Name: Proteína amplificação cíclica misfolding de príons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a técnica PMCA para amplificar cepas de príons de hamster in vitro usando sonicação e ciclos de incubação. Este método auxilia pesquisadores a estudar conversão de príons e barreiras de espécie.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Vesper Fe Marie Ramos para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 e G20RR024001) e do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (2R01 NS052609).

1. Preparando o Equipamento <ol><li> Usar um 3000 Misonix ou sonicador Misonix 4000 (Farmingdale, NY) ligado a um banho de Thermo Electron Neslab EX-7 água (Newington, NH) para manter uma temperatura constante de 37 ° C. Sonicar as amostras em 200 uL de paredes finas tiras de tubos PCR com tampas abobadadas obtidos a partir de Thermo Scientific (Waltham, MA). </li><li> A sonicador novo requer um &quot;break-in&quot; período de operação contínua 9. Uma quebra-in período de dois meses é composto por uma onda de ultra-sons de 40 seg e ciclos de 10 minutos de incubação com o nível de amplitude definida para 10. Deve-se observar a erosão ao longo da superfície da microplaca titânio corno (Figura 1, painel B). A circulação de água vai ficar turva branca, devido à erosão da microplaca de titânio chifre. Substituir essa água por dia. </li><li> A amplificação da PrP Sc irá variar ao longo da trompa de microplacas. A melhor eficiência de amplificação da PrP Sc pode ser obtida dentro deum raio de 5 cm a partir do centro do feixe de microplacas (Ver Figura 1, Painel C). </li><li> Uma rodada de PMCA consiste 144 ciclos. Cada ciclo é constituído por cinco segundos de sonicação e 10 minutos de incubação. Isso vai implicar cerca de 24 horas por rodada de PMCA. </li><li> A saída de energia de ultra-sons, exibido no painel de controle do sonicador, varia de acordo com o número de tubos de PCR presentes na prateleira do sonicador e a temperatura da água de circulação do banho de água. Certifique-se de que a água é equilibrado a 37 ° C, e não encha mais do que 30% de cremalheira do sonicador do tubo (Figura 1, painel C). Espalhe os tubos de PCR através do chifre microplaca. Ter pelo menos uma linha de espaço vazio entre as tiras de tubos de PCR e permitir não mais do que quatro tubos ligados entre si por tiras (Figura 1, painel C). </li><li> A força de sonicação é crítica para uma amplificação bem sucedida de prião estirpe. Enquanto sonicando, ajustar a amplitude de ter uma saída de potênciavariando entre 155 ~ 170 watts. Em nosso laboratório o nível de energia está definido para seis e sete para o 3000 Misonix e Misonix 4000, respectivamente. </li><li> Uso de água destilada em banho de água para evitar a acumulação manchas de água dura. Substituir este semanário água. Durante os ciclos de incubação e de sonicação, a condensação de água irá ocorrer no interior da tampa de chifre de microplacas. Para evitar a condensação, coloque um bloco de calor pequeno aquário para o topo da caixa do sonicador do invólucro, conforme mostrado na Figura 1, o painel A. </li></ol> 2. Preparação das amostras <ol><li> Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Creighton University Use Comissão e cumprir com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Antes de qualquer recolha de tecido, o animal deve ser anestesiado e transcardially perfundidos com fosfato arrefecido com gelo, com solução salina tamponada com EDTA 5 mM, pH 7,4, para remover o sangue do cérebro e evitar a inibição daPMCA reação por sangue 7. Coletar tecidos animais rapidamente, usando técnica asséptica e ter instrumentos de dissecação dedicados para cada cepa príon. Após a dissecação, colocar o tecido em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, flash congelá-lo em gelo seco e armazená-lo a -80 ° C até à homogeneização. </li><li> Para preparar a solução de substrato PMCA (PrP C), homogeneizar o cérebro de hamster não infectadas (UN BH) para uma solução a 10% peso / volume (w / v) com tampão de gelo frio de conversão (ver parte 3), utilizando um triturador de tecidos Tenbroeck. Enquanto homogeneização, tome cuidado para não entrar ar dentro do moedor para evitar o excesso de espuma da solução. Clarificar a solução por centrifugação a 500 xg durante 30 seg e aliquota do sobrenadante em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Para preparar a semente PMCA (PrP Sc) de solução, homogeneizar um material infeccioso (gânglios cerebrais, baço, linfa, ou outros tecidos ou solo contaminado), a uma solução a 10% w / v de gelo frio water e alíquota da solução em tubos de microcentrífuga de 0,6 ml. Armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 3. Preparando buffer de conversão <ol><li> Pesar 0,5093 g de Triton X-100, num balão volumétrico de 50 ml (resultado é uma concentração final de 1% de Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH; Steinheim, Alemanha). </li><li> Adicionar um inibidor de protease completo Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). </li><li> Adicionar 0,0931 g de EDTA (isto irá resultar numa concentração final de 5 mM de EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc.; Phillipsburg, NJ). </li><li> Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1N. </li><li> Ajustar