Name: Análise de uma única célula de transcrição do gene pela RNA Fluorescente In Situ A hibridização (FISH) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Aprenda a técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH) para analisar transcritos de mRNA em células individuais de Plasmodium falciparum. Este método permite detectar a transcrição simultânea de múltiplos genes var em eritrócitos infectados.

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Os autores gostariam de agradecer a Michael Alifrangis e Ulla Abildtrup para a genotipagem de parasitas e Holm Christina de assistência técnica excelente. Este trabalho foi financiado pelo Howard Hughes Medical Institute (concessão 55.005.511), a Fundação Lundbeck (concessão R9-A840) e pela Fundação Niels Bohr.

1. Geração de recentemente selecionados eritrócitos infectados Para este ensaio, os melhores resultados são obtidos quando se utiliza as culturas de fresco seleccionados para a expressão de superfície da proteína PfEMP1. Nesta experiência particular, a P. 3D7 linhagem falciparum foi seleccionada utilizando anticorpos específicos como previamente descrito 1. Dia 1 <ol><li> Ul 200 de colheita de células do sangue compactados a partir de um p falciparum de cultura contendo IE fase final de 2-5% por centrifugação a 800 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Re-suspender o sedimento de sangue em 2 ml de 37 ° C uma solução de 0,75% de gelatina quente em um tubo de 14 ml estéril, e deixar durante 15-20 min a 37 ° C para permitir que o IE não infectados e anel estágio para sedimentar. </li><li> Colheita do IE de fase final, isto é, a fase superior, para um tubo novo ml 14 e lavar duas vezes com 10 ml de 37 ° C, lavagem quente RBC-media. </li><li> Diluir 50 ul de anticorpos específicos anti-PfEMP1 anticorpos em 2 ml de 37 ° C quentes RBC-lavagem e meios filtrantes estéreis. </li><li> Misture o IE de fase final lavada com anti-soros diluídos esterilizada num tubo de 14 ml estéril e incubar durante 30 min a 37 ° C com agitação suave. </li><li> Girar a 800 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente, e lava-se duas vezes com 10 ml de 37 ° C, lavagem quente RBC-media. </li><li> Lave 50 ul da Proteína Dynabead A suspensão por duas vezes com RBC-lavagem mídia usando um ímã-15 DynaMaq. </li><li> Ressuspender as Dynabeads em 300 uL RBC-lavagem de mídia e adicioná-los ao IE fase final de lavada. Incubar durante 30 min a 37 ° C com agitação suave. </li><li> Transferir o tubo para o íman DynaMaq-15. Deixe por 1-2 minutos e retirar todo o líquido. </li><li> Ressuspender as Dynabeads em 4-5 ml de RBC-lavagem de mídia. Transfira a volta tubo sobre o ímã e deixe por 1-2 minutos antes de retirar todo o líquido. Repetir o passo de lavagem uma vez. </li><li> Transferir as pérolas lavadas para um 25 cm f cultura 2 estérillask contendo 200 ul de fresco glóbulos vermelhos. Adicionar 5-6 ml de Albumax mídia na cultura. Armazenar durante a noite a 5% de CO2 a 37 ° C. </li></ol> Dia 2 <ol start="12"><li> Remover as Dynabeads da cultura quando o IE seleccionou reocuparam as novas células vermelhas do sangue através da transferência de toda a cultura para um tubo de 14 ml estéril. Coloque o tubo sobre o ímã-15 DynaMaq e deixe por 1-2 min. Em seguida, despejar todo o líquido de volta para um frasco de cultura. </li><li> Cultura para o maior número possível de ciclos até a parasitemia de 5-10% e parasitas estão no ringstage. </li><li> IE devem ser analisadas por FACS para se certificar de que o fenótipo de superfície correcta, ou seja, a expressão da proteína de um ou outro and/orPF11_0008 PFD1235w foi obtida 1. </li></ol> 2. Preparação de Sondas As sondas de RNA anti-sentido foram obtidas a partir das regiões mais variáveis ​​do PFD1235w e o var PF11_0008 &lt;/ Em&gt; genes de P. falciparum 3D7 DNA genómico. O DNA foi amplificado por PCR e clonado no vector pSPT18 ou 19 para a transcrição, respectivamente de acordo com a descrição do fabricante (Roche). As sondas (580 pares de bases (pb) e 590 bp de comprimento) foram marcadas com digoxigenina (DIG) ou biotina utilizando um kit de marcação de ARN DIG ou a biotina RNA Mix rotulagem, respectivamente. Foi confirmada a especificidade das sondas tanto por análise de Northern blot e por um único rótulo análise FISH 1. 