Name: Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprenda a realizar neuroimagem funcional em camundongos usando ultrassom com microbolhas para romper a barreira hemato-encefálica e manganês como agente de contraste em RM.

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Todo o trabalho foi realizado no Centro de Duque de Microscopia Na Vivo, uma NIH / NIBIB nacional Biomédica Technology Resource Center (P41 EB015897) e NCI Pequenos Animais do Programa de Recursos Imaging (U24 CA092656). Apoio adicional foi fornecido a partir de NSF Graduate Research Fellowship (2003014921).

1. Montar e calibrar sistema de ultra- <ol><li> O sistema de ultra-som começa com um transdutor de ultra-som de um único elemento com um diâmetro de largura suficiente para cobrir o cérebro do rato e uma frequência central na gama de 2 MHz. O transdutor é accionado por um amplificador de potência 50-dB, que está ligado a um gerador de sinal que produz a sequência de impulsos de ultra-som. </li><li> Para calibrar a pressão acústica do sistema de ultra-som, usar um hidrofone para relacionar a tensão aplicada à pressão acústica resultante. Coloque o transdutor num tanque de água sobre o hidrofone. Aplicar um pulso simples (por exemplo, uma sinusóide 10-ciclo à frequência do transdutor com o pulso de frequência de repetição de 10 Hz), para o transdutor. Usar uma etapa de tradução 3-eixo para encontrar o pico de resposta, que deve ser colocado no centro do feixe de ultra-som no foco natural do transdutor (aproximadamente 60 mm para o nosso milímetros de diâmetro do transdutor 13 MHz 2,15). </li><li> Faça várias medições ao longo de um tocoue de tensões de entrada (por exemplo, 50-400 mV pp) para verificar a linearidade do sistema. Usar uma regressão linear simples para estimar a relação entre a tensão de entrada e de pressão acústica. No nosso sistema, tensões de entrada de 258 e 167 mV pp correspondeu a-pico negativas pressões acústicas de 0,52 e 0,36 MPa. </li><li> Programar o gerador de sinais para produzir uma sequência de impulsos de ultra-som que consiste em rajadas de pulsos sinusoidais na frequência transdutor com 50000 ciclos por rebentamento e um período de explosão de 64 ms. Com base nas medições de calibração, definir a amplitude de impulsos para gerar pressões de pico-negativas acústicas de 0,36 MPa no centro do foco natural do transdutor. </li></ol> 2. Preparar os Reagentes <ol><li> Dissolve-se cloreto de manganês tetra-hidratado (MnCl 2 · 4H 2 O) em água estéril a uma concentração de 100 mM (300 mOsm) e filtro esterilizar. </li><li> Produzir a lipídico perflutreno microesferas por &quot;activating «o frasco na agitador fornecido pelo fabricante durante 45 s. Para um dia de experiências, um único frasco pode ser activada uma vez no início do dia e utilizado sem reactivação para o resto do dia. </li><li> Imediatamente antes da administração de microesferas, agitar o frasco com a mão durante 1 min para ressuspender as microsferas. Ao retirar as microbolhas do frasco, não injectar ar ambiente para dentro do frasco, como este degrada as microbolhas restantes. Deixe o frasco até que o último uso do dia, e depois armazená-lo em uma geladeira. Mantido dessa forma, um único frasco pode durar vários dias. Re-activar o frasco armazenado no agitador, antes da primeira utilização em dias subsequentes. </li></ol> 3. Preparação dos animais <ol><li> Anestesiar os animais com isoflurano, entregue pelo cone do nariz. O aparelho de cone de nariz devem ser concebidos para fixar a cabeça do animal com precisão e fiabilidade na mesma posição de cada vez. Nosso dispositivo 15 mantém a cabeça em diae &quot;crânio-plana&quot; posição (isto é, a superfície do crânio dorsal é horizontal) utilizado no cérebro Paxinos atlas 16. Titular o anestésico para manter uma freqüência respiratória entre 85 e 125 respirações por minuto. Manter a temperatura do corpo utilizando uma lâmpada de aquecimento ou ar soprado. Proteger os olhos com