Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens da atividade neuronal do camundongo por meio de ressonância magnética com realce por manganês. Isso é feito mediante estimulação unilateral da vibração e mapeamento da resposta neuronal no córtex do campo de barris contralateral. O primeiro passo é montar e calibrar o sistema de ultrassom, composto por um transdutor de ultrassom não focalizado acionado pelo gerador de sinal e amplificador para o experimento.

Após uma injeção intraperitoneal de manganês, a barreira hematoencefálica é aberta com ultrassom e microbolhas, permitindo que o manganês entre na substância parenquimatosa do cérebro. Em seguida, o camundongo é submetido a um paradigma de estimulação neuronal, o que resulta em maior acúmulo de manganês nas regiões cerebrais mais ativas. Por fim, são obtidas imagens de RNM que mostram diferenças regionais na intensidade do sinal ponderado em T1 com base nos diferentes níveis de acúmulo de manganês no cérebro.

Na neurociência, o camundongo é o sistema modelo predominante para o estudo das bases genéticas e moleculares do desenvolvimento e das doenças cerebrais. Esta técnica fornece uma ferramenta não invasiva para mapear a atividade neural nesses modelos de camundongos. A disruptura ultrassônica da barreira hematoencefálica pode não apenas ser utilizada para entregar manganês ao parênquima cerebral com finalidades de neuroimagem funcional, mas também pode ser empregada para entregar uma grande variedade de outros compostos ao parênquima cerebral, incluindo agentes de contraste à base de gadolínio ou quimioterápicos.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldade em calibrar o sistema de ultrassom e manipular os microeletrodos. A demonstração do procedimento será realizada por cada um dos técnicos em nosso laboratório. O sistema de ultrassom consiste em um transdutor de ultrassom de elemento único com diâmetro amplo o suficiente para cobrir o cérebro do camundongo e uma frequência central na faixa de dois megahertz.

O transdutor é acionado por um gerador de sinais e um amplificador de potência de 50 decibéis, que produziu a sequência de pulsos ultrassônicos. Calibre o sistema ultrassônico em um tanque de água. Coloque o hidrofone no fundo do tanque e posicione o transdutor acima dele com uma plataforma de transladador de três eixos.

Em seguida, aplique uma série curta de pulsos sinusoidais ao transdutor e ajuste o estágio para encontrar a resposta de pico, que deve estar no centro do feixe de ultrassom e no foco natural do transdutor. Em seguida, realize várias medições de pressão acústica em uma faixa de tensões de entrada e utilize uma regressão linear para estimar a relação entre a tensão de entrada e a pressão acústica. Determine a amplitude do pulso para gerar uma pressão acústica negativa de pico de aproximadamente 0,36 megapascal.

Neste passo, anestesie o animal administrando o isoflurano através do cone nasal. O aparelho com cone nasal deve fixar a cabeça do animal com precisão e de forma confiável na mesma posição a cada vez; nosso dispositivo mantém a cabeça no crânio na posição plana durante o experimento, utilizando um travesseiro pneumático para monitorar a frequência respiratória e titular o anestésico para manter uma frequência respiratória entre 85 e 125 movimentos por minuto. Ao mesmo tempo, monitore a temperatura do animal com uma sonda retal e mantenha sua temperatura corporal utilizando uma lâmpada de calor ou ar aquecido.

Em seguida, insira um cateter na veia caudal e um cateter intraperitoneal no animal. O próximo passo é aparar os pelos para demonstrar a estimulação unilateral do nervo VII e mapear a resposta neuronal no córtex do campo de barris contralateral. Corte o nervo VII contralateral o mais próximo possível da superfície da pele, sem irritar o folículo ou a pele circundante.

Em seguida, transfira o animal para o sistema de ultrassom e aplique o gel de ultrassom no couro cabeludo, sobre a folha fina de plástico inferior que contém uma coluna de água na cabeça. Atravesse a coluna de água com um cotonete para remover quaisquer bolhas de ar aprisionadas no gel de ultrassom. Em seguida, posicione o transdutor de ultrassom na água, na sua distância focal natural, diretamente acima do cérebro do camundongo, e passe o dedo sobre o transdutor para remover quaisquer bolhas de ar aprisionadas.

Em seguida, produza as microesferas lipídicas de Perrin agitando o frasco no agitador durante 45 segundos enquanto estiver em uso. Deixe o frasco em temperatura ambiente, mas guarde-o na geladeira após o último uso do dia anterior ao primeiro uso. Nos dias subsequentes, agite novamente o frasco armazenado no agitador.

Em seguida, injete 0,5 milimol por quilograma de cloreto de manganês por via intraperitoneal e aguarde 10 minutos para permitir sua distribuição. Em seguida, agite o frasco de microbolhas manualmente por um minuto para ressuspender os microesferas. Posteriormente, retire 30 microlitros mais o volume morto do cateter.

Tenha cuidado para não injetar ar no frasco, pois isso degradará as microbolhas restantes. Inicie imediatamente a sequência de pulsos de ultrassom e injete as microesferas através do cateter na veia caudal com o mínimo de atraso. Continue a sonicação por três minutos.

Em seguida, desligue o sistema de ultrassom. Após o nível de manganês no cérebro se estabilizar por cerca de 40 minutos, desligue a isoflurana e remova o cone nasal. Neste momento, inicie o paradigma de estimulação neuronal para mapear o córtex do campo de barris.

Mova um pincel em movimento circular a aproximadamente um a cinco hertz através da matriz vibrotátil contralateral por 90 minutos. Retome a anestesia após a estimulação, em seguida continue a manter a temperatura corporal e titule o nível de isoflurano para uma frequência respiratória de 85 a 125 respirações por minuto. Em seguida, coloque o camundongo em uma bobina de ressonância magnética e transfira-o para o sistema de ressonância magnética.

Em seguida, adquira as imagens ponderadas em T1 de alta resolução com três DT conforme mostrado aqui. A ruptura da barreira hematoencefálica após a administração de um agente de contraste com encurtamento em T1, como manganês ou um agente à base de gadolínio, resulta em um aumento do sinal no parênquima cerebral em imagens ponderadas em T1 quando comparadas aos cérebros nos quais a BOMA não foi realizada. Aqui estão os mapas de atividade neuronal gerados pela estimulação unilateral do risi em sete animais na primeira coluna.

Mapas de diferença em duas localizações distintas mostram aumento no sinal de RNM contralateral ao estímulo provocado pelo bigode. Na segunda coluna, os mapas de valor-p indicam a significância relativa dessas diferenças. Na terceira coluna, os diagramas correspondentes do atlas cerebral mostram que essas regiões ativas correspondem ao campo dos bigodes do córtex sensorial primário.

Com prática, esta técnica pode ser realizada em cerca de duas horas, mais a duração da simulação. Ao realizar o procedimento, é importante lembrar-se de agitar o frasco de microbolhas antes da injeção e ter cuidado para não injetar ar no frasco. Além disso, é fundamental garantir que não haja bolhas de ar presas no gel de ultrassom ou sob o transdutor de ultrassom.

Para esta demonstração, optamos por estimular os vibrissas, mas é evidente que esta técnica pode ser adaptada para estudar qualquer estímulo de interesse. Após o procedimento, o animal pode se recuperar completamente, permitindo estudos longitudinais.