3. Smear fina e Fixação de Parasitas Antes de Hibridização In Situ Dia 1 Todos os passos são executados em um ambiente livre de RNase e todos os reagentes são RNase ou pré-tratadas com pirocarbonato de dietilo (DEPC) ou Zap RNase (Invitrogen). Os slides e lamínulas devem ser limpos com álcool para remover manchas de graxa fabricação residual. É importante realizar o protocolo, sem qualquer pausa entre os passosa fim de minimizar o risco de contaminação por nuclease. <ol><li> Fazer uma película fina de sangue pelo método de difusão padrão 3. Usando a lente 100x óleo objetivo do microscópio, contar o IE e calcular o percentual de IE na cultura. Verifique se os estágios do parasita estão em sincronia aproximada, no ringue e fases iniciais do ciclo de trofozoíto IE. Estes são pré-reprodução, uni-nucleadas fases, o mRNA do gene que expressa var e adequados para células individuais ensaios FISH transcrição deste tipo. </li><li> Transferir 50 uL da cultura parasita, a uma parasitemia de 5-10%, para um tubo Eppendorf de 1,5 ml sem RNase. Centrifugar durante 1 minuto a 2000 rpm à temperatura ambiente. </li><li> Remova a mídia e adicionar 50 pH PBS 7,2 em água tratada com DEPC. Agitar suavemente o tubo. Repetir o passo de sedimentação por centrifugação duas vezes para lavar as células livres a partir de meios de comunicação e os resíduos celulares. </li><li> Fazer quatro esfregaços finos de boa qualidade. Para cada esfregaço, fazer um esfregaço paraum diâmetro de 11 mm poço de uma corrediça 4 bem, ou seja, quatro lâminas de vidro, no total, em uma capa sem RNase (um passo crítico). Onda desliza brevemente ao ar para secar. Fazer três lâminas extra para slides negativo e um controlo para coloração única sonda para qualquer outro gene irrelevante usando uma sonda específica, uma outra corrediça para o tratamento com RNase e uma terceira lâmina contendo IE não expressa o gene de interesse. Deixe os slides para secar no banco por 10-20 min. </li><li> Fixar os filmes finos por adição de 60 ul de solução de fixação contendo paraformaldeído a 4% e 5% de ácido acético glacial para os poços. Deixe por 10 minutos no banco à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas em 2x SSPE tampão durante 5 minutos por meio de agitação suave à temperatura ambiente. Resumidamente remover o excesso de líquido por tocar os poços que contêm as células suavemente com um lenço de papel. </li><li> Cobrir as lâminas com pepsina a 0,01% em HCl 0,01 M durante 2 min a 37 ° C (um passo extremamente crítico). Lavar as lâminas em 2x SSPE, durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Dilui-se a solução de RNase para obter uma concentração final de 10 ug / ml. Cobrir os esfregaços de controlo negativo com 60 ul da solução de RNase. Incubar durante 30 min a 37 ° C e depois lavar as lâminas em 2x SSPE, durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Prosseguir imediatamente para a etapa de hibridização. </li></ol> 4. A hibridação de sondas de RNA de lâminas fixas Dia 1 <ol><li> Preparar a câmara de hibridação, tal como um ThermoStar 100 HC4 ou uma caixa vazia ponta da pipeta colocar num forno limpo, por pulverização com RNase Zap e limpando-a limpa com um lenço de papel. Encher os canais da câmara de hibridação ou o fundo da caixa com água tratada com DEPC para certificar-se de que as lâminas não sequem durante a hibridação. Fechar a câmara e pré-aquecimento a 48 ° C. </li><li> Diluir as sondas em solução de hibridização para uma concentração final de 12 ng / ul. Desnaturar a solução de sonda a 65 ° C durante 5 minutos num bloco de aquecimento. Imediatamente relaxar no gelo. </li><li> Resumidamente as lâminas de ar seco após a lavagem 2x SSPE. Cuidadosamente remover o excesso de líquido em torno dos poços com um lenço de papel. </li><li> Abrir a câmara de hibridação e colocar as lâminas na câmara. Aplicar uma ou ambas as sondas em um volume total de 60 ul por cavidade. Cuidadosamente cobrir a gota de líquido com uma lamela de cobertura isenta de RNase usando fórceps estéreis. </li><li> Fechar a câmara e hibridizar as lâminas a 48 ° C durante pelo menos 16 horas durante a noite. </li></ol> 5. Conjugação de anticorpos e de amplificação de fluorescência Dia 2 Os passos que se seguem têm por base o TSA Plus Sistema Paleta de fluorescência a partir de Perkin Elmer. Todos os passos são realizados à temperatura ambiente. <ol><li> Lavar as lâminas três vezes em tampão TNT durante 5 minutos com agitação suave. </li><li> Bloquear os poços em 150 ul de tampão de TNB para 30 min. </li><li> Dilui-se o anticorpo conjugado com HRP α DIG-TNB em tampão na proporção de 1:100 e o anticorpo conjugado com HRP α-biotina em tampão de TNB, na proporção de 1:500. Remover qualquer excesso de tampão TNB se as lâminas com um lenço de papel. Ao detectar duas transcrições simultaneamente, ambos os anticorpos podem ir de uma vez. Aplicar uma quantidade total de 100 ul da solução de anticorpo-TNB por poço e cuidadosamente cobrir com uma lamela. Incubar as lâminas durante 2 horas. </li><li> Retire as lamínulas cuidadosamente. Lavar as lâminas em tampão TNT 3 vezes durante 5 min. </li><li> Dilui-se o fluoróforo FITC no reagente de amplificação tiramida em uma proporção de 1:500 e utilizar a 100 ul da solução em cada poço. Cobrir os poços com lamelas e incubar durante 12 min. </li><li> Remover a tampa desliza cuidadosamente e lavar as lâminas três vezes durante 5 min em tampão TNT, por agitação suave. </li><li> Dilui-se a Cyan3 fluoróforo no reagente de amplificação tiramida a uma razão de 1:500. Adicionam-se 100 ul porbem desta solução. Cobrir os poços com lamelas e incubar durante 12 min. </li><li> Remova a tampa desliza cuidadosamente e depois enxaguar as lâminas rapidamente por imersão em tampão TNT. </li><li> Lavar as lâminas três vezes com tampão TNT, durante 5 min. </li><li> Imergir os slides rapidamente em água tratada com DEPC. </li><li> Deixe as lâminas para o ar seco. Montar as lâminas com anti-fade reagente contendo DAPI. Selar os cantos das lamínulas com unha polonês. </li><li> Os slides estão prontos para microscopia. Manter as lâminas cobertas com folha de alumínio e armazenar a 4 ° C se a experiência é para ser completada no dia seguinte. A vedação completa dos lados das lâminas pode ser realizada 24 horas após a aplicação do reagente anti-desbotamento. Isto irá permitir que as lâminas a ser trabalhada por até uma semana após o protocolo ter sido completado. </li></ol> 6. A visualização das sondas hibridizadas <ol><li> Ligue o microscópio. Um microscópio de imunofluorescência padrão é suffictário para esse tipo de experiência, mas se você tiver acesso a um microscópio confocal você também pode usar isso para imagens 3D ou obter vídeos de suas células coradas. Permitir microscópio para aquecer por 15-30 min. Ligue o computador eo software. </li><li> Verificar a qualidade da coloração no microscópio de imunofluorescência. Escolha um local que contém alguns parasitas. </li><li> Ajustar o ganho de cada laser manualmente. Ajuste o pixel habitam a 4-6 m -1 s -1 e os passos para 512 x 512 pixels. </li><li> Tire uma foto de teste usando Frame Lambda. Reajustar o ganho do laser. </li><li> Ter um mínimo de 20 fotos boas de fluorescentes células individuais. Pelo menos 2-5 imagens de um campo que contém 5-20 parasitas são necessários a fim de obter uma visão apropriada a percentagem de parasitas positivos. </li></ol>