o volume a 50 ml com fosfato salino tamponado de Dulbecco (DPBS) (Mediatech Inc., Manassas, VA). </li><li> Filtrar a solução através de uma membrana de nitrocelulose de 0,45 um, com um aparelho de filtração sob vácuo. O buffer de conversão pode ser armazenado a 4 ° C durante não mais de um mês. </li></ol> 4. Amplificação de Cepas Prion Usando PMCA <ol><li>Dilui-se a semente para dentro do substrato PMCA PMCA numa proporção de 1:20 (mistura ou seja, 5 ul da semente PMCA e 95 ul do substrato PMCA) para um tubo de PCR. Remover e armazenar-se uma alíquota de 15 uL a -80 ° C para o controle unsonicated; este controlo unsonicated será utilizada para quantificar a PrP Sc amplificação através de proteinase K de digestão (PK), seguido por análise Western blot (WB). Um controlo adicional pode ser gerado unsonicated colocando uma aliquota 15 segundo uL a 37 ° C durante a duração da reacção PMCA. Um mínimo de três repetições é necessária para fins estatísticos. </li><li> Objecto do restante da amostra (70 ul) para um ciclo de PMCA como representado na Figura 1, Painel A. Agitação tubos cada hora 5 para evitar a condensação de água na tampa abaulada do tubo de PCR. </li><li> Tubos da amostra deve ser girado para baixo e gentilmente agitadas (tendo o cuidado de que a solução não vão para a tampa abobadada) antes de abrir depois de qualquer procedimento para garantir homogeneity e evitar a contaminação potencial. </li><li> Para PMCA serial (sPMCA) de estirpes de incubação curtos períodos (isto é, HY TME, HaCWD ou 263K), dilui-se o material sonicado a uma proporção de 1:20 em transferir 5 ul da amostra sonicada de uma rodada em 95 ul de uninfected fresco homogenato cerebral (Figura 2, painel B). </li><li> Para sPMCA de estirpes de incubação longos (por exemplo, período de DY TME, 139H, 22CH, 22AH, ou ME7H), dilui-se o material sonicado a uma proporção de 1:1, transferindo 50 ul da amostra sonicada da rodada em 50 ul de uninfected fresco homogenato cerebral (Figura 2, painel B). </li><li> Remover duas alíquotas de 15 ul da mistura previamente diluída sonicado (a partir de etapas de 4,4 ou 4,5), e armazenar uma delas a -80 ° C e o outro a 37 ° C (solução de controlo para unsonicated PMCA dois redondos). Submeter os restos de uma rodada PMCA dois. </li><li> Este procedimento pode ser repetido indefinidamente. Em nosso laboratório, nóster realizado até 15 rodadas PMCA, com as propriedades de tensão permaneçam inalteradas. </li><li> PK digerir as amostras. Para um típico WB, misturar 5 ul de PK pi 80 ug / ml a 5 de amostra (esta solução irá ter uma concentração final de PK de 40 ug / ml) e incubar a 37 ° C durante uma hora. Adicionar 10 ul de tampão de carga de gel. Ferver esta solução durante 10 min. Deixar a solução arrefecer e 10 ul carregar no gel. </li><li> Para calcular o sucesso da amplificação realizar uma análise de WB nas amostras PK-digeridas para estimar a quantidade de PrP Sc amplificado comparando-os com um ou outro, os controles unsonicated 20,21 Figura 2, painel C ou a quantidades conhecidas de PK-recombinante não digerido PrP. </li></ol> 5. Evitando a contaminação cruzada Passos críticos têm de ser tomadas medidas para minimizar a contaminação cruzada e a ocorrência de falsos positivos devido a formação de novo de produtos resistentes a protease. </p&gt; <ol><li> Use um conjunto dedicado de instrumentos de dissecação (fórceps ou seja, pinças, tesouras) para coleta de amostras para cada estirpe príon. </li><li> Antes homogeneizando cérebro não infectados a serem utilizados como substrato PMCA, limpe as pipetas com lixívia a 1%. Mergulhe o rack sonicador do tubo de PCR, homogeneizadores, tecidos e racks de armazenamento de tubos de PCR com água sanitária a 1% por 10 minutos e enxaguar com água destilada. </li><li> Cobrir a área de trabalho com um Soaker Lab fresco Versi-Dry cada vez que uma nova amostra deve ser homogeneizada, numa experiência PMCA novo é para ser preparado, ou quando entre alíquotas sPMCA rodadas. </li><li> Use luvas novas a cada vez novas amostras são manipulados (especialmente quando a transferência de alíquotas entre as rodadas sPMCA). </li><li> Use rajadas curtas de sonicação para cada ciclo PMCA. Ciclos de 5 segundos de sonicação combinado com 10 min de incubação é suficiente para amplificar os priões, sem gerar de novo PrP Sc 1,20,21,23,24. Como outros laboratórios têm demonstrado, aumentando atempo de sonicação, o aumento da amplitude de sonicação, e estendendo-se o número de ciclos de PMCA aumenta a probabilidade de para PrP Sc novo de formação 2. </li></ol>

<ol><li>Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strain-encoded+relationship+between+PrP+replication%2C+stability+and+processing+in+neurons+is+predictive+of+the+incubation+period+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease.</a> PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).</li>
<li>Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+infectious+prions+in+vitro+produces+a+new+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype.</a> PLoS Pathog. 5, e1000421(2009).</li>