lubrificante. </li><li> Remova o cabelo do couro cabeludo do mouse usando um aparador elétrico. </li><li> Coloque um catéter na veia da cauda e um cateter intraperitoneal (IP). Para estudos de sobrevida, não se esqueça de usar a técnica estéril apropriado; cateter IP demonstrado no vídeo para este artigo é apropriado apenas para não-sobrevivência experimentos. </li><li> Faça as preparações adicionais necessários para o experimento de estimulação neuronal. Para o mapeamento de estimulação vibrissas do córtex campo barril, usar um microscópio de dissecação e tesoura microcirúrgicos para cortar o vibrissas tão perto quanto possível da superfície da pele sem folículo do irritante ou pele circundante. </li><li> Coloque o gel de ultra-som nacouro cabeludo e, em seguida inferior da coluna de água contida por uma folha de plástico fino (por exemplo, um 7,6 uM forro lixeira) para a cabeça. Alcançar através de coluna de água com um cotonete de ponta para empurrar as bolhas de ar que ficam presas no gel de ultra-som. Posicione o transdutor de ultra-som na sua distância focal natural (58 mm) diretamente sobre o cérebro do rato na coluna de água, e limpe o transdutor com uma ponta do dedo para eliminar as bolhas de ar retidas. </li></ol> 4. Hematoencefálica Barreira Abertura com Microbolhas e ultra-som (BOMUS) <ol><li> Dar uma injecção intraperitoneal da solução de manganês a uma dose de 0,5 IP mmol / kg. Tapar o cateter intraperitoneal de modo que o manganês não flui para fora, e esperar 10 minutos para permitir que a distribuir (Figura 1). </li><li> Para abrir o BBB, administrar 30 uL de lípido perflutreno microesferas (DEFINITY activado) através do cateter da veia da cauda, ​​e simultaneamente, inicia a sequência de impulsos de ultra-som. Continuar insonification durante 3 minutos. </li></ol> 5. Estimulação Neuronal <ol><li> Permitir que cerca de 40 minutos para os níveis cerebrais de Mn 2 + para estabilizar antes de iniciar a estimulação neuronal. Desta forma, o acessório de linha de base dramática devido à Mn 2 + difusão através da BHE pode ser distinguido do reforço diferencial subtil devido à estimulação. Em seguida, começam a estimulação com o seu paradigma de escolha (Figura 1). </li><li> Para a estimulação das vibrissas, desligue o isoflurano e remover o cone do nariz. Mover pincel um artista mole manualmente com um movimento circular (1-5 Hz) através da matriz vibrissas a uma distância de aproximadamente 2-5 mm a partir da pele. Continuar a estimulação durante 90 min. O manganês tem um efeito sedativo que permite a estimulação descontrolada do animal. Se o animal torna-se agitado, administrar 5% de isoflurano através cone de nariz durante aproximadamente 15 segundos. </li></ol> 6. Magnetic Ressonância <ol><li> Após a estimulação, retomar a anestesia através de cone do nariz. Continuar a manutenção da temperatura do corpo e titulando o nível isoflurano a uma taxa respiratória de 85-125 respirações por minuto. </li><li> Posicione o mouse em uma bobina de ressonância magnética e transferir para o aparelho de ressonância. Adquira 3D de alta resolução T 1 ponderados imagens de RM. Por exemplo, usar um gradiente 3D estragado recordar eco sequência (SPGR) com os seguintes parâmetros: tempo de repetição de 25 ms; tempo de eco de 2 ms; flip ângulo de 30 graus; largura de banda de 15,63 kHz; campo de visão de 20 × 20 × 12 mm; matriz de 128 × 128 × 60. </li></ol> 7. Análise de Imagem <ol><li> A análise de imagem é específico para o paradigma de estimulação utilizada. Para a experiência de estimulação vibrissas (Figura 2), importar as imagens a partir de vários animais em um ambiente de análise apropriado. Se alguns animais foram estimuladas, à direita, enquanto os outros foram estimulados no lado esquerdo, flip algum modo que todas as imagens são efetivamente &quot;deixou-estimulado.