<ol><li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083(2010).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCheeseborough%2C+M+%22District+Laboratory+Practice+in+Tropical+Countries%22">District Laboratory Practice in Tropical Countries</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (2006).</li>
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<li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li>
<li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li>
<li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li>
<li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li>
<li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mole+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li>
<li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

RNA análise FISH, em contraste com os métodos tais como a Northern blotting e RT-PCR, permite a discriminação de transcritos de mRNA específicos ao nível da célula individual. Isto torna possível a discriminação entre as células transcricionalmente activos e inactivos, neste exemplo, P. falciparum protozoários parasitas dentro glóbulos vermelhos humanos. Tais células inteiras observações são muitas vezes necessário e pode desvendar importantes e romance padrões de transcrição 1. <p class="jove_co...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> 338.826-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax mídia: solução RPMI Glutamina 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml de RPMI 1640 Solução de 5 ml de glutamina </td></tr><tr><td> Albumax mídia: Gentamicina sulfato Albumax solução </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml de gentamicina sulfato 50 ml solução Albumax- </td></tr><tr><td> Albumax solução: Hipoxantina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g Hipoxantina </td></tr><tr><td> Albumax solução: AlbuMAX II </td><td> Eunvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax solução: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 litros RPMI 1640 Dissolver com ímã no máximo. 50 ° C. Filtrar esterilizar e armazenar a -20 ° C em alíquotas. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> Sigma </td><td> A5710-110G </td><td> Resina para deionize formamida. </td></tr><tr><td> Anti-biotina de cabra conjugado com peroxidase de pAb </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Dig anticorpo </td><td> Novus biológicos </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fade reagente com DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> Os meios de montagem tem a curar durante 24 h antes de selar completamente a lâmina. </td></tr><tr><td> Biotina RNA Labeling Mix </td><td&gt; Roche </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> Câmera digital </td><td> Nikon vista digital DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> Menzel-glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> cultura em balão de 25 centímetros de superfície 2 Nunclon </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 32.490-100ml </td><td> 1 ml DEPC em 1000 ml de água deionizada. Adicionar uma barra de agitação e agita-se durante 12 h. Autoclave durante 30 minutos. </td></tr><tr><td> Câmera digital </td><td> Nikon vista digital DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads Proteína A </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 Ímã </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> Formamida 99% bioultra </td><td> Fluka/ Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Formamida desionizada: 5 g de resina de permuta iónica, por 100 ml de formamida. Agita-se 30 min. Filtrar através de papel Whatman. </td></tr><tr><td> Gelatina solução a 0 75%:. Gelatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td> 3,75 g de gelatina em 500 ml de RPMI 1640. Aquece-se a 56 ° C para dissolver. Filtrar esterilizar quando 56 ° C. Armazenar a -20 ° C em alíquotas. </td></tr><tr><td> Gelatina solução a 0 75%:. RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3,75 g de gelatina em 500 ml de RPMI 1640. Aquece-se a 56 ° C para dissolver. Filtrar esterilizar quando 56 ° C. Armazenar a -20 ° C em alíquotas. </td></tr><tr><td> Solução de glutamina: L-glutamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td><td> 14,6 g de glutamina L em 500 ml de NaCl a 0,9%. Dissolver, filtro sterilize e armazenar a -20 ° C em alíquotas. </td></tr><tr><td> Solução de glutamina: HCl </td><td> Sigma </td><td> H1758 </td><td> 14,6 g de glutamina L em 500 ml de NaCl a 0,9%. Dissolver, filtrar esterilizar e armazenar a -20 ° C em alíquotas. </td></tr><tr><td> Solução de hibridação: Formamida 99% Bio ultra-SSC 20x </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> 20 ml Total, manter congelados a -20 ° C em alíquotas 10 ml de formamida desionizada </td></tr><tr><td> Solução de hibridação: concentrado 50x Denhardt </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td> 20xSSC 5ml </td></tr><tr><td> Solução de hibridação: Yeast tRNARoche reagente de bloqueio </td><td> Sigma </td><td> R-6750 </td><td> 2 ml de 50x Denhardt 250 mg 20 ul por ml de ARNt de levedura </td></tr><tr><td><sTrong&gt; Solução de Hibridação: DNA de esperma de salmão </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 31.149-106GF </td><td> 0,4 g Roche bloqueio reagente 1 ml de 10 mg por ml de DNA de esperma de salmão (Crítica: desnaturar spermDNA salmão a 96 ° C durante 5 min antes da adição à solução de hibridação) </td></tr><tr><td> Hybridizer ThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoil Instruments GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> Pode ser substituído por forno de hibridação e câmaras de hibridização RNAse preenchidos com água DEPC. </td></tr><tr><td> Imersão em óleo UV transparente fluorescência livre </td><td> Sigma </td><td> 10.976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de imunofluorescência ou confocal </td><td> Nikon D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td> Disponível em qualquer farmácia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 2H 2 O x KH 2 PO 4 DEPC H2O deionizada </td><td></td><td></td><td> Ajust pH para 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l </td></tr><tr><td> Paraformaldeído a 4% </td><td> Fluka / Chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 g PFA em 80 ml de PBS / DEPC. Aquece-se a 65 ° C até que o PFA dissolve. Adicionar 20 ml de PBS, permitir que a solução arrefeça. Ajustar o pH a 7,4. Filtrar. Armazenar em alíquotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldeído a 4% / ácido acético a 5% </td><td></td><td></td><td> 950 paraformaldhyde ul + 50 ul de ácido acético </td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> Conjugado com peroxidase anti-biotina </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-lavagem de mídia: solução RPMI Glutamina 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml de RPMI 1640 5 ml solução glutamina </td></tr><tr><td> RBC-lavagem de mídia: sulfato de gentamicina </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml de gentamicina sulfato </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma / Aldrich </td><td></td><td> Faça um de 10 mg / ml de solução. </td></tr><tr><td> RNase livre tubo 1,5 ml </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> Desliza 4 poços 11 milímetros </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> NaCl 3 M (175 g / l), 0,3 M de citrato de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajustar o pH a 7,0 com HCl 1M </td></tr><tr><td> SSC 20x: citrato de sódio desidratado </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> W302600 </td><td> NaCl 3 M (175 g / l), 0,3 M de citrato de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajustar o pH a 7,0 com HCl 1M </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 175,3 g de NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S0751 </td><td> 27,6 g NaH 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x: 4 EDTA pó </td><td></td><td></td><td> 9,4 g de EDTA em pó Adicione a água DEPC, ajustar o pH 7,4. Automáticoclave durante 20 min </td></tr><tr><td> TNB tampão: tampão TNT </td><td></td><td></td><td> 10 ml de tampão TNT </td></tr><tr><td> TNB buffer: reagente de bloqueio </td><td></td><td></td><td> Reagente de bloqueio 0,05 g Para dissolver o reagente de bloqueio, aquecer a solução a 60 ° C durante uma hora com agitação. Armazenar a -20 ° C. (Derivado da Perkin Elmer TSA-protocolo). </td></tr><tr><td> TNT buffer: Tris / HCl </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td> 1M Tris / HCl, pH 8,0 </td></tr><tr><td> Tampão TNT: NaCl </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> TNT buffer: Tween20 </td><td> Sigma </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O869 Ml Ajustar o pH para 7,5 à temperatura ambiente. (Derivado da Perkin Elmer TSA-protocolo). </td></tr><tr><td> TSA mais o sistema Cyanine3 / Fluoresceína </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEL753000IKT </td><td> Leia o protocolo da TSA Plus Sistema Paleta de fluorescência cuidadosamente antes de iniciar o experimento. </td></tr><tr><td> Tubos de 14 ml estéril </td><td> Almeco - CM LAB Aps </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

