Name: Transformação genômica do Picoeukaryote Ostreococcus tauri (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a transformação genética por eletroporação em Ostreococcus tauri, uma alga marinha unicelular modelo. Este método permite gerar linhagens transgênicas estáveis para estudar redes regulatórias em biologia vegetal.

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SynthSys um Centro para Biologia de Sistemas Integrativa financiado pelo BBSRC e adjudicação EPSRC D019621. UE Rede de Excelência FP6 &quot;Genomics Marinhos&quot; bolsa para FYB financiou o desenvolvimento de métodos de transformação genética.

1. Preparação de Material de algas <ol><li> As células são cultivadas em Ostreococcus água do mar artificial (ASW). Sais do mar (tipicamente cerca de 40 gramas por litro) são dissolvidos em água desionizada para uma salinidade de 30 ppt, tal como medido usando um medidor de salinidade. Meio de enriquecimento 11,12, elementos vestigiais de metal e vitaminas são adicionados como descrito nas Tabelas 1-3. Os meios de comunicação é, então, esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 um. </li><li> Para a manutenção, as células de Ostreococcus estirpe OTTH95 são sub-cultivadas assepticamente a uma diluição de 1/100 em ASW fresco a cada 7 dias e cultivadas sob luz constante numa unidade de crescimento incubadora equipado com luar filtro azul. A intensidade da luz deve ser próximo de 20 umol m -2 s -1 e temperatura é mantida a 20 ° C. Células não requerem agitação constante, mas são agitados uma vez cada 2 a 3 dias para evitar a agregação. </li><li> Para cada transformação, 50 ml de células são necessários com uma célula density de 20-30 x 10 6 ml -1, que deve ser atingido 5-7 dias após sub-cultura. A densidade celular aproximada e axeny pode ser determinada utilizando qualquer citometria de fluxo ou um hemocitómetro a um mínimo de aumento de 40X. </li></ol> 2. Eletroporação <ol><li> Preparar DNA para a transformação. Para cada transformação, 5 ug de puro, o DNA linearizado plasmídeo é necessário a uma concentração de 1 ug / uL em água desionizada estéril. Para obter esse DNA, os autores recomendam usar um kit Qiagen midi preparação, embora outros métodos podem funcionar igualmente bem. Digerir o produto com uma enzima que corta na espinha dorsal do vector utilizado, mas não no transgene ou gene de selecção. Além disso purificar e concentrar o ADN linear resultante por precipitação com etanol, e ressuspender o produto no volume apropriado de alta qualidade da água desionizada estéril. </li><li> Preparar tubos de microcentrífuga contendo 5 ug de DNA para cada transformação. A controvérsial sem DNA é necessária para cada linha celular a ser transformado. Manter estes tubos em gelo, em conjunto com uma cuvete de electroporação 2 mm para cada transformação. </li><li> Preparar 2,2 ml de tampão de ressuspensão por transformação. Dissolver Sorbitol a uma solução 1 M em ddH2O, adicionar 0,1% de ácido Pluronic F68 eo filtro-esterilizar. </li><li> Adicionar ácido plurónico F68, a uma concentração final de 0,1% para as células, e pellet-los durante 10 minutos a 8000X g, a 10 ° C num tubo de 50 ml com fundo cónico. Imediatamente ressuspender as células em 1 ml de tampão de ressuspensão por pipetagem para cima e para baixo, e transferir para um tubo de microcentrífuga. Girar para baixo durante 10 minutos a 8000 xg a 10 ° C, e trabalhando rapidamente, repetir este passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Com uma ponta de corte, ressuspender cada sedimento final em 40 ul de tampão de ressuspensão. Adicionar 40 ul de as células ressuspensas a cada tubo de DNA linearizado em gelo, misturar suavemente e transferir para a cuvete de electroporação. </li><li> Coloque a cuba no electropmáquina de oração. Altere as configurações para 6 kV cm -1, 600 Ω e 25 uF. Electroporate as células. </li><li> Incubar as células electoporated nas cuvettes à temperatura ambiente durante 10 minutos, e usar esse tempo para preparar os frascos de cultura de tecidos. Identificá-los e adicionar 30 ml de ASW fresco a cada um. Tomar 1 ml de cada frasco e suavemente adicioná-la à cuvete correspondente. Incubar