Um Modelo de Tubo de Falópio Humanos para Investigação de

Chlamydia trachomatis é uma bactéria gram-negativa, obrigatoriamente intracelular. Conhecem-se diferentes sorovares de Chlamydia que causam infecções oculares ou do trato genital. As infecções genitais por Chlamydia trachomatis são a doença sexualmente transmissível mais frequente no mundo.

Eles são encontrados com uma prevalência de quase 3 milhões de infecções notificadas na União Europeia entre 1990 e 2009. Quase 400.000 casos foram notificados em 2009. Embora a saúde pública e a educação sexual estejam em constante melhoria, observa-se um aumento na taxa de novas infecções genitais por clamídia, passando de 70.000 casos em 1990 para 400.000 casos em 2009.

75% de todas as novas infecções são relatadas em jovens com idade entre 15 e 24 anos. Acredita-se que as sequelas clínicas ocorram devido à eliminação ineficiente dos patógenos, o que pode levar a infecções ascendentes do trato genital inferior para o superior, e subsequentemente causar danos inflamatórios crônicos ao tecido infectado. De 10 a 30% das mulheres infectadas com clamídia traqueal desenvolvem uma doença inflamatória pélvica (DIP), e até 50% dos casos de DIP são atribuídos às infecções por clamídia traqueal.

Como consequência, em 50% dos pacientes com infertilidade tubária e em 40% dos pacientes com gravidez ectópica, a clamídia, *C. trachomatis*, é encontrada como o patógeno causador. Em uma mulher saudável e não infectada, o óvulo fertilizado migra através da tuba uterina até o útero, onde se desenvolve até o parto. Em pacientes infectados, a clamídia pode ascender do trato genital inferior até a tuba uterina, desencadeando processos inflamatórios crônicos.

Acredita-se que o dano induzido por patógenos nas células epiteliais e a perda de funções epiteliais centrais acabem por causar a obstrução tubária, resultando em transporte reduzido ou completamente abolido do óvulo dos ovários para o útero. Para esse fim, tubas uterinas humanas de mulheres submetidas à histerectomia são coletadas e armazenadas. As tubas são dissecadas e cuidadosamente abertas.

De acordo com a configuração experimental, eles são cortados em pequenos espécimes e infectados com corpos elementares infecciosos de *Chlamydia trachomatis* por 24 a 48 horas após os respectivos pontos de tempo. Os espécimes são fixados com fixador de Monty por pelo menos três dias até o processamento posterior. Armazene os tubos uterinos humanos (HFT) de mulheres submetidas à histerectomia imediatamente após a cirurgia.

Em RPMI contendo 5% de FCS sem antibióticos, a quatro graus Celsius até o preparo. Disseque o tubo uterino humano em uma placa de Petri contendo RPMI com 5% de FCS sem antibióticos durante todo o processamento. O tubo deve permanecer submerso no meio para evitar secagem, e os tecidos conjuntivos e os tecidos danificados durante a cirurgia devem ser cortados e descartados.

Após a dissecação, abra cuidadosamente o TFM com um pequeno bisturi. Evite danos ao tecido por manuseio descuidado com pinça e bisturi. Prepare pequenos fragmentos de tecido com tamanho de cinco por cinco milímetros para infecção, armazene a amostra de TFM em um mililitro de RPMI contendo 5% de FCS sem antibióticos e adicione C track.

Os corpúsculos elementares da amostra HFT de OMAS são incubados por até 48 horas a 37 graus Celsius, 5%CO2 e 20%O2 em um incubador comum ou em um ambiente com baixo teor de oxigênio, inferior a 5%O2 em uma câmara de hipóxia. Após os respectivos pontos de tempo de incubação, as amostras são coletadas e armazenadas em fixador de Monty por pelo menos três dias a quatro graus Celsius até o preparo para microscopia eletrônica de varredura ou microscopia eletrônica de transmissão. O tecido fixado é cortado em pequenos pedaços, lavado e incubado com 1%osmio e tetroxido durante a noite.