análise de uma única célula de transcrição do gene pela rna fluorescente<em&gt; in situ</em&gt; a hibridização (fish)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adesão de eritrócitos infectados por Plasmodium falciparum (IE) para receptores endoteliais humanas durante infecções de malária é mediada pela expressão de PfEMP1 variantes proteicas codificadas pelos genes var. O P. haplóide falciparum genoma alberga aproximadamente 60 diferentes genes var de que um só tenha sido acreditados para ser transcrito por célula de cada vez, durante o estágio de sangue da infecção. Como regra, tais mutuamente exclusivos da transcrição de genes var é alcançado não é clara, assim como a identificação de genes individuais var ou sub-grupos de genes var associados com diferentes receptores e da consequência da ligação diferencial sobre os resultados clínicos de P. falciparum. Recentemente, o paradigma transcrição mutuamente exclusivos tem sido posta em dúvida por ensaios de transcrição com base no P. indivíduo falciparum identificação transcrição em inf únicoected células eritrocitários usando RNA hibridização in situ fluorescente (FISH) de análise de transcrição do gene var pelo parasita em núcleos individuais de P. falciparum IE 1. A seguir, apresentamos um protocolo detalhado para a realização do método RNA-FISH para análise da transcrição de genes var em núcleos única de P. falciparum infectados eritrócitos humanos. O método baseia-se na utilização de digoxigenina e biotina marcado com sondas de RNA anti-sentido, utilizando o sistema de Fluorescência de TSA Além paleta 2 (Perkin Elmer), as análises microscópicas e P. recém seleccionada falciparum IE. O método de hibridização in situ pode ser usado para controlar a transcrição e a regulação de uma variedade de genes expressos durante as diferentes fases do P. falciparum ciclo de vida e é adaptável a espécie de malária outros parasitas e outros organismos e tipos de células.

