibióticos durante todo o processamento. O tubo deve permanecer submerso no meio para evitar secagem, e os tecidos conjuntivos e os tecidos danificados durante a cirurgia devem ser cortados e descartados.Após a dissecação, abra cuidadosamente o TFM com um pequeno bisturi. Evite danos ao tecido por manuseio descuidado com pinça e bisturi. Prepare pequenos fragmentos de tecido com tamanho de cinco por cinco milímetros para infecção, armazene a amostra de TFM em um mililitro de RPMI contendo 5% de FCS sem antibióticos e adicione C track.Os corpúsculos elementares da amostra HFT de OMAS são incubados por até 48 horas a 37 graus Celsius, 5%CO2 e 20%O2 em um incubador comum ou em um ambiente com baixo teor de oxigênio, inferior a 5%O2 em uma câmara de hipóxia. Após os respectivos pontos de tempo de incubação, as amostras são coletadas e armazenadas em fixador de Monty por pelo menos três dias a quatro graus Celsius até o preparo para microscopia eletrônica de varredura ou microscopia eletrônica de transmissão. O tecido fixado é cortado em pequenos pedaços, lavado e incubado com 1%osmio e tetroxido durante a noite.Após várias etapas de lavagem e secagem, os espécimes desidratados são transferidos para aite recém-preparado e polimerizados por 48 horas a 60 graus Celsius. Após o corte, seções semifinas e ultrafinas são cortadas e transferidas para lâminas ou grades, respectivamente. Após a coloração, as seções semifinas podem ser examinadas usando um microscópio óptico para microscopia eletrônica de transmissão.Remova o espécime do fixador de Monty e corte em pedaços de até dois por dois por cinco milímetros. Após a lavagem e a incubação no tampão diluidor de CCO de sódio, lavagem com tetróxido de ósmio, desidratação e concentrações ascendentes de etanol, transfira o espécime para uma mistura de 50% de óxido de propileno e aite durante a noite. No dia seguinte, transfira para aite recém-preparado por pelo menos uma hora.Em seguida, transfira para moldes planos e preencha com aite, deixando o aerd dite polimerizar por 48 horas a 60 graus Celsius. Após o corte da amostra embutida, corte seções semifinas de aproximadamente 700 nanômetros ou seções ultrafinas de 70 nanômetros usando um ultramicrótomo equipado com uma lâmina de vidro ou, preferencialmente, uma lâmina de diamante. Analise o espécime em seções semifinas e ultrafinas por microscopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão para microscopia eletrônica de varredura.Os espécimes são fixados com o epitélio voltado para cima em placas de cortiça, lavados e desidratados utilizando concentrações crescentes de acetona. Após a secagem em um secador de ponto crítico, os espécimes são transferidos para um suporte de amostra de MEV e revestidos com platina, ouro ou paládio utilizando um sputter coater. Em seguida, estão prontos para serem analisados em um microscópio eletrônico de varredura para microscopia eletrônica de varredura.Remova o espécime do fixador de Monty e posicione o fragmento de tecido com o epitélio voltado para cima sobre uma folha de cortiça, fixando-o em posição com agulhas entomológicas. Após a lavagem com tampão caco dilatado de sódio, seque o espécime em um secador de ponto crítico após tratamento com acetona. Após a transferência do espécime da cortiça para um suporte de espécime para MEV, prepare um revestimento condutivo de platina, ouro ou paládio sobre o espécime utilizando um sputter coater; em seguida, transfira o espécime pulverizado para um microscópio eletrônico de varredura para análise adicional.A alta incidência de infecções por lumus em mulheres e as enormes consequências clínicas das infecções al ascendentes são a justificativa para intensificar a pesquisa básica e translacional nesta área. Utilizamos um modelo tecidual ex vivo do grupo de St.Perus, que estabeleceu previamente um modelo do tubo uterino humano, para caracterizar morfologicamente os danos celulares induzidos pela clamídia no tubo uterino. Com o uso deste método, observa-se a formação de inclusões intracelulares em diferentes estágios de desenvolvimento, evidenciando tanto infecções replicativas quanto persistentes.No entanto, ainda faltam evidências experimentais para a presença de clamídia persistente no tecido da tuba uterina humana, sendo necessária uma análise adicional quanto à clamídia, à prole e à superexpressão transcricional dos genes de persistência. Uma das principais limitações deste modelo é a ausência de células inflamatórias, o que prejudica a análise dos efeitos secundários decorrentes da infecção glaucomatosa inicial por KLA. No entanto, este modelo parece apropriado para analisar condições ambientais, como o teor de oxigênio no contexto do dano às células epiteliais da tuba uterina, bem como para analisar a resposta imune inicial do hospedeiro contra infecção glaucomatosa aguda.Um dos objetivos futuros é estabelecer um modelo mais elaborado para o teste de MIC de UTIs no modelo de tecido de tuba uterina humana com pH controlado, e utilizar este modelo para definir realmente os diferentes estágios de desenvolvimento dos CLI metabolicamente, fazendo uso da técnica de microscopia de varredura a laser de dois fótons.

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