durante 2 minutos e remover suavemente a ASW, agora contendo o glóbulo de células e suavemente e lentamente pipetar directamente para o ASW no frasco de cultura. </li><li> Células permanecem tipicamente em um glóbulo. Tome cuidado para não abalar ou perturbar as células agregadas neste momento. Permitir que as células para se recuperar na incubadora durante 1-2 horas, em seguida, ressuspender por agitação dos frascos. Neste momento, as células devem ressuspender livremente e não aglomerados deve ser visível. Deixe as culturas para se recuperar durante a noite na incubadora. </li></ol> 3. Inclusão de células em placas em meio semi-sólido <ol><li&gt; No dia seguinte, autoclave uma solução de 2,1% de agarose de baixo ponto de fusão em ddH2O em um frasco contendo uma haste de agitação. Manter fundido a 65-90 ° C em um copo contendo água maior sobre um agitador magnético de aquecimento. Para cada transformação preparar 8 placas de Petri (55 mm de diâmetro) e 8 x 15 ml tubos cada um contendo 9 ml de ASW mais a selecção requerida. Se usando Nourseothricin ou G418, utilizar 2 mg / ml. </li><li> Recolher as células transformadas a partir da incubadora. Trabalhando em um flowhood estéril, adicionar 1 ml de ebulição LMP de agarose para os 9 ml de um dos tubos. Fechar o tubo e misturar por inversão. Em seguida, adicionar 0,5 ml de células de fresco transformadas, de forma rápida e misturar verter na placa. Repita esse processo com os restantes 7 tubos e prossiga para o balão de transformação que vem. </li><li> Deixar as placas abrir na capela de fluxo por uma hora, para a agarose a ser definido. Em seguida, feche as placas e transferi-los para grandes pratos quadrados de Petri, que irá realizar 4 placas cada. Selar a sagacidade placas quadradash parafilme. Note-se que as placas não irá definir completamente, e como resultado, o gel é muito frágil. Cuidados devem ser tomados para não quebrar o gel durante a movimentação das placas. Coloque todas as placas quadradas na incubadora. </li></ol> 4. Seleção de colónias transformadas <ol><li> Colónias deve aparecer após 10 a 21 dias, com as placas de transformação, mas não sobre as placas de simulação transformadas. Para escolher colônias usar uma pipeta de 200 ul com dicas de corte. Basta selecionar colônias livres e sugar a colônia verde. Tome cuidado para não incluir todas as células de colônias vizinhas. </li><li> Transferir as células a 2 ml de meio líquido contendo a selecção, numa placa de poços 24. Quando se utiliza Nourseothricin, usar 1,75 mg / ml. Misturar por pipetagem cima e para baixo. Selecione 24-50 colônias por transformação. Selar as placas com parafilme e transferência para a incubadora. </li><li> Após uma semana, transferir 100 uL de cada poço a 2 ml fresco ASW com selecção de uma placa de poços 24 e crescer para uma additional 7 dias. Linhas de células sobreviventes pode ser usado para estudos posteriores. Integração estável no número genoma e inserção deve ser analisado utilizando PCR e Southern Blot. O ADN genómico pode ser obtido para estes fins, utilizando qualquer método para baixo em escala padrão para extracção de ADN de plantas. </li></ol> 5. Os resultados representativos Células divididas 1/100 atingiu uma densidade de 25 milhões de células por mililitro após crescimento durante 7 dias. Eletroporação das células com as configurações adequadas resultou em um tempo de constantes entre 10 e 14 milissegundos. Quando as células são transferidas para o meio em frascos de cultura, um glóbulo de células deve formar-se. Quando levemente abalada depois de uma hora, as células devem facilmente ressuspender. A inclusão de células de 1 ml transformadas em agar LMP 0,2% deverá resultar num consistente, mas apenas gel semi-sólido. Colónias deve aparecer após 10 a 21 dias. Quando transformando 5 ug de DNA linearizado utilizando o protocolo anterior, 50-100 colónias por transformaçãoplaca foram tipicamente esperado, versus nenhum sobre as placas de controlo negativo. ~ 80% das colónias escolhidas foram positivamente seleccionadas pela resistência a antibióticos em meio líquido e foram utilizados em estudos subsequentes. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Concentração final </td><td> Solução estoque </td><td> Volume para 1 litro </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td> 8,83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> De NH4CI </td><td> 3,63 x 10 ~ 5 M </td><td> 2,68 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> β-glicerofosfato </td><td> 1 x 10 ~ 5 M </td><td> 2,16 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> H 2 3 SeO </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1,29 mg / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Tris-base (pH 7,2) </td><td> 1 x 10 M -3 </td><td> 121,1 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> K solução de metal traço </td><td></td><td> Tabela 2 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> f / 2 solução de vitaminas </td><td></td><td> Tabela 3 </td><td> 0,5 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Constituintes do meio para o crescimento de O. tauri 11, 12. Perfazer um volume total de 1 litro de água do mar artificial a uma salinidade de 30 ppt, e adicionar os componentes acima a partir de soluções de reserva, como indicado. Filtrar a esterilizar o meio e utilização dentro de uma semana. Existências de todos os compostos, excepto a solução de vitaminas podem ser agrupados para adicionar 6 ml desta solução para cada litro de meio. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Concentração final </td><td> Solução estoque </td><td> Valor para 1 litro </td></tr><tr><td> Na 2 </sub&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 M -4 </td><td></td><td> 41,6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 6H 2 O • </td><td> 1 x 10 ~ 5 M </td><td></td><td> 3,15 g </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6,3 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 ó </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22,0 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10,0 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180,0 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9,8 g / L dH <sub&gt; 2 ó </td><td> 1 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Rastreamento de metal solução 11,12. Perfaz-se a um total de 1 litro, em dH2O, e aquece-se dissolver. Solução alíquota eo congelamento para armazenamento. As concentrações finais indicadas referem-se ao meio final, não a solução de vestígios metálicos. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Concentração final </td><td> Solução estoque </td><td> Valor para 1 litro </td></tr><tr><td> A vitamina B 12 </td><td> 1 x 10 -10 M </td><td> 1 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Biotina </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0,1 g / L de dH2O </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> • A tiamina HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tabela 3. f / 2vitamina solução 11. Perfazer para um total de 1 litro em dH2O, filtro-esterilizar, alíquota e congelar. As concentrações finais indicadas referem-se ao meio final, não a solução de vitaminas. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Figura 1. Resumo gráfica do processo de transformação. Representação esquemática do procedimento para transformar geneticamente Ostreococcus tauri por electroporação. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Figura 2. Células de crescimento da cultura. São sub-cultivadas assepticamente a uma diluição de 1/100 em ASW fresco a cada 7 dias e cultivadas sob luz constante numa unidade de crescimento incubadora equipado com luar filtro azul. A intensidade da luz deve ser próximo de 20 umol m -2 s -1 e temperatura é mantida a 20 ° C Células não requerem agitação constante, mas são sHaken uma vez cada 2 a 3 dias para evitar a agregação. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Figura 3. Formação de colônias em 0,2% agarose LMP. Transferência de 4 placas de uma placa de Petri grande e quadrada, e vedação com parafilme (superior esquerdo). Quando formaram colônias, basta selecionar livres (de preferência de forma cónica) colônias (canto superior direito) e sugá-los para fora da placa com uma pipeta de p200. Não deve haver colônias no controle negativo (inferior direito).