A Figura 1 ilustra um fluxograma dos passos principais e do tempo de duração da metodologia FISH RNA. Uma série de imagens representativas de bem e mal conservadas experiências FISH manchadas de mRNA utilizando P. única falciparum IE são mostrados na Figura 2. Este protozoário intracelular tem um núcleo (1-1,5 um de diâmetro) de pequeno porte, que é tingido de azul com DAPI. Vinte e quatro horas após a invasão dos eritrócitos em P. falc...

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridização (FISH) para identificar transcritos de ARNm em células individuais permite a análise da actividade poligênica tais como a transcrição simultânea de mais do que um membro da<em&gt; Var</em&gt; Família multigênica em<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Eritrócitos infectados<sup&gt; 1</sup&gt;. A técnica é adaptável e pode ser usado em diferentes tipos de genes, células e organismos.

Análise de uma única célula de transcrição do gene pela RNA Fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridização (FISH)

A adesão de eritrócitos infectados (IE) por Plasmodium falciparum a receptores endoteliais humanos durante as infecções por malária é mediada pela expressão de variantes da proteína PfEMP1 codificadas pelos genes var. O genoma haploide do P. falciparum possui aproximadamente 60 genes var diferentes, dos quais se acreditava que apenas um fosse transcrito por célula, por vez, durante a fase sanguínea da infecção. Não está claro como essa regulação mutuamente exclusiva da transcrição dos genes var é alcançada, assim como a identificação de genes var individuais ou subgrupos de genes var associados a diferentes receptores e a consequência da ligação diferencial no desfecho clínico das infecções por P. falciparum. Recentemente, o paradigma da transcrição mutuamente exclusiva foi questionado por ensaios de transcrição baseados na identificação de transcritos individuais de P. falciparum em células eritrocíticas infectadas únicas, utilizando a análise de hibridização in situ fluorescente (FISH) de RNA da transcrição de genes var pelo parasita em núcleos individuais de IE de P. falciparum1. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a realização da metodologia de RNA-FISH para a análise da transcrição de genes var em núcleos únicos de eritrócitos humanos infectados por P. falciparum. O método baseia-se no uso de sondas de RNA antisense marcadas com digoxigenina e biotina utilizando o TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), análises microscópicas e IE de P. falciparum selecionados recentemente. O método de hibridização in situ pode ser utilizado para monitorar a transcrição e a regulação de uma variedade de genes expressos durante as diferentes fases do ciclo de vida do P. falciparum e é adaptável a outras espécies de parasitas da malária e a outros organismos e tipos celulares.