Após várias etapas de lavagem e secagem, os espécimes desidratados são transferidos para aite recém-preparado e polimerizados por 48 horas a 60 graus Celsius. Após o corte, seções semifinas e ultrafinas são cortadas e transferidas para lâminas ou grades, respectivamente. Após a coloração, as seções semifinas podem ser examinadas usando um microscópio óptico para microscopia eletrônica de transmissão.

Remova o espécime do fixador de Monty e corte em pedaços de até dois por dois por cinco milímetros. Após a lavagem e a incubação no tampão diluidor de CCO de sódio, lavagem com tetróxido de ósmio, desidratação e concentrações ascendentes de etanol, transfira o espécime para uma mistura de 50% de óxido de propileno e aite durante a noite. No dia seguinte, transfira para aite recém-preparado por pelo menos uma hora.

Em seguida, transfira para moldes planos e preencha com aite, deixando o aerd dite polimerizar por 48 horas a 60 graus Celsius. Após o corte da amostra embutida, corte seções semifinas de aproximadamente 700 nanômetros ou seções ultrafinas de 70 nanômetros usando um ultramicrótomo equipado com uma lâmina de vidro ou, preferencialmente, uma lâmina de diamante. Analise o espécime em seções semifinas e ultrafinas por microscopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão para microscopia eletrônica de varredura.

Os espécimes são fixados com o epitélio voltado para cima em placas de cortiça, lavados e desidratados utilizando concentrações crescentes de acetona. Após a secagem em um secador de ponto crítico, os espécimes são transferidos para um suporte de amostra de MEV e revestidos com platina, ouro ou paládio utilizando um sputter coater. Em seguida, estão prontos para serem analisados em um microscópio eletrônico de varredura para microscopia eletrônica de varredura.

Remova o espécime do fixador de Monty e posicione o fragmento de tecido com o epitélio voltado para cima sobre uma folha de cortiça, fixando-o em posição com agulhas entomológicas. Após a lavagem com tampão caco dilatado de sódio, seque o espécime em um secador de ponto crítico após tratamento com acetona. Após a transferência do espécime da cortiça para um suporte de espécime para MEV, prepare um revestimento condutivo de platina, ouro ou paládio sobre o espécime utilizando um sputter coater; em seguida, transfira o espécime pulverizado para um microscópio eletrônico de varredura para análise adicional.

A alta incidência de infecções por lumus em mulheres e as enormes consequências clínicas das infecções al ascendentes são a justificativa para intensificar a pesquisa básica e translacional nesta área. Utilizamos um modelo tecidual ex vivo do grupo de St.Perus, que estabeleceu previamente um modelo do tubo uterino humano, para caracterizar morfologicamente os danos celulares induzidos pela clamídia no tubo uterino. Com o uso deste método, observa-se a formação de inclusões intracelulares em diferentes estágios de desenvolvimento, evidenciando tanto infecções replicativas quanto persistentes.

No entanto, ainda faltam evidências experimentais para a presença de clamídia persistente no tecido da tuba uterina humana, sendo necessária uma análise adicional quanto à clamídia, à prole e à superexpressão transcricional dos genes de persistência. Uma das principais limitações deste modelo é a ausência de células inflamatórias, o que prejudica a análise dos efeitos secundários decorrentes da infecção glaucomatosa inicial por KLA. No entanto, este modelo parece apropriado para analisar condições ambientais, como o teor de oxigênio no contexto do dano às células epiteliais da tuba uterina, bem como para analisar a resposta imune inicial do hospedeiro contra infecção glaucomatosa aguda.

Um dos objetivos futuros é estabelecer um modelo mais elaborado para o teste de MIC de UTIs no modelo de tecido de tuba uterina humana com pH controlado, e utilizar este modelo para definir realmente os diferentes estágios de desenvolvimento dos CLI metabolicamente, fazendo uso da técnica de microscopia de varredura a laser de dois fótons.