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<li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light%2Fdark+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22B.M.C.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. Genomics. 11, 192(2010).</li>
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<li>Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt%2C+and+Detonula+confervacea+%28cleve%29+Gran%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).</li>
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<li>Djouani-Tari, elB. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus%3A+Application+to+circadian+clock+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471(2011).</li>
<li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957(2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Axeny estado e cultura celular é de importância crucial para o processo de transformação. Embora as células são normalmente mantida em ciclos de 12 horas de luz, 12 horas escuro, a eficiência da transformação nas células cultivadas sob estas condições foram encontrados para ser insuficiente. Durante os repetidos granulação / ressuspensão etapas, as células devem sempre ressuspender facilmente. Se as células agregado, ou uma substância muco-como é presente, é melhor para iniciar o processo desde o início novamente. Tipicamente, ~ 50 colónias pode ser esperado em cada placa de transformação, versus nenhum sobre a placa de controlo negativo. No caso de baixa eficiência de transformação, as condições de cultura deve ser variada para assegurar células estão no estado ideal. As variáveis ​​que afectam a eficiência de transformação incluem a temperatura ambiente no laboratório (deve estar próxima de 20 ° C) e velocidade de manipulação (Processo de granulação células [2,3] para recuperação [2,7] deve tomar ~ 1 hora). É também importante que todas as soluções de umre feito fresco antes de cada transformação. Para inclusão em placas, a concentração de LMP de agarose é crucial. Células Ostreococcus não crescerão em concentrações elevadas de agarose, e irá difundir em baixas concentrações. Três vetores de transformação para Ostreococcus foram publicados anteriormente 6, e mais vetores devem ser gerados e publicados em breve. O vector existente Pot-Luc 6 permite a utilização de um promotor de escolha, em combinação com uma etiqueta de pirilampo C-terminal da luciferase permitindo a selecção de linhas transgénicas mais rápida, mais padrões de expressão tratáveis, enquanto que o vector Potox 6 transporta o forte promotor indutível 13 tirada da Ostreococcus Fosfato de alta afinidade gene transportador (HAPT) para sobre-expressão de gene de interesse. O vector Potox-Luc deriva Potox, transportando um marcador de luciferase adicional que pode ser utilizada para a selecção de linhas indirecta superexpressão <saté&gt; 14. Marcadores de seleção de sucesso sobre esses vetores são Nourseothricin e G148. No entanto, as células Ostreococcus são altamente resistentes a vários antibióticos, e as concentrações de compostos necessários para a selecção de células transgénicas Ostreococcus é maior do que para os sistemas de modelo convencional (2 mg / ml). Embora o processo parece ineficiente, o grande número de células e ADN de plasmídeo necessária para este procedimento não representa qualquer obstáculo significativo. Um maior limitação é que cada linha gerada, que é resistente ao marcador seleccionável precisa de ser analisadas individualmente para verificar que a construção inteira está integrado no DNA. Observamos exemplos em que a expressão bem sucedida do marcador seleccionável não correspondiam a inserção do gene de interesse real; integrações ie parciais podem ocorrer. Evidentemente, a inserção aleatória no genoma também significa que não existe controlo do local de inserção utilizando este método, e métodos bom base na recombinação homóloga estão sendo desenvolvidos atualmente. No entanto, o método aqui descrito é, para o nosso melhor conhecimento, actualmente o único método caracterizado para gerar células Ostreococcus geneticamente modificados. Como Ostreococcus tauri só recentemente foi usado como um organismo modelo experimental, a maioria dos métodos de trabalho com essas células é susceptível de evoluir e ser refinado pela comunidade de pesquisa em crescimento envolvidos. Este protocolo destina-se a ajudar as pessoas a iniciar os trabalhos com Ostreococcus, mas nem por isso pretende descrever tudo o que há para saber sobre a transformação genômico da microalga. A confiança autores que os leitores serão capazes de se adaptar este protocolo para suas próprias necessidades como pequenas diferenças em incubadoras (níveis de luz ou de qualidade) e os outros parâmetros existentes e provavelmente terá de ser otimizado em cada laboratório individual para obter as culturas saudáveis ​​necessários para este protocolo. Depois de dominar as técnicas descritas aqui,vectores podem ser construídos para gerar luminescente, fluorescente, ou outras linhas de fusão etiquetados sob o controlo de uma variedade de promotores. Esta plataforma experimental emocionante novela será útil para estudar como os complexos problemas bioquímicos são resolvidos em um eucarionte de complexidade reduzida, em que abordagens farmacológicas são altamente facilitada 3.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Constituintes do meio </td></tr><tr><td> Químico </td><td colspan="2" > Número de catálogo </td><td> Fornecedor </td></tr><tr><td> Instantânea Marinha do Oceano Sal </td><td colspan="3"> da <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> ou <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> De NH4CI </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glicerol 2-fosfato hidrato de sal dissódico </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 3 SeO </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ultra pura tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2 O 2H </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 6H 2 O • </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 ó </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203.734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> A vitamina B 12 (cianocobalamina) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Biotina </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> • A tiamina HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Neomicina </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Canamicina </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Os consumíveis para a cultura </td></tr><tr><td colspan="2"> Item </td><td> Número de catálogo </td><td> Fornecedor </td></tr><tr><td colspan="2"> Frasco para cultura de tecidos T25 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Frasco para cultura de tecidos T75 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Frasco para cultura de tecidos T175 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Garrafa TPP filtros principais, 1l, completos </td><td> 99950T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtros Garrafa TPP topo, 500ml, </td><td> 99500T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> Garrafa TPP filtros topo, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> Garrafa TPP filtros topo, 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> Medidor de Salinidade para Marine Aquarium </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Produtos químicos para a transformação </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Catálogonúmero </td><td> Fornecedor </td></tr><tr><td> D-Sorbitol </td><td> S6021-1KG </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Solução de Pluronic F-68 </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Baixo ponto de fusão de agarose </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Consumíveis para a transformação </td></tr><tr><td> Item </td><td> Número de catálogo </td><td> Fornecedor </td></tr><tr><td> Frasco para cultura de tecidos T25 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Frasco para cultura de tecidos T75 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Frasco de cultura de tecido T175 Suspensão Cultures perfurada com derramamento Canal </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Tubos de centrífuga Greiner 50ml </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gene Pulser / MicroPulser Cubetas, 0,2 gap cm, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petri prato redondo PS 3 ABERTURAS H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Placa de Petri quadrado, com quatro saídas de poliestireno estéril por 120 milímetros de irradiação clara </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Luar Azul filtro de luz </td><td> 183 </td><td> Lee Iluminação </td></tr></tbody></table>