Meu nome é Elena Rand e trabalho no Centro de Patologia Médica da Universidade de Copenhague, na Dinamarca. Aqui, aproximadamente 60 pessoas de várias partes do mundo trabalham com malária. Nosso grupo trabalha com focos de plasmodium, parasitas.São os mais virulentos, causando a doença malária em humanos no modo plus. O foco expressa proteínas de superfície que possuem várias funções, como adesão a células hospedeiras. O maior grupo de proteínas adesivas é o chamado odum foco proteína de membrana eritrocitária um, o chamado PfMP um.Existe pelo menos 60 variantes das quais se acredita que apenas uma seja transcrita por célula ao mesmo tempo durante a fase sanguínea da infecção. Em nosso departamento, acreditamos que mais de uma proteína possa ser transcrita simultaneamente nos parasitas. Um método para detectar essa atividade é a hibridização fluorescente de mRNA em sonda (FISH).Aqui apresentamos um método personalizado para a detecção de mRNA, transcritos de dois genes diferentes, em um único núcleo de eritrócitos infectados por odum FCI. O método leva dois dias para ser concluído. No primeiro dia, realiza-se a preparação das sondas de RNA, adicionando-as aos parasitas fixados em lâminas de vidro e à hibridização sobre agitação.No segundo dia, realiza-se a congregação do anticorpo, a amplificação do fluoróforo e a visualização dos parasitas corados no microscópio confocal. Para fornecer uma visão geral do experimento, é apresentado um fluxograma das operações e os reagentes e materiais críticos utilizados no experimento. Kit de marcação com digoxigenina RNAs zap, mistura de marcação de RNA, paraformaldeído, ácido acético glacial, anticorpo anti-dig, anticorpo anti-biotina, sistema de paleta fluorescente TSA PL plus, RNAs livres, microtubos, etanol ETH, lâminas de vidro limpas, lamínulas autoclavadas, equipamentos estéreis como tesouras e pinças, e um frasco de vidro com tampa.Os eritrócitos infectados precisam ser verificados por meio de microscopia para garantir que estejam no estágio de desenvolvimento adequado, ou seja, os estágios anulares com transcrição de VAR em sincronia e em boas condições. É crucial escolher o estágio exato do ciclo de vida em que ocorre a transcrição.Como espécies individuais de RNA são estagiadas, transcritas especificamente e degradadas rapidamente, as células devem ser lavadas suavemente antes de preparar esfregaços sanguíneos muito finos e de alta qualidade em lâminas de vidro limpas; uma camada monomolecular uniforme de hemácias infectadas na lâmina de vidro é então fixada em uma solução de 4% de paraformaldeído e 5% de ácido acético glacial por 10 minutos. Em seguida, as lâminas de vidro são lavadas duas vezes em PBS, removendo suavemente o líquido das lâminas com papel absorvente. Então, permeabilize as células com uma solução pré-aquecida de ácido clorídrico 10 milimolar antes de adicionar o Pepsi.Incube isto a 37 graus centígrados por dois minutos antes da hibridização. As sondas são desnaturadas a 65 graus centígrados por cinco minutos, resfriadas rapidamente em gelo e, em seguida, adicionadas às células, que agora estão fixadas sobre a lâmina de vidro. Coloque uma lamínula sobre as células e remova quaisquer bolhas de ar com a ponta de uma pipeta pequena. Umidifique a câmara de hibridização adicionando gotas de água duplamente destilada na periferia da câmara para que as lâminas permaneçam úmidas dentro da câmara.Durante o procedimento de hibridização, coloque as lâminas de vidro na câmara e hibridize durante a noite a 48 graus centígrados. Após 16 a 17 horas de hibridização, as lâminas são cuidadosamente removidas da câmara de hibridização. A partir deste passo, não há mais necessidade absoluta de um ambiente livre de RNAses.Lave as lâminas em um frasco de vidro contendo tampão TNT, certificando-se de que as lamínulas se soltem da lâmina de vidro. Repita o procedimento de lavagem três vezes, depois bloquee-as em tampão TNB por meia hora. Adicione aos células os anticorpos conjugados à HRP anti-dig ou anti-biotina marcados.Os dois tipos de anticorpos marcados podem ser adicionados simultaneamente. Se o experimento tem como objetivo detectar dois transcritos de mRNA nas células, os anticorpos devem ser pré-diluídos. Em tampão TNB, incubar por uma a duas horas, lavar três vezes em tampão TNT e, em seguida, adicionar um fluorocromo às células lavadas, FSE diluído ou ciano.Três soluções precisam ser preparadas recentemente. A partir deste passo, é importante não expor as lâminas diretamente à luz intensa. Incube as lâminas de vidro por 10 a 15 minutos com o fluorocromo.Se estiver detectando dois transcritos de mRNA após a primeira incubação, remova o primeiro corante e adicione o segundo. Faça uma lavagem final em Tampão TNT. Mergulhe as lâminas em água destilada duplamente antes de secá-las ao ar.Adicione a gota e coloque uma lamínula sobre a lâmina. Remova quaisquer bolhas de ar e selar as bordas da lamínula com esmalte incolor de secagem rápida. Aqui observamos um único eritrócito infectado contendo um parasita.O azul, o DPE representa o DNA do parasita, e o verde representa o mRNA de um gene que está sendo transcrito. Na outra imagem, a cor vermelha representa o mRNA de outro gene, e na terceira imagem podemos observar a dupla marcação de ambas as transcrições gênicas. As imagens também revelam que os mRNAs associados estão sobrepostos ao DNA nuclear e não geralmente posicionados acima ou ao lado dele.Em 99% dos eritrócitos infectados, podemos detectar o mRNA de dois genes sendo transcritos. Um aspecto importante deste experimento é verificar se as sondas não estão hibridizando com outros genes. Nesta imagem, incubamos os eritrócitos infectados com ambas as sondas, mas apenas uma sonda corresponde a um IE em expressão ativa. Os outros genes não estão sendo transcritos aqui.Essa situação é invertida nessas outras imagens dos eritrócitos infectados visualizados. Os parasitas *odium phos palm* possuem geralmente membranas bem preservadas, com coloração bem definida de ambos, DNA e RNA. Se as células forem, por alguma razão, de baixa qualidade, a coloração também se tornará ruim.Como é mostrado nesta imagem, o DNA e o RNA aparecerão difusos, turvos e relativamente indefinidos. Para concluir, pode-se afirmar que este método pode ser facilmente aplicado a outros parasitas transmitidos pelo sangue. Nossos dados de transcrição também foram confirmados por experimentos para detectar as proteínas traduzidas a partir dos RNAm analisados, utilizando anticorpos específicos direcionados contra as proteínas pf EMP1 expressas na superfície de células infectadas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