&quot; Em seguida, para comparar o lado estimulado de cada cérebro para o seu lado contralateral não estimulada, criar um duplicado e espelhado deixou-não estimulada conjunto de imagem é criada. Registre todas as imagens para um espaço comum e, em seguida, alisá-los com um × 3 × 3 3 pixels kernel Gaussiano. </li><li> Exportar os dados para um ambiente de análise matemática, tais como MATLAB. Opcionalmente, mascarar anatomia irrelevante para os conjuntos de dados. Intensidade de normalizar as imagens pelo método iterativo de Venot et al. 17,18. </li><li> Usar uma emparelhadas, teste t de cauda única para comparar cada voxel dos lados estimulados de cada cérebro para o voxel correspondente contralateral nos lados não estimuladas de cada cérebro. </li><li> Exibir o mapa valor de p resultante para identificar regiões de actividade diferencial (Figura 3). </li></ol> 8. Os resultados representativos O método aqui apresentado tem dois fundos<html> amental etapas: (1) Abertura BBB com Microbolhas e ultra-som (BOMUS) e (2) induzida por ativação Manganês-RM (AIM MRI). Porque o último passo depende do anterior, é importante verificar BOMUS implementação bem sucedida. Perturbações da barreira sangue-cérebro após a administração de um T 1-encurtamento agente de contraste (tais como manganês ou um agente de gadolínio-based) resulta num aumento do sinal no parênquima cerebral em T 1-ponderada de imagem quando em comparação com cérebros em que BOMUS não foi executada (Figura 4). A distribuição de este acessório de manganês não é completamente uniforme, embora seja razoavelmente consistente entre animais. A distribuição não reflecte inomogeneidade apenas na abertura BBB, mas também é a distribuição não-uniforme intrínseca de Mn no interior do cérebro 19. A dinâmica espacial e temporal da abertura BBB ter sido ainda descrito anteriormente 12. ent &quot;&gt; Uma vez BOMUS foi implementado com sucesso, o próximo passo é a realização de ressonância magnética AIM Muitos paradigmas experimentais é possível,.. no entanto, porque há muitos potenciais confunde, os controles e análises devem ser cuidadosamente concebidos efeitos de confusão incluem abertura BBB heterogênea, acumulação não homogénea de Mn no cérebro, dinâmica temporal de difusão Mn, e actividade neuronal inespecífica. Nesta demonstração, a resposta à estimulação neuronal unilateral do vibrissas foi mapeado. Para compensar as não homogeneidades e fluxo de Mn, o lado não estimulado de cada cérebro foi utilizado como um controlo interno. Para ter em conta para a actividade neuronal inespecífica que pode variar entre os animais, a análise estatística de teste utilizado para identificar regiões que foram consistentemente diferente entre os animais (Figura 2). Os resultados foram um mapa diferença tridimensional e um tridimensional valor de p-mapa (Figura 3), do lado direito do que indicou regiõesde maior sinal contralateral à vibrissas estimulada. O lado esquerdo do mapa indicam quais as regiões tinha sinal significativamente mais elevado ipsilateral à vibrissas estimulada. O mapa de valor de p identificou uma região larga de sinal elevada contralateral à vibrissas estimulado que correspondia ao campo barril do córtex sensorial primário, cuja resposta a estimulação vibrissas tem sido extensivamente documentado por electrofisiologia 20,21 e 2-desoxiglucose estudos. Uma discussão mais completa destes resultados foi publicada previamente 13. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig1.jpg" /> Figura 1. Protocolo cronograma de neuroimagem funcional com BOMUS e RM AIM (Adaptado de Howles et al. 13). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig2.jpg" /> Figura esquema da Análise 2. Para a identificação de regiões of intensidade diferente entre os lados estimuladas e não estimuladas de cada cérebro. Para comparar o lado estimulado de cada cérebro para o seu lado contralateral não estimulada, um duplicado e espelhado deixou-não estimulada conjunto de imagem é criada. Estas imagens são registadas, filtrada, e normalizada. Finalmente, no teste compara as imagens esquerda e deixou-estimuladas-não estimulada. O teste t é &quot;emparelhado&quot; de modo que o lado estimulado de cada cérebro é apenas comparado com o lado não estimulado do mesmo cérebro. O teste t é &quot;de cauda única&quot; de modo que um lado do mapa valor de p indica que o sinal significativamente mais elevado do lado estimulado do cérebro, enquanto o outro lado do mapa valor de p indica que o sinal significativamente mais elevado do lado não estimulado do cérebro (Adaptado de Howles et al. 13). