Extração de RNA a partir de células Neuroprecursor Usando o Bio-Rad Total de RNA Kit

Olá, sou Josh Sh, aluno de pós-graduação no laboratório do Dr. Ed Maki na Universidade da Califórnia em Irvine. Vou mostrar a vocês como extrair RNA de células precursoras neurais utilizando este kit BioRad To RNA Mini. Já estou usando este kit há alguns anos neste laboratório e ele sempre me forneceu resultados consistentes com altos rendimentos.

As células que utilizamos são células precursoras neurais Eton e meio, dissociadas agudamente de cortices embrionários, e normalmente as semeamos em uma placa de cultura de tecidos com 24 poços, tratada e revestida com PD L e laminina, semeando cerca de cem mil células por poço. Antes de começar, devo informar que você deve trabalhar em uma bancada designada especificamente para seu trabalho com RNA. O primeiro passo é garantir que a sua bancada de RNA esteja limpa.

A maneira apropriada de limpar a bancada é usar este RNA zap. Basicamente, ele elimina qualquer RNA, pois o RA destrói seus RNAs. Outra coisa é usar luvas sempre que estiver manipulando a extração, porque sua pele está cheia desses RNAs.

Portanto, é totalmente proibido. Ok, o que tenho aqui é o kit mini de RNA total da BioRad. Retirei o conteúdo, então deixe-me mostrar o que ele contém.

A primeira coisa é que temos um PBS tratado com X dep C e temos etanol tratado com DEP a 70%. Temos uma solução de licenciamento de RNA total à qual foi adicionado etanol Dan me maiúsculo. A segunda é uma lavagem de baixa rigidez à qual foi adicionado etanol a 100%, a lavagem de alta rigidez, a solução de diluição de DNA, o próprio DNA e a eluição de RNA total.

Solução, que colocaremos no bloco de aquecimento a 70 graus. As outras coisas de que precisamos são tubos com tampa de 1,5 mL. Estes não contêm DNAs ou inibidores, portanto certifique-se de ter tubos que não contenham essas substâncias.

E temos dois tubos de 2 mL sem tampa. E a coisa mais importante de todas é a própria coluna de RNA. Sem ela, não é possível realizar as extrações de RNA.

Portanto, para montar essas colunas, você precisa da coluna de RNA e precisa das duas tampas sem mil, e basta montá-las assim; com isso, você deverá estar pronto para começar. Ok, e a última coisa de que sempre precisamos são essas células. As células aqui são células pré-core neurais de Eton e meia.

Foram dissociadas agudamente a partir de cortices embrionários. Foram cultivadas por alguns dias em meio Temple. Retirei as células do incubador a 37 graus.

Este protocolo é específico para células aderentes. Essas células foram cultivadas em placas de cultura de tecidos tratadas com 0,4 poços, revestidas com PDL e laminina. Agora vou pegar uma mangueira de vácuo e vou aspirar o meio.

E o próximo passo é adicionar cerca de 500 microlitros do SEA PBS dep. E novamente, queremos usar ponteiras com filtro. O PBS, o que ele faz, é basicamente lavar o meio.

Portanto, você não deseja que nenhum componente do meio entre na sua coluna de RNA ou interfira na extração de RNA, caso contrário, não obterá bons rendimentos. Ok? Vou aspirar rapidamente o PBS porque as células-tronco neurais não gostam do PBS. Agora vou adicionar 350 microlitros de tampão de lise a cada uma.

Bem novamente, certifique-se de que você tem etanol beta a 100% no tampão de licença. Agora vou pipetar para cima e para baixo o tampão de lise 15 vezes para garantir que as células estejam lisadas. Assim, podemos extrair o conteúdo de RNA.

Agora vou adicionar etanol 70% a cada poço; depois de adicionar 350 microlitros desse etanol 70%, vou pipetar para cima e para baixo em cada poço 10 vezes. Pipetei para cima e para baixo 10 vezes em cada poço. Agora vou ajustar meu pipetador para mais de 700 microlitros, já que o volume total de cada poço é de 700 microlitros.