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DNA-RNA combinado fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; A hibridização (FISH) para estudar inativação do cromossomo X em Diferenciada Feminino Rato Células-Tronco Embrionárias

As células gigantes trofoblásticas (TGCs) desempenham um papel fundamental na placenta para garantir uma gravidez saudável. Apresentamos um protocolo para avaliar o estado transcricional de genes em TGCs por hibridização in situ fluorescente nascente em cortes de criostato de embriões pós-implantação ou culturas de curto prazo de cones ectoplacentários embrionários do dia 7.

Análise transcricional por RNA Nascente PEIXES de<em&gt; In Vivo</em&gt; Células trofoblásticas gigantes ou<em&gt; In Vitro</em&gt; Culturas de curto prazo de Ectoplacental Cone explantes

O protocolo descrito de RNA em situ hibridização permite a detecção de RNA em toda Drosophila embriões ou tecidos dissecados. Usando placas de 96 poços da microplaca e amplificação do sinal de tyramide, transcrições podem ser detectadas no throughput, sensibilidade e alta resolução e a um custo relativamente baixo.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

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Método para a rotulagem transcritos em células individuais Escherichia coli para único-molécula fluorescência In Situ as experiências de hibridação

Fluorescência de RNA de molécula única in situ hibridização (smFISH) é um método para quantificar com precisão os níveis e a localização de RNAs específicos no nível único celular. Aqui, relatamos nossos protocolos de laboratório validados para processamento de banco molhado, imagem e análise de imagens para quantificação de células únicas de RNAs específicas.

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