transformação genômica do picoeukaryote<em&gt; ostreococcus tauri</em

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Os problemas mais comuns que impedem um progresso rápido em Ciências da planta incluem tecido, celulares e complexidade organismo como um todo e, nomeadamente, o elevado nível de redundância genética genômica afetando simples em plantas superiores. O novo modelo organismo Ostreococcus tauri é o menor eucariota de vida livre conhecido até à data, e possui um tamanho de genoma grandemente reduzida e 1,2 complexidade celular, que se manifesta-se pela presença de apenas uma da maioria dos organelos (mitocôndria, cloroplasto, pilha de Golgi) por celular, e um genoma que contém apenas ~ 8000 genes. Além disso, a combinação de unicellularity e cultura fácil proporciona uma plataforma passível de abordagens em biologia químicos. Recentemente, Ostreococcus tem sido empregada com sucesso para estudar mecanismos básicos subjacentes cronometragem circadiano 3-6. Os resultados deste organismo modelo ter afetado não só a ciência das plantas, mas também a biologia dos mamíferos 7. Este exemplo evidencia como a experimentação rápida em umeucarioto simples da linhagem verde pode acelerar a pesquisa em organismos mais complexos, gerando hipóteses testáveis ​​utilizando métodos tecnicamente viáveis ​​apenas neste fundo de menor complexidade. Conhecimento de um genoma ea possibilidade de modificar genes são ferramentas essenciais em qualquer espécie de modelo. Genomic 1, transcriptomic 8, 9 e informação Proteômica para esta espécie está livremente disponível, ao passo que os métodos anteriormente relatados 6,10 para transformar geneticamente Ostreococcus são conhecidos por poucos laboratórios em todo o mundo. Neste artigo, os métodos experimentais para transformar geneticamente este organismo novo modelo com uma sobre-expressão de construção através de electroporação são descritas em detalhe, bem como o método de inclusão de células transformadas em baixo percentagem de agarose para permitir a selecção de linhas transformadas provenientes de uma único transformado da célula. Após o sucesso da aplicação OstreocoCCUs para pesquisa circadiano, o interesse crescente em Ostreococcus pode ser esperado de diversas áreas de pesquisa dentro e fora das ciências vegetais, incluindo áreas biotecnológicas. Pesquisadores de uma ampla gama de ciências biológicas e médicas que trabalham em conservadas vias bioquímicas podem considerar a investigação prossegue em Ostreococcus, livre da complexidade genômica e organismal de espécies de maior porte do modelo.

Este artigo descreve a transformação genética da alga marinha unicelular<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; Por eletroporação. Este organismo eucariótico é uma plataforma de modelo eficaz para plantas superiores, possesing muito reduzida complexidade genômica e celular e de ser facilmente passíveis de ambos cultura de células e biologia química.

Transformação genômica do Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Problemas comuns que dificultam o progresso rápido nas Ciências Vegetais incluem a complexidade celular, tecidual e de todo o organismo e, notavelmente, o alto nível de genômica...

