A gravação ótica da atividade neural supraliminares com resolução de uma única célula e um único pico

O objetivo geral do experimento FollowMe é registrar a atividade de pico neural de um grande número de neurônios. Isso é conseguido observando o aumento da concentração de cálcio intracelular em um soma de neurônio associado a cada potencial de ação usando microscopia de fluorescência na primeira etapa. A excitação de dois fótons e um princípio de varredura de acesso aleatório são usados para registrar sinais fluorescentes de cálcio de 40 neurônios somato com alta resolução espacial e temporal.

Na segunda etapa, os tempos precisos de pico são extraídos dos sinais fluorescentes usando um algoritmo de deconvolução. Essa técnica pode ser usada para registrar a atividade de pico de dezenas de neurônios. Os dados de pico podem ser usados para medir informações mútuas, propagação de sinal entre populações neuronais ou correlações neurológicas.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como gravações de microeletrodos, é que se pode registrar a atividade de pico de neurônios de um grande número de neurônios de uma população local. Este método pode ajudar a responder questões-chave sobre a função cortical no nível das redes locais de neurônios, como a importância da busca de correlações de informações e mudanças na dinâmica das redes com plasticidade corticológica Para excitação de dois fótons, um sistema de laser de pulso infravermelho com pulsos de femtossegundos é usado. Uma alta potência de saída do laser é necessária para compensar as grandes perdas introduzidas pelos componentes ópticos do sistema.

Um pregador por sistema consistindo em dois prismas transmite uma dispersão negativa da velocidade do grupo nos pulsos de laser antes dos defletores ópticos de custo para compensar a dispersão temporal introduzida pelos AODs, dois AODs com grandes aberturas desviam o feixe de laser em duas dimensões. Uma classificação de difração reflexiva com 100 ranhuras por milímetro é colocada 13 centímetros atrás dos AODs para compensar a dispersão espacial introduzida pelos AODs. Ao usar pulsos de laser curtos, o feixe de laser é direcionado com dois telescópios de retransmissão para a porta da câmera de um microscópio vertical.

As íris são colocadas em intervalos regulares para alinhamento dos componentes ópticos. Um divisor de feixe dicróico na frente da objetiva transmite a luz de excitação infravermelha para a amostra e reflete a luz de fluorescência da amostra para um detector. Os detectores de fluorescência Epi e trans coletam o sinal de fluorescência através da objetiva e os filtros de vidro colorido do condensador são colocados na frente dos detectores para evitar que a luz de excitação atinja os detectores.

Os ângulos de deflexão A OD são controlados por um computador equipado com uma placa conversora analógica digital, que por sua vez aciona osciladores controlados por tensão. O sinal dos fotomultiplicadores é retransmitido através de um filtro Butterworth passa-baixa com uma frequência de corte de 100 kilohertz e é digitalizado por um conversor digital analógico a uma taxa de clock de 156,25 kilohertz antes de ser armazenado em um computador para análise, alinhamento e ruído elétrico são testados registrando a distribuição de sinais fluorescentes com e sem luz laser em baixo e alto ganho dos fotomultiplicadores, bem como com e sem indicador pontilhado, a varredura de acesso aleatório depende da detecção de aumentos intracelulares de cálcio. O primeiro passo no protocolo é corar um grande número de neurônios com a forma Esther de um indicador de cálcio por injeção em bolus.

Em seguida, registre a atividade do soma em cada neurônio em quatro locais por 6,4 microssegundos em cada local. Para selecionar os neurônios de interesse, adquira um quadro completo composto por 256 por 256 pixels. Em seguida, selecione manualmente os centros dos neurônios a serem gravados nesta imagem.

Três pontos a uma distância de dois mícrons em torno de cada centro são adicionados automaticamente pelo software de controle em cada ciclo. O sinal fluorescente é registrado a partir dos quatro locais em todos os 40 neurônios. A gravação de todos os neurônios em um ciclo requer 1.536 milissegundos.

Repita esta gravação sequencial de todos os 40 neurônios por cinco segundos. A detecção de picos de sinais de cálcio somático fluorescente depende de uma alta relação sinal-ruído. Uma alta relação sinal-ruído pode ser alcançada aumentando a intensidade de excitação.