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig3.jpg" /> Figura 3. Os resultados da análise combinada de 7 animais menos dois diferentes posições axiais. T<html> ele primeira coluna mostra a média de todas as imagens registradas alinhados, de modo que efetivamente todos os ratos tiveram sua vibrissas esquerdo estimulado. Estas imagens são sobrepostas com um mapa de cor, indicando o aumento percentual média na sinal em cada voxel relativa ao hemisfério contralateral, como indicado pela barra de cores. Regiões coloridas sobre o lado direito da imagem mostram onde o hemisfério contralateral à estimulação tiveram maior do sinal. Regiões colorido no lado esquerdo da imagem mostram onde o hemisfério ipsilateral à estimulação tiveram maior do sinal. A segunda coluna mostra as mesmas imagens sobrepostas com o mapa de valor de p indicando a significância estatística do aumento do sinal. A terceira coluna apresenta o mapa valor de p mesmo sobreposto sobre as figuras correspondentes a partir da estereotáxico Paxinos atlas 16 com os campos de barril do córtex sensorial sombreada (adaptado de Howles et al. 13). / 4055/4055fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Distribuição espacial de Mn 2 + no cérebro. As imagens foram adquiridas 170 min após a 0,5 mmol / kg IP de MnCl2 a partir de BOMUS-tratados (n = 5) e de controlo (n = 4) ratinhos. Após a normalização, média e mapas de desvio-padrão foram calculados (painel à esquerda). Enhancement foi maior nos ratos tratados com BOMUS. Embora este acessório não era uniforme em toda a cérebro, era razoavelmente consistente, excepto perto das bordas do cérebro e os ventrículos. Usando regiões de interesse (ROIs) desenhadas em torno de várias estruturas, o SNR média (+ 1 DP) foi calculado em cada grupo (painel direito). BOMUS animais tratados apresentaram maior SNR, mas também uma maior variância entre as estruturas e entre animais (Adaptado de Howles et al. 13). <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig5.jpg" /> Figura 5. Para examinar os efeitos de tecido de BOMUS, os cérebros de ratinhos tratados com BOMUS foram fixadas, SEctioned a 500 - intervalos mM, e corados com hematoxilina e eosina. O número médio de extravasamento de glóbulos vermelhos vistas em cada secção do cérebro é mostrado para pressões acústicas de 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4), e 5,0 MPa (n = 1). As barras de erro mostram o erro padrão. O segundo painel mostra um exemplo de extravasamento de células vermelhas do sangue grave a partir do cérebro exposto a 5,0 MPa (adaptado de Howles et al. 12). <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig6.jpg" /> Figura 6. Teste comportamental quantitativa foi utilizado para avaliar a actividade, excitação, e capacidade de resposta antes da anestesia, e 3 e 24 horas após a recuperação da anestesia. O sistema de pontuação, descrito anteriormente 12, foi baseada na bem estabelecida avaliação quantitativa do mouse comportamental desenvolvered por Irwin em 1968 22. O comportamento da média (± SEM) pontuação para o controlo (n = 3) e BOMUS (0,36 MPa) tratados (n = 8) Os animais é mostrado. Relativa à linha de base pré-anestesia, todos os animais mostram uma diminuição na pontuação comportamento de 3 horas após a anestesia, mas eles largamente recuperar até ao dia seguinte. Em cada ponto do tempo, não foi observada diferença entre os dois grupos, indicando que BOMUS não mensurável afetam o comportamento animal (Adaptado de Howles et al. 12).

