A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

Neste vídeo, descrevemos um procedimento eficiente em termos de tempo e custo para a expressão de proteínas secretadas a partir de células T Durant HEC 2 9 3 fabricadas. Inicialmente, uma cultura de células T HEC 2 9 3 Cofluent 40% é preparada em uma placa de seis mundos. Uma mistura de transfecção é então produzida diluindo o suco do gene e, em seguida, testa os plasmídeos em meio livre de soro.

A mistura de transfecção é depositada nas células, que são então incubadas a 37 graus Celsius para permitir a expressão da proteína. A detecção de proteína no agente supan pode ser realizada por western blot. Uma vez que uma construção adequada é identificada, o procedimento pode ser ampliado usando fábricas de células de 10 camadas.

As células são transfectadas usando PEI como transfecção. O reagente e a proteína podem ser colhidos dos sobrenadantes da cultura usando filtração de fluxo tangencial seguida de cromatografia de afinidade. Em última análise, esta plataforma permite a expressão de uma ampla gama de macromoléculas em quantidades de miligramas.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a expressão de células de insetos baseada em vírus balo, é que um grande número de construções pode ser rastreado e ampliado para expressão com resultados obtidos em questão de três semanas. Demonstrando este procedimento estará Hello Aiden para Shada Zini e Jonathan Cook. Três alunos de pós-graduação do meu laboratório: Comece semeando 250.000 células HEC 2 9 3 T por poço em um volume de um mililitro em uma placa de seis poços, adicione um mililitro por poço de 10% FBS pentre suplementado com DMEM e S gire a placa para dispersar as células uniformemente.

Em seguida, incube as células durante a noite em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius. Quando as células atingirem uma cofluência de cerca de 40%, substitua o SUP natum por dois mililitros de meio fresco para preparar a mistura de transfecção. Primeira alíquota de 90 microlitros de soro livre de DMEM em um tubo de eend orph.

Em seguida, adicione três microlitros de suco de gene, o reagente de transfecção misture suavemente o conteúdo do tubo e incube-o em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione 10 microlitros de um estoque de 100 nanogramas por microlitro do plasmídeo purificado mini preparado, DNA. Para ser transfectado.

Misture o conteúdo do tubo e deixe descansar em temperatura ambiente por 15 minutos. Para realizar a transfecção, deposite a mistura nas células HEC 2 9 3 T. Gota a gota, inche a placa suavemente para distribuir a mistura de transfecção uniformemente.

Em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius. 24 horas depois, adicionar um mililitro de meio fresco a cada poço e incubar por mais 48 horas. Três dias após a transfecção, colher o supinato e detectar os níveis de expressão da proteína de interesse por western blot.

Uma vez que uma construção apropriada tenha sido identificada, o procedimento de transfecção pode ser ampliado. Usando fábricas de células de 10 camadas, preencha uma fábrica de células com 1,2 litros de DMEM suplementado com 5% de FBS. Em seguida, adicione 200 milhões de células HEC 2 9 3 T, distribuindo as células uniformemente por todas as camadas.

Quatro frascos de cultura de células quadradas T de 225 centímetros cultivados até 100% de fluência de Co contêm cerca de 200 milhões de células. Incube as células a 37 graus Celsius durante a noite. Prepare a mistura de transfecção em um frasco T 75 diluindo 840 microgramas de DNA em 84 mililitros de estéril uma vez. Pbs.

Adicione 2,5 mililitros de um miligrama por mililitro, solução de íons de polietileno ou PEI e incube a mistura em temperatura ambiente por 15 minutos. A solução deve ficar turva. Em seguida, despeje lentamente a mistura de transfecção na fábrica de células e distribua-a completamente.

Camadas gerais. Adicionar ácido valpróico a uma concentração final de quatro milimolares. Isso aumentará os rendimentos de expressão assim que a mistura de transfecção for adicionada.

Incube a cultura a 37 graus Celsius por quatro dias para permitir a expressão da proteína. Colha o meio quatro dias após a transfecção e limpe imediatamente a fábrica de células para reutilização, centrifugue o meio coletado a 6.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius e filtre-o através de um aparelho de filtro a vácuo de copo estérico de 0,22 mícron para remover qualquer material particulado. Em seguida, utilizar o sistema de filtração do fluxo tangencial centra mate para concentrar o sobrenadante a 75 ml.

Uma vez que o sobrenadante esteja concentrado, a proteína de interesse pode ser purificada por cromatografia de afinidade. Neste experimento, purificamos as subunidades ligadas por HA do domínio extracelular AAL humano de dois receptores usando o sistema de larga escala descrito aqui, seguido de cromatografia anti THA de alta afinidade. Conforme mostrado nesta análise de página SDS manchada de kumasi.

Os domínios extracelulares das subunidades alfa e gama do receptor de interleucina dois migram nos pesos moleculares de 40 kilodaltons e 46 kilodaltons. A heterogeneidade dos glicanos EnLink presentes em IL dois R alfa e IL dois R gama causou alargamento de banda no gel de página SDS. A banda de maior peso molecular representa a contaminação da BSA.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expressar proteínas da cultura de células humanas usando fábricas de células de 10 camadas. Não se esqueça de que as células T HC 2 93 são consideradas de risco biológico e devem ser manuseadas no nível de biossegurança dois. Por favor, use sempre roupas de proteção individual adequadas, e as superfícies devem ser desinfetadas de acordo com as diretrizes institucionais e governamentais.