No entanto, a intensidade da excitação só pode ser aumentada até um certo limite devido ao dano da foto. Existe apenas uma janela muito pequena de intensidade de excitação em que o dano fotográfico é baixo e a relação sinal-ruído é suficiente para detectar picos únicos, a fim de garantir que os sinais registrados estejam dentro da janela de detecção de pico alto. Durante um experimento, vários softwares de análise online desenvolvidos por nosso laboratório são usados.

Em seguida, calcule a taxa aproximada de fótons por neurônio a partir de uma janela de tempo curta de ruído de linha de base de cerca de 100 a 200 milissegundos. O número de fótons e a taxa de fótons são calculados a partir dos valores de fluorescência, ajustando a distribuição das mudanças relativas de fluorescência com esta equação, depois calculam a fluorescência da linha de base da mesma janela de tempo e plotam-na em função do tempo ou das tentativas. Mantenha o declínio médio da linha de base abaixo de 0,0002 por segundo, ajustando a potência do laser.

Porque a detecção de pico diminui rapidamente ao exceder esse limite. Depois disso, verifique as posições somáticas dos neurônios a cada 10 a 20 minutos, adquirindo uma imagem full frame. Ajuste os locais de gravação, se necessário.

Os sinais fluorescentes resultantes da atividade neural muitas vezes comeram com o tempo devido ao longo decaimento do transiente de cálcio. Neste procedimento, um método de deconvolução é usado para picos e tempos de pico dos sinais fluorescentes. Aqui, usamos um algoritmo genético para determinar o modelo de trem de pico mais provável que se ajusta ao sinal fluorescente registrado.

A cada iteração do algoritmo, a máxima verossimilhança se aproxima assintoticamente de sua máxima que é dada pelo ruído das gravações de fluorescência. Nas populações homogêneas de neurônios, o sinal de cálcio evocado por pico pode variar entre os neurônios. Para análise não supervisionada de grandes conjuntos de dados, projetamos um algoritmo que leva em consideração a variação do sinal de cálcio evocado por pico de neurônio para neurônio para evitar um grande número de detecções de falsos positivos.

A distribuição conjunta da constante de amplitude e tempo de decaimento do transiente de cálcio evocado por pico único é registrada em um conjunto separado de experimentos do mesmo tipo de neurônios sob as mesmas condições experimentais. Para levar em conta as mudanças lentas da linha de base e reduzir os custos computacionais de decon, gravações mais longas são divididas em vários traços mais curtos de um a cinco segundos para cada neurônio em cada gravação, o algoritmo de deconvolução pode testar um grande número de modelos de até 1 milhão de modelos diferentes ou mais para acelerar a deconvolução, um experimento é complicado em até 10 computadores diferentes. Em paralelo.

Após a deconvolução, os dados de pico são analisados e inspecionados. A probabilidade de pico do histograma do tempo peri estímulo e a taxa de disparo do neurônio são calculadas de maneira automatizada. Aqui estão os exemplos de um sinal fluorescente gravado a uma taxa de excitação muito baixa e outro a uma taxa de excitação muito alta dentro da janela de detecção.

Observe que cada exemplo mostra a resposta a um pico. Aqui é mostrada uma micrografia fotográfica de uma fatia cerebral aguda e duas pipetas de estimulação colocadas na mesma coluna cortical. Na camada quatro, eles mostram respostas neurais para os estímulos repetitivos, e este gráfico mostra as informações mútuas de Shannon sinalizadas pela população registrada de neurônios.

Aqui está a medição da propagação da atividade de pico de super limiar entre diferentes populações de neurônios corticais. Estes são os picos detectados nos neurônios corticais, resposta à estimulação elétrica das fibras corticais thal. Ao registrar a atividade neuronal usando varredura de acesso aleatório, é muito importante gravar dentro da janela de detecção.

Caso contrário, é muito fácil acabar com conjuntos de dados inutilizáveis. A detecção óptica de picos ainda está em sua infância. Há muito espaço para melhorias.

Com algumas melhorias, gravamos ainda mais neurônios. Com outras melhorias, poderemos até gravar em animais acordados e se comportando.