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<li>Meiri, U., Rahamimoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+transmission+-+inhibition+by+manganese+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular transmission - inhibition by manganese ions.</a> Science. 176, 308(1972).</li>
<li>Aschner, M., Guilarte, T. R., Schneider, J. S., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese%3A+Recent+advances+in+understanding+its+transport+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Manganese: Recent advances in understanding its transport and neurotoxicity.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 221, 131-147 (2007).</li>
<li>Watanabe, T., Frahm, J., Michaelis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-enhanced+MRI+of+the+mouse+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Magnet.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Manganese-enhanced MRI of the mouse auditory pathway.</a> Magnet. Reson. Med. 60, 210-212 (2008).</li>
<li>Yu, X., Wadghiri, Y. Z., Sanes, D. H., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+auditory+brain+mapping+in+mice+with+Mn-enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI.</a> Nat. Neurosci. 8, 961-968 (2005).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+mapping+of+sound-evoked+activity+in+the+mouse+auditory+midbrain+using+Mn-enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Statistical mapping of sound-evoked activity in the mouse auditory midbrain using Mn-enhanced MRI.</a> Neuroimage. 39, 223-230 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui, um método foi apresentado de forma não invasiva para a abertura do BBB por todo o cérebro de camundongo inteiro com ultra-som e microbolhas (BOMUS). Com a abertura BBB, Mn 2 + foi administrada e induzida por activação de manganês-RM (AIM MRI) foi usado para resposta de imagem neuronal a curta duração estimulação em ratinhos sedados. Abertura BBB adequada foi obtida com uma pressão de pico negativo acústico de 0,36 MPa. Observação, esta é a pressão na superfície do couro cabe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Hidrofone </td><td> Sonora Medical Systems, Longmont, CA </td><td> SN S4-251 </td><td></td></tr><tr><td> Estágio de tradução </td><td> Newport Corporation, Irvine, CA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Transdutor de ultra-som </td><td> Olympus NDT, Inc., Waltham MA </td><td> A306S-SU </td><td> Analise folha do fabricante de teste que acompanha o transdutor para encontrar a frequência central exacta do que transdutor particular, que pode ser diferente da frequência nominal listado no catálogo. (Por exemplo, a frequência nominal de nosso transdutor foi de 2,25 MHz, mas a frequência central real foi de 2,15 MHz.) </td></tr><tr><td> Vevo Imagem da Estação </td><td> VisualSonics, Inc. Toronto, Canadá </td><td>; </td><td></td></tr><tr><td> 50 dB amplificador de potência </td><td> E &amp; I, Rochester, NY </td><td> modelo 240L </td><td></td></tr><tr><td> Gerador de sinal </td><td> Agilent Technologies, Santa Clara, CA </td><td> modelo 33220A </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 - (H2O) 4 </td><td> Sigma </td><td></td><td> Peso molecular varia de acordo com lote, contato com o fabricante para a medição exata </td></tr><tr><td> Lipídico perflutreno microesferas </td><td> Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA </td><td> DEFINITY </td><td></td></tr><tr><td> Agitador microesfera </td><td> Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA </td><td> Vialmix </td><td></td></tr><tr><td> MR bobina de imagem </td><td> m2m Imaging Corp, Hillcrest, OH </td><td></td><td> 35 mm de diâmetro em quadratura de transmissão / recepção bobina de volume </td></tr><tr><td> Sistema de ressonância magnética </td><td> GE Healthcare, Milwaukee, WI </td><td></td><td> GE consola EXCITE operar um 7-T ímã furo horizontal </td></tr><tr><td> Ambiente de análise de imagem </td><td> Imagem Visage, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA </td><td> Amira MATLAB </td><td></td></tr></tbody></table>

neuroimagem funcional usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e manganês-rm

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Apesar de os ratos são o sistema modelo dominante para estudar as bases genéticas e moleculares da neurociência, neuroimagem funcional em ratos permanece tecnicamente desafiador. Uma abordagem, induzida por activação de manganês-RM (AIM MRI), tem sido utilizado com sucesso para mapear a actividade neuronal em roedores 1-5. Em AIM RM, Mn 2 + actua um análogo de cálcio e se acumula nos neurónios despolarizadas 6,7. Porque Mn 2 + reduz a propriedade tecido T 1, as regiões de atividade neuronal elevada irá aumentar em ressonância magnética. Além disso, Mn 2 + limpa lentamente a partir das regiões activados e, portanto, a estimulação pode ser realizada fora do magneto antes da imagem, permitindo uma maior flexibilidade experimental. No entanto, porque Mn 2 + não atravessam facilmente a barreira sangue-cérebro (BBB), a necessidade de abrir o BBB tem limitado o uso de AIM RM, especialmente em ratinhos. Uma ferramenta para a abertura do BBB é ultrasound. Embora potencialmente prejudiciais, se ultra-som é administrado em combinação com microbolhas cheias de gás (ie, os agentes de contraste de ultra-som), a pressão acústica necessária para a abertura BBB é consideravelmente menor. Esta combinação de ultra-som e microbolhas pode ser usado para fiavelmente abrir o BBB sem causar danos aos tecidos 8-11. Aqui, um método é apresentado para a realização de AIM MRI usando microbolhas e ultra-som para abrir o BBB. Depois de uma injecção intravenosa de microbolhas perflutreno, um feixe de ultra-som desfocado pulsado é aplicada à cabeça de rato raspada durante 3 minutos. Por simplicidade, nos referimos a esta técnica de Abertura BBB com Microbolhas e ultra-som como BOMUS 12. Usando BOMUS para abrir o BBB longo de ambos os hemisférios cerebrais, manganês é administrado ao cérebro de rato inteiro. Após a estimulação experimental dos ratos levemente sedados, AIM MRI é usado para mapear a resposta neuronal. Parademonstrar essa abordagem, aqui BOMUS e AIM ressonância magnética são utilizados para mapear a estimulação mecânica unilateral das vibrissas em camundongos levemente sedados 13. Devido BOMUS pode abrir o BBB longo de ambos os hemisférios, o lado não estimulado do cérebro é usado para controlar para a estimulação de fundo não específico. O mapa de ativação resultante 3D concorda bem com representações publicados das regiões vibrissas do campo barril córtex 14. A abertura ultra-sônica do BBB é rápido, não invasivo e reversível; e, portanto, esta abordagem é adequada para estudos de alto rendimento e / ou longitudinal em ratos acordados.

