Name: A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprenda a expressão de proteínas secretadas em células HEK 293T humanas. Este método eficiente permite produzir proteínas recombinantes em conformações nativas, escalável para fábricas de células de 10 camadas.

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Este trabalho foi financiado por um Tratamento HIV Ontario Rede de Pesquisa Operacional Grant (ROG-G645) e Canadian Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113554) para JEL, e da Universidade de Bolsas de Toronto para HA, FCA, e JDC. Os autores gostariam de agradecer Marnie Fusco, Dafna Abelson e Dr. Erica Ollmann Saphire no The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) para as células que fornecem, vetor de expressão Ebolavirus GP e conselhos gerais.

<ol><li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li>
<li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li>
<li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).</li>
<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li>
<li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Ebola+virus+glycoprotein+bound+to+an+antibody+from+a+human+survivor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor.</a> Nature. 454, 177-182 (2008).</li>
<li>Bowden, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+Nipah+and+Hendra+virus+attachment+to+their+cell-surface+receptor+ephrin-B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).</li>
<li>Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+expression+of+an+anti-human+C5+chimeric+Fab+utilizing+a+vector+that+replicates+in+COS+and+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells.</a> J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).</li>
<li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+protein+expression+in+scalable+CHO+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-level protein expression in scalable CHO transient transfection.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).</li>
<li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li>
<li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+tactics+used+in+determining+the+structure+of+trimeric%2C+prefusion+Ebola+virus+GP%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP.</a> Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).</li>
<li>Aricescu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression%3A+developments+for+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression: developments for structural proteomics.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Chang, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li>
<li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li>
<li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li>
<li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li>
<li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha%2C+beta%2C+and+gammac+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As fábricas 10-camada de células são um vaso eficaz para a produção de quantidades de miligramas de proteína. Uma grande vantagem de utilizar a fábrica celular sobre outros vasos tradicionais, tais como garrafas cilíndricas, frascos de agitação ou frascos giratórios, é que eles não requerem a aquisição de qualquer equipamento de laboratório adicional. Um padrão incubadora de CO 2 (aproximadamente 6,0 Cu. Ft) irá facilmente acomodar quatro fábricas 10 da camada de células (Fig. 2). Além disso,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Fosfatase alcalina (BCIP / NBT) de solução de substrato líquido </td><td> Sigma </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico / antimicótico, 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA matriz de afinidade, o clone 3F10 </td><td> Roche </td><td> 1815016 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-HA de murino mAb, clone 16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> Balão de cultura de células, cultura de tecidos T75 centímetros 2 tratada </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Balão de cultura de células, T225 centímetros de cultura de tecidos 2 tratada </td><td> Corning </td><td> 431082 </td><td></td></tr><tr><td>As placas de cultura de células bem ,6-cultura de tecidos tratados </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Fábrica de células, CellSTACK 10 camadas </td><td> Corning </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega Cassete 5K </td><td> Mortalha </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate Omega 30K Cassete </td><td> Mortalha </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> Cromatografia em coluna de vidro, cm 1.0x10 </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloxacina </td><td> Sigma </td><td> 17850 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Meios Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino (FBS), inactivado pelo calor </td><td> Invitrogen </td><td> 12484-028 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE reagente transfecção HD </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuice reagente transfecção </td><td> EMD / Merck </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Sigma </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> Cabra anti-rato IgG F (ab &#39;) 2 alcalina </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31324 </td><td></td></tr><tr><td> fosfatase anticorpo conjugado </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemaglutinina (HA) péptido, 100 mg </td><td> GenScript </td><td> síntese feita sob encomenda </td><td></td></tr><tr><td> (Seqüência: YPYDVPDYA; grau de pureza 95%) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> As células HEK 293T </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> Household lixívia (4% w / v de hipoclorito de sódio) </td><td> várias marcas estão disponíveis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P PVDF membrana </td><td> Millipore </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> Miniprep kit de purificação de plasmídeo, PureLink rápida </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> MaxiPrep kit de purificação de plasmídeo, PureLink HiPure </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> vetor de expressão pDISPLAY </td><td> Invitrogen </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina (pen / strep), 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Salino tamponado com fosfato (PBS) estéril, 1X </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilenoimina (PEI), lineares 25 kDa </td><td> Polyscience </td><td> 23966 </td><td></td></tr><tr><td> Leite desnatado em pó seco </td><td> Cravo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP unidade de filtração PES vácuo, </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0,22, 500 ml de capacidade </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trypan azul </td><td> Invitrogen </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA, 0,05% (w / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> O ácido valpróico </td><td> Sigma </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate sistema de fluxo tangencial </td><td> Mortalha </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Incubadora de CO 2 umidificado, padrão 6.0 cu. pé </td><td> várias marcas estão disponíveis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eletroforese e transferência </td><td> várias marcas estão disponíveis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Incubadora, a 37 ° C </td><td> várias marcas estão disponíveis </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