O objetivo geral deste procedimento é gerar e selecionar linhagens estáveis de transformação do novo organismo modelo, Austria Occus Tori, uma espécie marinha de alga eucariótica pico. Isso é realizado primeiramente gerando pellets celulares a partir de 50 mililitros de cultura densa de ALG por transformação. O segundo passo é misturar as células com DNA linearizado e, em seguida, realizar a eletroporação.Após diluir as células transformadas em meio fresco e incubar durante a noite, adicione 0,2% de agarose de ponto de fusão baixo e um agente seletivo, e despeje a mistura em pequenas placas de Petri. O passo final consiste em selecionar as colônias resultantes que terão crescido após dois a três semanas de incubação sob luz azul constante. Por fim, a seleção em meio líquido e análises moleculares subsequentes, como PCR e southern blot, são utilizadas para demonstrar a integração bem-sucedida do construto no genoma das linhagens transgênicas geradas.A principal vantagem do uso deste organismo em comparação com organismos modelo existentes, como o Arabidopsis, é a redução acentuada da complexidade genômica, o que permite o estudo de redes regulatórias em um contexto com praticamente nenhuma redundância genética. Embora em meu laboratório tenhamos usado o osteo occus para estudar o relógio circadiano vegetal, ele pode ser empregado para investigar muitas outras redes celulares complexas. Assim, as implicações desta técnica vão muito além do campo da biologia vegetal.A demonstração visual deste método é fundamental porque, embora as etapas individuais pareçam bastante simples, o manuseio adequado das células e um fluxo de trabalho eficiente são essenciais para obter um bom resultado. Partes deste procedimento serão demonstradas por Culin Kish, assistente de pesquisa de um laboratório. As células Austria Occus são aclimatadas em água do mar artificial ou uma SW para preparar uma SW dissolvendo 40 gramas por litro.Adicione sais marinhos em água deionizada até uma salinidade de 30 partes por mil ou PPT, conforme medido. Usando um medidor de salinidade, adicione enriquecimento, elementos de metais-traço em concentração média e vitaminas, e então filtre esterilizando através de um filtro de 0,22 mícron células brutas de Austria cocus linhagem O TT H 95 em um SW sob luz constante. Em um incubador de crescimento vegetal equipado com filtro azul-luar, a intensidade luminosa deve ser próxima a 20 mícromoles por metro quadrado por segundo, e a temperatura mantida a 20 graus Celsius. As células não requerem agitação constante, mas devem ser agitadas uma vez a cada dois ou três dias para prevenir agregação.Para manutenção, repique as células assépticamente em uma diluição de um para 100 em SW fresco a cada sete dias. Cada transformação requer 50 mililitros de células com uma densidade celular de 20 a 30 vezes 10 à sexta células por mililitro. Essa densidade deve ser atingida cinco a sete dias após o repique.A densidade celular aproximada e o eixo podem ser estimados em um hemocitômetro com aumento mínimo de 40 vezes. A magnificação ou preferencialmente pode ser determinada por citometria de fluxo. Um exemplo de culturas saudáveis versus não saudáveis é mostrado aqui.Cada gráfico biométrico mostra a dispersão lateral ou SSC no eixo y versus a fluorescência vermelha por célula ou FL três no eixo x. FL três representa a fluorescência vermelha da clorofila, e SSC indica o tamanho celular relativo. As células saudáveis caem na janela Austria Occus, enquanto células moribundas ou bactérias contaminantes caem fora dessa janela.Idealmente, mais de 99% das células devem estar na janela Austria Occus. Para uma transformação genética eficiente, cada transformação requer cinco microgramas de plasmídeo linearizado puro, DNA na concentração de um micrograma por microlitro. Em água desionizada estéril, o plasmídeo foi linearizado por uma enzima que corta no esqueleto do vetor utilizado, mas não no transgene ou no gene de seleção.Mantenha o tubo de microcentrífuga contendo DNA no gelo junto com um eletroporador de dois milímetros para cada transformação. Um controle sem DNA é necessário para cada linhagem celular a ser transformada. Para cada transformação, transfira 50 mililitros de células para um tubo com fundo cônico, adicione ácido F 68 a 0,1% e centrifugue por 10 minutos a 8.000 × g a 10 °C.Para pelotizar as células, descarte imediatamente o sobrenadante e adicione um mililitro de tampão de suspensão Resus às células. Suspender as células com Resus pipetando para cima e para baixo, transfira para um tubo microfuga e centrifugue por 10 minutos a 8.000 × g a 10 °C. Lave as células mais uma vez após a segunda centrifugação, trabalhando rapidamente.Corte uma ponta de pipeta P200 para ressuspender cada pellet