Uma técnica é descrita para amplamente abertura da barreira sangue-cérebro no ratinho usando microbolhas e ultra-som. Usando esta técnica, o manganês pode ser administrada para o cérebro do rato. Porque o manganês é um agente de contraste para IRM que se acumula nos neurónios despolarizadas, esta abordagem permite imagiologia de actividade neuronal.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Embora os camundongos sejam o sistema de modelo dominante para o estudo dos fundamentos genéticos e moleculares da neurociência, a neuroimagem funcional em camundongos permanece...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens da atividade neuronal do camundongo por meio de ressonância magnética com realce por manganês. Isso é feito mediante estimulação unilateral da vibração e mapeamento da resposta neuronal no córtex do campo de barris contralateral. O primeiro passo é montar e calibrar o sistema de ultrassom, composto por um transdutor de ultrassom não focalizado acionado pelo gerador de sinal e amplificador para o experimento.Após uma injeção intraperitoneal de manganês, a barreira hematoencefálica é aberta com ultrassom e microbolhas, permitindo que o manganês entre na substância parenquimatosa do cérebro. Em seguida, o camundongo é submetido a um paradigma de estimulação neuronal, o que resulta em maior acúmulo de manganês nas regiões cerebrais mais ativas. Por fim, são obtidas imagens de RNM que mostram diferenças regionais na intensidade do sinal ponderado em T1 com base nos diferentes níveis de acúmulo de manganês no cérebro.Na neurociência, o camundongo é o sistema modelo predominante para o estudo das bases genéticas e moleculares do desenvolvimento e das doenças cerebrais. Esta técnica fornece uma ferramenta não invasiva para mapear a atividade neural nesses modelos de camundongos. A disruptura ultrassônica da barreira hematoencefálica pode não apenas ser utilizada para entregar manganês ao parênquima cerebral com finalidades de neuroimagem funcional, mas também pode ser empregada para entregar uma grande variedade de outros compostos ao parênquima cerebral, incluindo agentes de contraste à base de gadolínio ou quimioterápicos.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldade em calibrar o sistema de ultrassom e manipular os microeletrodos. A demonstração do procedimento será realizada por cada um dos técnicos em nosso laboratório. O sistema de ultrassom consiste em um transdutor de ultrassom de elemento único com diâmetro amplo o suficiente para cobrir o cérebro do camundongo e uma frequência central na faixa de dois megahertz.O transdutor é acionado por um gerador de sinais e um amplificador de potência de 50 decibéis, que produziu a sequência de pulsos ultrassônicos. Calibre o sistema ultrassônico em um tanque de água. Coloque o hidrofone no fundo do tanque e posicione o transdutor acima dele com uma plataforma de transladador de três eixos.Em seguida, aplique uma série curta de pulsos sinusoidais ao transdutor e ajuste o estágio para encontrar a resposta de pico, que deve estar no centro do feixe de ultrassom e no foco natural do transdutor. Em seguida, realize várias medições de pressão acústica em uma faixa de tensões de entrada e utilize uma regressão linear para estimar a relação entre a tensão de entrada e a pressão acústica. Determine a amplitude do pulso para gerar uma pressão acústica negativa de pico de aproximadamente 0,36 megapascal.Neste passo, anestesie o animal administrando o isoflurano através do cone nasal. O aparelho com cone nasal deve fixar a cabeça do animal com precisão e de forma confiável na mesma posição a cada vez; nosso dispositivo mantém a cabeça no crânio na posição plana durante o experimento, utilizando um travesseiro pneumático para monitorar a frequência respiratória e titular o anestésico para manter uma frequência respiratória entre 85 e 125 movimentos por minuto. Ao mesmo tempo, monitore a temperatura do animal com uma sonda retal e mantenha sua temperatura corporal utilizando uma lâmpada de calor ou ar aquecido.Em seguida, insira um cateter na veia caudal