Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

Nós descrevemos um protocolo em tempo real videoimaging da migração neuronal no cérebro anterior mouse. A migração de viralmente etiquetados ou enxertado precursores neuronais foi gravado em fatias agudas vivo usando largo campo de imagem fluorescente, com um intervalo de aquisição relativamente rápida para estudar as diferentes fases da migração de células, incluindo as durações das fases estacionária e de migração e da velocidade da migração.

O objetivo geral deste procedimento é estudar a migração de neuroblastos em fatias agudas do cérebro de camundongos adultos. Isso é feito rotulando primeiro os precursores neuronais na zona subventricular adulta cinco a oito dias após a marcação dos neuroblastos, prepare fatias agudas do camundongo para o cérebro. Em seguida, é realizada a imagem de lapso de tempo da migração de neuroblastos.

Em última análise, a microscopia em tempo real de campo amplo é usada para mostrar a dinâmica da migração de neuroblastos em cortes agudos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento neuronal, estudando o papel de diferentes pistas moleculares e mecanismos celulares envolvendo a migração celular. Agora, este método pode fornecer informações sobre os processos fisiológicos que regulam a migração neural em um adulto para o cérebro, mas também pode ser aplicado em outros sistemas, como o estudo da migração neural no cérebro isquêmico e durante o desenvolvimento embrionário.

Comece este procedimento preparando um líquido cefalorraquidiano artificial à base de sacarose para cortar as fatias e um LCR A à base de cloreto de sódio a 32 graus Celsius para manter as fatias até a imagem e, em seguida, oxigenar as soluções borbulhando-as continuamente com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono. Em seguida, anestesiar o camundongo com o neuroblasto marcado com fluorescência usando cetamina xilazina interally. Em seguida, prepare rapidamente a solução de corte a frio com uma aparência gelatinosa usando nitrogênio líquido.

Depois disso, pegue 15 a 20 mililitros de solução de corte a frio com uma seringa de 20 cc e perfunda o camundongo intra Cardi. Se os vasos sanguíneos precisarem ser marcados em vez de perfundir com a solução de corte, injete 200 microlitros de vermelho Texas dextrano a uma concentração de 10 miligramas por mililitro, trans Cardi no ventrículo esquerdo do coração e espere dois a três minutos antes de decapitar o camundongo após a perfusão transcárdica, decapitar o camundongo mergulhar rapidamente a cabeça na solução de corte a frio e movê-la para o vibrato. Corte o crânio com uma tesoura ao longo da sutura sagital do cerebelo até o bulbo olfatório.

Posteriormente, remova suavemente os retalhos cranianos usando um par de pinças Depois, excise a parte do cérebro usando um bisturi. Em seguida, faça dois cortes sagitais na parte mais lateral de cada hemisfério e corte o cérebro ao longo da fissura intra-hemisférica. Em seguida, remova suavemente o cérebro usando uma espátula e coloque-o em gelo Solução de corte a frio.

Coloque os dois hemisférios separadamente em um bloco de ágar 4% com o lado dorsal tocando o ágar. Em seguida, cole o bloco com o lado cortado lateralmente dos dois hemisférios na plataforma de um Vibram com o lado medial voltado para cima. Depois disso, coloque a plataforma na câmara Vibram.

Encha-o com a solução de corte. Em seguida, mantenha a solução oxigenada durante toda a preparação da fatia, borbulhando-a com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Agora prepare as seções de 250 mícrons de espessura com o vibrador.

Uma baixa velocidade de corte e vibração de alta frequência da lâmina devem ser usadas para obter seções de alta qualidade. Assim que uma fatia for liberada da lâmina, remova-a suavemente da solução de corte e coloque-a em uma câmara de incubação cheia de LCR A oxigenado mantido a 32 graus Celsius em banho-maria. Neste procedimento, coloque cuidadosamente a fatia na câmara de imagem do microscópio para evitar o desvio da fatia durante a imagem.

Estabilize-o colocando cuidadosamente uma malha de náilon por cima. Certifique-se de que a fatia seja continuamente perfundida com A CSF. Em seguida, use uma objetiva de 10 x para encontrar um campo de interesse.

Abra o software metamorfo e verifique se a malha de náilon não obstrui o campo de imagem. Em seguida, ative a objetiva de 40x e ajuste o foco. Certifique-se de que haja solução suficiente entre a objetiva e a fatia.

Usando o software metamorfo, defina os parâmetros de aquisição de lapso de tempo, como a duração da excitação, o número de planos Z, a distância entre cada seção Z, o intervalo de tempo e a duração da gravação. Em seguida, inicie a aquisição de lapso de tempo. Os dados são salvos automaticamente pelo Metamorph como um arquivo tiff Com cada arquivo correspondente a um ponto de tempo do vídeo de lapso de tempo adquirido para abrir o filme na

Sra.Carregue as imagens adquiridas simplesmente arrastando e soltando a primeira imagem de ponto de tempo do vídeo no ícone do programa. Assim que o filme for carregado, ajuste o brilho e o contraste do sinal na janela de ajuste da tela. Defina os parâmetros do vídeo adquirido, como o tamanho do voxel e o intervalo de tempo nas propriedades da imagem, e defina janelas de pontos de tempo equidistantes.

Depois de especificar o tamanho do voxel, é possível ver o quadro em 3D, bem como o tempo e a escala do vídeo para rastrear automaticamente as células gravadas. Crie um ponto para cada célula no campo na janela de superação escolhendo a função de pontos, meça o diâmetro da célula a ser rastreada na janela de fatia. Defina os parâmetros para rastreamento e prossiga.

Inspecione a confiabilidade dos objetos detectados ao longo do tempo. Se todas as células migratórias não forem detectadas automaticamente, altere o limite de detecção e certifique-se de que todas as células tenham sido selecionadas com pontos em todos os pontos de tempo. A distância máxima e o tamanho máximo da folga entre dois pontos que representam pontos de tempo vizinhos da mesma pista devem ser especificados para que o programa possa conectar os pontos de tempo.

Uma vez que as faixas são feitas, é possível filtrá-las e remover as faixas irrelevantes simplesmente excluindo-as. As faixas podem ser corrigidas conectando e desconectando diferentes faixas e diferentes pontos de tempo da mesma faixa assim que todas as correções forem feitas. Dê uma olhada final nas trilhas e exporte os dados, incluindo o deslocamento da célula por ponto no tempo, comprimento da trilha, comprimento do deslocamento e duração da trilha para um arquivo do Excel.

Este vídeo mostra a imagem de lapso de tempo da migração de neuroblastos verdes ao longo dos vasos sanguíneos marcados com dextrana, Texas vermelho. Observe que os neuroblastos migratórios apresentam comportamento saltatório quando as fases migratórias são interrompidas com períodos estacionários. E este vídeo mostra o rastreamento da migração de neuroblastos pelo software imas.

As esferas e linhas indicam os corpos celulares e as trilhas de migração para células individuais, respectivamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que fatias de vida aguda de boa qualidade do prosencéfalo de camundongo adulto devem ser obtidas. Além disso, as fatias devem ser bem estabilizadas na câmara de imagem, colocando cuidadosamente uma malha de náilon para evitar o desvio da fatia durante a imagem.

Quaisquer alterações na taxa de perfusão do LCR A, perfusão irregular ou variação drástica na temperatura podem causar deriva e alterações no plano focal durante a imagem. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como registrar e analisar a migração de neuroblastos nas fatias agudas de adultos. Recomendamos o uso de intervalos médicos curtos da ordem de 15 a 30 segundos para identificar com segurança o início e o fim das fases migratória e estacionária.