Então, depois de coletar o material com volume superior a 700 microlitros, vou dispensá-lo em uma coluna de RNA. Após adicionar o conteúdo à coluna, vou levá-la à centrífuga e realizar uma centrifugação por 30 segundos em velocidade máxima. Após a primeira centrifugação do lisado por 32 segundos, descartarei o filtrado despejando-o em um recipiente vazio.

Ou o que algumas outras pessoas fazem é usar uma mangueira de aspiração para remover o filtrado. Em seguida, você vai adicionar 700 microlitros do tampão de lavagem de baixa rigidez. E novamente, certifique-se de adicionar o etanol a ele.

Agora vou centrifugar por 30 segundos em velocidade máxima. Após centrifugar o tampão de lavagem de baixa rigidez, vou descartar o filtrado. Está bem? Então vou preparar a solução de D, o DNA.

Então, para cada amostra, você vai adicionar cinco microlitros de DNA. No nosso caso, na verdade, aliquotamos o DNA antes mesmo de começar este procedimento, pois, novamente, é uma enzima.

É melhor armazená-los como alíquotas. Se você os armazenar em conjunto, os ciclos de congelamento e descongelamento destruirão a atividade enzimática. Assim, após adicionar os cinco microlitros de DNA, vou diluí-los com 75 microlitros da solução de diluição de DNA.

Então, após você adicionar isso, o volume total será de 80 microlitros de solução de DNA. Agora vou adicionar 80 microlitros da solução de DNA a cada amostra. Certifique-se de colocá-la diretamente sobre a membrana da coluna.

Portanto, você quer que a solução de DNA impregne a membrana. Assim, você removerá o DNA. Dessa forma, aumentará o seu rendimento de RNA.

Então, após adicionar os DNAs, você deixará a coluna em repouso por 15 minutos à temperatura ambiente para permitir que a enzima realize seu trabalho. E novamente, você incubará por 15 minutos. Muito bem, o temporizador foi desligado.

Após a incubação de 15 minutos, vou centrifugar e pelotizar os DNAs por 30 segundos em velocidade máxima. Ok, após a centrifugação por 30 segundos para remover os DNAs, vou descartar o filtrado. Agora vou adicionar 700 microlitros de um tampão de alta rigidez para remover qualquer DNA residual.

Em seguida, após adicionar isso, vou centrifugar novamente por mais 30 segundos. Após a centrifugação, vou me livrar do filtrado de alta stringência, descartando-o simplesmente despejando-o em um recipiente. E vamos adicionar 700 microlitros do tampão de baixa stringência.

Desta vez, vou centrifugar por um minuto em velocidade máxima na Centri Beach. Após a primeira lavagem de baixa rigidez por um minuto, descartarei o filtrado. E, desta vez, não adicionarei nada, mas centrifugarei novamente por mais dois minutos para eliminar o excesso de tampão de baixa rigidez, pois o tampão de baixa rigidez contém etanol, o que reduziria o seu rendimento de RNA.

Agora vou retirar o tampão de eluição do bloco de aquecimento a 70 graus. Só para lembrá-lo, certifique-se, antes de iniciar o experimento, de que o tampão de eluição está a 70 graus, e queremos mantê-lo aquecido para aumentar a eficiência do seu rendimento de RNA. Então, já tenho as colunas prontas.

Eles foram retirados da centrífuga. Então, nos próximos passos, eles retiram as colunas. Ok, vou descartar os tubos de tampa e vamos transferi-los para estes tubos cat.

Você vai adicionar 50 microlitros do tampão Lucian a cada coluna. Certifique-se de aplicar o tampão de eluição na membrana para que ela o absorva completamente. Caso contrário, você não obterá um bom rendimento de RNA.

Agora deixe a coluna em repouso por um ou dois minutos para garantir que a solução esteja penetrando na membrana da coluna. Ok, já se passou um minuto. Agora posso levá-la para a centrífuga.