e um cateter intraperitoneal no animal. O próximo passo é aparar os pelos para demonstrar a estimulação unilateral do nervo VII e mapear a resposta neuronal no córtex do campo de barris contralateral. Corte o nervo VII contralateral o mais próximo possível da superfície da pele, sem irritar o folículo ou a pele circundante.Em seguida, transfira o animal para o sistema de ultrassom e aplique o gel de ultrassom no couro cabeludo, sobre a folha fina de plástico inferior que contém uma coluna de água na cabeça. Atravesse a coluna de água com um cotonete para remover quaisquer bolhas de ar aprisionadas no gel de ultrassom. Em seguida, posicione o transdutor de ultrassom na água, na sua distância focal natural, diretamente acima do cérebro do camundongo, e passe o dedo sobre o transdutor para remover quaisquer bolhas de ar aprisionadas.Em seguida, produza as microesferas lipídicas de Perrin agitando o frasco no agitador durante 45 segundos enquanto estiver em uso. Deixe o frasco em temperatura ambiente, mas guarde-o na geladeira após o último uso do dia anterior ao primeiro uso. Nos dias subsequentes, agite novamente o frasco armazenado no agitador.Em seguida, injete 0,5 milimol por quilograma de cloreto de manganês por via intraperitoneal e aguarde 10 minutos para permitir sua distribuição. Em seguida, agite o frasco de microbolhas manualmente por um minuto para ressuspender os microesferas. Posteriormente, retire 30 microlitros mais o volume morto do cateter.Tenha cuidado para não injetar ar no frasco, pois isso degradará as microbolhas restantes. Inicie imediatamente a sequência de pulsos de ultrassom e injete as microesferas através do cateter na veia caudal com o mínimo de atraso. Continue a sonicação por três minutos.Em seguida, desligue o sistema de ultrassom. Após o nível de manganês no cérebro se estabilizar por cerca de 40 minutos, desligue a isoflurana e remova o cone nasal. Neste momento, inicie o paradigma de estimulação neuronal para mapear o córtex do campo de barris.Mova um pincel em movimento circular a aproximadamente um a cinco hertz através da matriz vibrotátil contralateral por 90 minutos. Retome a anestesia após a estimulação, em seguida continue a manter a temperatura corporal e titule o nível de isoflurano para uma frequência respiratória de 85 a 125 respirações por minuto. Em seguida, coloque o camundongo em uma bobina de ressonância magnética e transfira-o para o sistema de ressonância magnética.Em seguida, adquira as imagens ponderadas em T1 de alta resolução com três DT conforme mostrado aqui. A ruptura da barreira hematoencefálica após a administração de um agente de contraste com encurtamento em T1, como manganês ou um agente à base de gadolínio, resulta em um aumento do sinal no parênquima cerebral em imagens ponderadas em T1 quando comparadas aos cérebros nos quais a BOMA não foi realizada. Aqui estão os mapas de atividade neuronal gerados pela estimulação unilateral do risi em sete animais na primeira coluna.Mapas de diferença em duas localizações distintas mostram aumento no sinal de RNM contralateral ao estímulo provocado pelo bigode. Na segunda coluna, os mapas de valor-p indicam a significância relativa dessas diferenças. Na terceira coluna, os diagramas correspondentes do atlas cerebral mostram que essas regiões ativas correspondem ao campo dos bigodes do córtex sensorial primário.Com prática, esta técnica pode ser realizada em cerca de duas horas, mais a duração da simulação. Ao realizar o procedimento, é importante lembrar-se de agitar o frasco de microbolhas antes da injeção e ter cuidado para não injetar ar no frasco. Além disso, é fundamental garantir que não haja bolhas de ar presas no gel de ultrassom ou sob o transdutor de ultrassom.Para esta demonstração, optamos por estimular os vibrissas, mas é evidente que esta técnica pode ser adaptada para estudar qualquer estímulo de interesse. Após o procedimento, o animal pode se recuperar completamente, permitindo estudos longitudinais.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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