A expressão da proteína recombinante em bactérias, tipicamente E. coli, tem sido a estratégia mais bem sucedido para a expressão quantidade miligrama de proteínas. No entanto, hospedeiros procarióticos não são frequentemente como apropriado para a expressão de humanos, as proteínas virais ou eucarióticos, devido à toxicidade da macromolécula externa, as diferenças de a máquina de dobragem de proteína, ou devido à falta de modificações específicas co ou pós-translacional em bactérias. Os sistemas de expressão baseados em levedura (P. pastoris ou S. cerevisiae) 1,2, baculovírus-infectada de insectos (S. frugiperda ou T. ni), as células 3, e livre de células in vitro tradução sistemas 2,4 foram utilizados com sucesso para produzir proteínas de mamíferos. Intuitivamente, a melhor correspondência é usar um hospedeiro mamífero para assegurar a produção de proteínas recombinantes que contêm as adequadas modificações pós-translacionais. Um certo número de linhas de células de mamíferos (Kid embrionário humanoNey (HEK) 293, C V-1 em células que transportam o O RIGEM S V40 larget antigénio T-(COS), de Ovário de Hamster Chinês (CHO), e outros) têm sido utilizados com sucesso para superexpressar quantidades de miligramas de um número de proteínas humanas 5-9. No entanto, as vantagens da utilização de células de mamíferos são frequentemente contrariada pela custos mais elevados, a exigência de equipamento de laboratório especializado, rendimentos mais baixos de proteína, e os tempos longos para desenvolver linhagens de células estáveis ​​de expressão. Aumento de produtividade e produção de proteínas mais rápido, mantendo os custos baixos, são fatores importantes para muitos laboratórios acadêmicos e comerciais. Aqui, nós descrevemos um tempo e custo-eficácia, o procedimento de duas partes para a expressão de proteínas secretadas humanos a partir de células aderentes HEK 293T. Este sistema é capaz de produzir quantidades de micrograma miligrama de proteína funcional para estudos estruturais, biofísicas e bioquímicas. A primeira parte, as construções de múltiplas do gene de interesse são produzird em paralelo e transientemente transfectados para células aderentes HEK 293T em pequena escala. A detecção e análise de proteína recombinante segregada no meio de cultura de células é realizada por análise de Western blot utilizando anticorpos comercialmente disponíveis dirigidos contra uma etiqueta de purificação do vector proteína codificada. Subsequentemente, as construções adequadas para produção em larga escala de proteínas são transitoriamente transfectadas utilizando polietilenoimina (PEI) em fábricas 10 da camada de células. As proteínas segregadas no litros de volumes de meio condicionado são concentrados em quantidades administráveis ​​usando filtração de fluxo tangencial, seguido de purificação por anti-HA cromatografia de afinidade. A utilidade desta plataforma é comprovada pela sua capacidade de expressar quantidades de miligramas de citocinas, receptores de citocinas, receptores da superfície celular, os factores de restrição intrínsecas, e glicoproteínas virais. Este método foi também utilizada com sucesso na determinação estrutural das 5,10 da glicoproteína triméricos Ebolavirus. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Em conclusão, esta plataforma oferece facilidade de uso a velocidade e escalabilidade, maximizando a qualidade da proteína e funcionalidade. Além disso, nenhum equipamento adicional, que não seja um padrão humidificada incubadora de CO 2, é necessário. Este procedimento pode ser rapidamente expandido para sistemas de maior complexidade, tais como co-expressão de complexos de proteína, antigénios e anticorpos, produção de partículas semelhantes a vírus para as vacinas, ou a produção de adenovírus ou lentivírus para transdução de linhas de células difíceis.

Na era pós-genômica humana, a disponibilidade de proteínas recombinantes em conformações nativas é crucial para a investigação estrutural, funcional e terapêutico e desenvolvimento. Aqui, nós descrevemos um-teste e em grande escala sistema de expressão de proteínas em células humanas embrionárias de rim 293T que podem ser utilizados para produzir uma variedade de proteínas recombinantes.

A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

A expressão de proteínas recombinantes em bactérias, tipicamente E. coli, tem sido a estratégia mais bem-sucedida para a expressão de proteínas em quantidades de miligramas.

Neste vídeo, descrevemos um procedimento eficiente em tempo e custo para expressão de proteínas secretadas a partir de células HEK 293T. Inicialmente, uma cultura de células HEK 293T com 40% de confluência é preparada em uma placa de seis poços. Uma mistura de transfeção é então produzida diluindo-se o GeneJuice e os plasmídeos de teste em meio livre de soro.A mistura de transfeção é depositada sobre as células, que são então incubadas a 37 graus Celsius para permitir a expressão proteica. A detecção da proteína no sobrenadante pode ser realizada por meio de western blot. Uma vez identificado um construto adequado, o procedimento pode ser ampliado utilizando fábricas de células com 10 camadas.As células são transfectadas utilizando PEI como o reagente de transfeção. As proteínas podem ser isoladas dos sobrenadantes de cultura por meio de filtração tangencial seguida de cromatografia de afinidade. Em última análise, esta plataforma permite a expressão de uma ampla gama de macromoléculas em quantidades da ordem de miligrama.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a expressão em células de inseto baseada em vírus baculovírus, é que um grande número de

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Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

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Protocolos para implementação de uma Escherichia coli Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

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