em 40 microlitros de solução de ressuspensão. Adicione 40 microlitros do tampão de células ressuspensas a cada tubo contendo DNA linearizado em gelo. Misture suavemente e transfira para o vete de eletroporação.Coloque o vete na máquina de eletroporação. Ajuste as configurações para seis quilovolts por sensor recíproco, 600 ohms e 25 microdias. Eletrooperar as células após a eletroporação.Incube as células nas cubetas à temperatura ambiente por 10 minutos. Durante esse período, rotule os frascos de cultura de tecidos e adicione 30 mililitros de a SW fresco a cada frasco. Retire um mililitro de a SW de cada frasco e adicione suavemente ao vete correspondente, incubando por dois minutos.Em seguida, remova suavemente um SW que agora contém o aglomerado de células e, com cuidado e lentamente, pipete diretamente para dentro de um SW. No frasco de cultura, as células normalmente permanecerão em um grande aglomerado. Tenha cuidado para não agitar ou perturbar as células agregadas neste momento. Deixe as células se recuperarem no incubador por uma a duas horas.Por fim, ressuspenda as células agitando manualmente o frasco. Neste ponto, as células devem se ressuspender livremente e nenhum agregado deve ser visível. Deixe os cultivos recuperarem durante a noite no incubador no dia seguinte à eletroporação. Autoclave uma solução de 2,1% de agarose de ponto de fusão baixa em água bidestilada em um frasco contendo uma barra de agitação.Mantenha fundido a 65 a 90 graus Celsius em um béquer maior contendo água em um agitador magnético aquecedor. Para cada transformação, prepare oito placas de Petri de 50 milímetros e oito tubos de 50 mililitros, cada um contendo nove mililitros de SW mais. A seleção necessária.Colete as células transformadas do incubador. A parte mais difícil deste procedimento é a inclusão das células transformadas em géis de agarose de baixa porcentagem sem romper a integridade das células, expondo-as a muito calor. Portanto, é importante realizar os próximos passos do procedimento de forma rápida e eficiente, trabalhando em uma câmara de fluxo estéril.Adicione um mililitro de agarose de ponto de fusão baixa próximo à fervura ao nove mililitros de SW. Em um dos tubos, feche o tubo e inverta para misturar. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de células recentemente transformadas. Feche e inverta o tubo rapidamente para misturar e, então, despeje o conteúdo no recipiente de Petri.Repita este processo com os sete tubos restantes e, em seguida, prossiga para o próximo frasco de transformação. Deixe as placas abertas na câmara de fluxo laminar por uma hora para que o meio solidifique. Em seguida, tampe as placas e transfira-as cuidadosamente para placas de Petri quadradas maiores, cada uma contendo quatro placas redondas.Como as placas não foram seladas completamente, o gel é muito frágil. Tenha cuidado para não quebrar o gel ao manipular as placas. Selo as placas quadradas com paraform e coloque-as no incubador.Após o aparecimento das colônias, utilize uma micropipeta de 200 microlitros com ponteiras cortadas. Para selecionar colônias em uma cabine de segurança estéril, basta escolher colônias isoladas e aspirar uma colônia verde. Tenha cuidado para não incluir células de colônias vizinhas.Transfira as células para dois mililitros de meio líquido contendo o agente de seleção. Em uma placa de 24 poços, misture aspirando e expelindo suavemente. Após selecionar 24 ou 48 colônias por transformação, feche as placas com filme adesivo e transfira para a incubadora.Após uma semana, transfira 100 microlitros de cada poço para dois mililitros de meio SW fresco com seleção. Em uma placa de 24 poços, cultive por mais sete dias. As linhagens celulares sobreviventes podem então ser utilizadas para estudos adicionais ao transformar cinco microgramas de DNA linearizado.Utilizando este protocolo, 20 a 60 colônias por placa de transformação devem aparecer após duas a três semanas. Aproximadamente 80% das colônias selecionadas foram positivamente selecionadas pela resistência ao antibiótico em meio líquido e foram utilizadas em estudos subsequentes após este procedimento.Outros métodos, como PCR ou Southern blot, podem ser subsequentemente realizados para verificar o número e a localização da inserção do gene marcador após seu desenvolvimento. Essa técnica permitiu que pesquisadores nas áreas do relógio circadiano e do ciclo celular compreendessem os componentes e comportamentos complexos de seus respectivos sistemas nesse novo organismo modelo, Austria caucasus. Tori, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar linhagens transgênicas de Austria caucasus.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O protocolo descreve a expressão da proteína utilizando a levedura...

Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris</em

Sistemáticas e em grande escala genético sintético telas (gene-gene ou epistasia) interação pode ser usado para explorar a redundância genética e via de cross-talk. Aqui, descrevemos um alto rendimento quantitativo tecnologia de rastreamento genético sintético matriz, denominada eSGA que desenvolvemos para a elucidação de relações epistáticos e explorar redes de interação genéticos...

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Fonte: Stefan, A., et al., Os benefícios multifacetados da co-expressão de proteínas em Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o procedimento para transformar Escherichia coli com um plasmídeo portador de um gene de resistência a antibióticos, incluindo preparação celular, eletroporação, recuperação e seleção de transformantes.

Preparação e transformação de bactérias usando eletroporação de alta tensão

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

A co-expressão de proteínas é uma alternativa poderosa para a reconstituição in vitro de complexos proteicos e auxilia na realização de testes bioquímicos e genéticos in vivo. Aqui relatamos o uso da co-expressão de proteínas em Escherichia coli para obter complexos proteicos e ajustar a frequência de mutação das células.

As multifacetadas benefícios da proteína Co-expressão em<em&gt; Escherichia coli</em

Biolistic transformação é um método usado para gerar a integração estável de ADN no genoma das oportunistas Cryptococcus neoformans patogénio através de recombinação homóloga. Iremos demonstrar transformação biolística de uma construção, o qual tem o gene que codifica a quinase de etilo fundido com o marcador fluorescente mCherry em C. neoformans.

Transformação Biolistic de uma fluorescente Tagged Gene para o oportunista fúngica Pathogen<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

É apresentada aqui uma descrição unificada de técnicas que podem ser utilizadas para desenvolver, transformar, administrar, e testar a expressão da proteína heteróloga dos probióticos levedura Saccharomyces boulardii.

Transformação de levedura probiótica e sua recuperação a partir gastrointestinais imunitário tecidos após a sonda oral em camundongos

Biologia sintética permite a engenharia de proteínas com propriedades sem precedentes usando a inserção co-translational de aminoácidos não-canônicas. Aqui, apresentamos como uma variante espectralmente avermelhado de um fluoróforo GFP-tipo com propriedades espectroscópicas de fluorescência romance, denominado proteína fluorescente "ouro" (GdFP), é produzida em Escherichia coli através de incorporação de pressão seletiva (SPI).

Engenharia 'Dourada' fluorescência por pressão seletiva de incorporação de aminoácidos não-canônicos e análise de proteínas por espectrometria de massa e fluorescência

Aqui, apresentamos protocolos para trabalhar com Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detalhando crescimento, transformação plasmidial, PCR de colônias, medição de proteína repórter fluorescente e mini-preparação limitada de plasmídeos, bem como problemas comuns e solução de problemas. Esses protocolos permitem a medição de proteínas repórteres em DSM20016, ou a confirmação via PCR de colônia se nenhum repórter estiver envolvido.

Métodos para Confirmação de Eletroporação e Transformação em Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Neste manuscrito, fornecemos um protocolo abrangente para avaliar a sobrevida de antibióticos para Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, transformando plasmídeos em P. aeruginosa e S. aureus para criar cepas repórteres e visualizar variantes fenotípicas, como persistentes, por microscopia de epifluorescência de lapso de tempo.

Imagem de microscopia de epifluorescência de lapso de tempo de fenótipos heterogêneos de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus

Este protocolo emprega um repórter bioluminescente, permitindo medições da atividade transcricional em Saccharomyces eubayanus para monitorar a transição glicose-maltose, permitindo a análise em tempo real das adaptações metabólicas e apoiando a otimização da cepa para fermentação industrial sob diversas condições.

In vivo Monitoramento da atividade transcricional durante a transição metabólica usando um repórter bioluminescente em levedura

Aprenda a transformação genética por eletroporação em Ostreococcus tauri, uma alga marinha unicelular modelo. Este método permite gerar linhagens transgênicas estáveis para estudar redes regulatórias em biologia vegetal.

Transformação genômica do Picoeukaryote

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