Agora vou colocar as colunas na centrífuga. Vou centrifugar por um minuto em velocidade máxima. Este é o último passo de centrifugação, no qual você coletará o eluato ou o RNA nos tubos com tampa.

Agora, após a última centrifugação, retire o conteúdo, remova a coluna, descarte-a, feche o tubo e, em seguida, armazene-os no congelador a -80. Mais tarde, você poderá utilizá-los conforme desejar. Acabei de extrair o RNA utilizando o kit de RNA da BioRad. Agora vou medir a concentração do RNA extraído, ou podemos ler a DO dele utilizando um espectrofotômetro.

Então, isso é o que vou mostrar a você. Primeiro, temos que preparar uma mistura de diluição. Será uma diluição de um para cinco.

Vamos misturar nosso RNA e água MQ filtrada. Primeiro, vou preparar um branco. Então, vou pegar dois microlitros da nossa solução de eluição que usamos para eluir nosso RNA anteriormente e vou adicionar oito microlitros de água molecular. Está bem?

Então, essa é a nossa amostra em branco. Agora vou preparar a amostra. Serão dois microlitros, nosso RNA de interesse.

Vamos adicionar, novamente, oito microlitros de água MQ. Assim, teremos uma diluição de um para cinco, certo? Tenho este micropipetador de vidro no qual vou colocar minhas amostras e, em seguida, vou carregar o micropipetador no espectrômetro.

Então vamos medir isso. Antes de medir a DO das amostras de RNA, precisarei limpar meu vete. Mais uma vez, aqui está o vete de vidro.

Você nunca, jamais deve tocar na parte frontal dele. Caso contrário, deixará impressões e eu obterei medidas incorretas. Então, o que vou fazer primeiro é lavar a chave de vidro com água DI dupla.

Então, vou pegar uma mangueira de vácuo. Vou aspirar a água. Após essa lavagem, vou lavar com etanol 95%, e então vou usar a mangueira de vácuo novamente para remover o etanol.

Agora estou pronto para carregar meu branco. Precisamos do branco primeiro para normalizar nossas leituras. Então, vou retirar 10 microlitros da mistura que acabamos de preparar.

Então, vou misturar nossa solução de cima para baixo e obter uma boa homogeneização. Vou levá-la ao espectrofotômetro. Este é o aparelho Ultra Spec 3 com sonda, e vamos medir a concentração de RNA.

Então, abra a máquina e coloque-a em um desses suportes. Vamos manipular os programas de forma que leiam apenas RNA. Ok, novamente, fizemos uma diluição de um para cinco.

Portanto, queremos definir nosso fator de diluição em cinco. Ok, então estou pronto para começar. Vou pressionar "executar" para referenciar o branco.

Tudo bem, agora está zerado. Então, agora estamos prontos para medir nossa amostra. Vou retirar o suporte de vidro.

Vou aspirar o conteúdo do branco. Novamente, vou lavá-lo com água duplamente destilada. Vou lavá-lo com etanol a 95%.

Agora estou pronto para carregar 10 microlitros da nossa amostra de interesse. Mais uma vez, certifique-se de que deseja misturar sua amostra. Bem, carregue-a no tubo de vidro.

Agora estamos prontos para a leitura. Após medir a DO, um bom rendimento deve apresentar uma razão de absorvância de RNA de 260 para 280 em torno de 2. E o rendimento é de aproximadamente 144 microgramas por mililitro.

Embora a máquina indique 72 microgramas por mil, precisamos multiplicar esse valor por dois devido ao comprimento reduzido em nossos vetores, dois centímetros mostraram como extrair RNA de células precursoras neurais. Novamente, estamos utilizando o kit total mini RNA da BioRad. Testamos outros kits e este é o melhor kit que utilizamos com base em sua eficiência.

Isso fornece RNA de alta qualidade. Se você usar este kit, obterá os mesmos resultados de alta qualidade que sempre obtemos.