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<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+distribution+of+transmissible+mink+encephalopathy+virus+in+mink+inoculated+subcutaneously%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously.</a> J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).</li>
<li>Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+of+protease-resistant+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation of protease-resistant prion protein.</a> Nature. 370, 471-474 (1994).</li>
<li>Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-species+amplification+of+PrP%28CWD%29+and+correlation+with+rigid+loop+170N%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N.</a> Virology. 387, 3235-3240 (2009).</li>
<li>Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of scrapie prions.</a> J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).</li>
<li>Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protease-resistant+cervid+prion+protein+in+water+from+a+CWD-endemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area.</a> Prion. 3, 171-183 (2009).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216, 136-144 (1982).</li>
<li>Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+pathological+prion+protein+by+cyclic+amplification+of+protein+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding.</a> Nature. 411, 810-813 (2001).</li>
<li>Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+treatment+of+soil-bound+prions+effectively+inhibits+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).</li>
<li>Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+efficiency+of+soil-bound+prions+varies+with+soil+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Schutt, C. R., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+interference+with+multiple+prion+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Prion interference with multiple prion isolates.</a> Prion. 2, 61-63 (2008).</li>
<li>Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infecting+prion+strains+compete+for+a+limiting+cellular+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource.</a> Journal of. 84, 5706-5714 (2010).</li>
<li>Shikiya, R. A., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+high+titer+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of high titer prions.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genuine+prion+infectivity+by+serial+PMCA%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+microbiology%22%5BJournal%5D)">Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA.</a> Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Desafios da amplificação príons infecciosos são os longos períodos de incubação e as despesas de experimentos in vivo. A técnica PMCA é um meio rentável para ampliar agentes príon infeccioso. Vários laboratórios confirmaram a capacidade de amplificar PMCA com precisão as estirpes de priões in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24. Doenças de priões, pode ser transmitida entre as espécies. Bessen e Marsh efetivamente inoculados hamsters com encefalopatia transmissíve...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / Equipamento </td><td> Fabricante </td><td> Gato. Número </td></tr><tr><td> Misonix 3000 </td><td> Misonix </td><td> S-3000 </td></tr><tr><td> Misonix 4000 </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td></tr><tr><td> Tenbroeck Grinder Tissue </td><td> Kontes </td><td> 885000-0007 </td></tr><tr><td> Neslab Bath EX-7 Água </td><td> Thermo Electron </td><td> Neslab EX-7 </td></tr><tr><td> Tubo 0,2 ml Tiras de PCR </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0451 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T9284-100ML </td></tr><tr><td> Inibidor de Protease Completo </td><td> Roche </td><td> 11 697 498 001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> JT Baker </td><td> 4040-00 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Mallinckrodt Baker Mediatech </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Versi-Dry Soakers Lab </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 206 28 </td></tr><tr><td> Aquecedor Repti Therm </td><td> Zoo Med Laboratories, Inc. </td><td> RH-4 </td></tr></tbody></table>

proteína amplificação cíclica misfolding de príons

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Os príons são os agentes infecciosos que causam a encefalopatia espongiforme inevitavelmente fatal transmissível (EET) em animais e seres humanos 9,18. A proteína de prião tem duas isoformas distintas, a não infecciosa da proteína codificada hospedeira (PrP C) e a proteína infecciosa (PrP Sc), uma isoforma anormal de dobrado PrP C 8. Um dos desafios de trabalhar com agentes prião é o longo período de incubação antes do desenvolvimento de sinais clínicos após a inoculação de acolhimento 13. Isto tradicionalmente, imposto estudos bioensaio longas e caras animais. Além disso, as propriedades bioquímicas e biofísicas da PrP Sc ainda são pouco caracterizados devido à sua conformação invulgar e estados de agregação. PrPSc pode semear a conversão da PrP C e PrP Sc in vitro 14. PMCA é uma técnica in vitro, em que toma advantage desta capacidade utilizando ciclos de sonicação e a incubação para a produção de grandes quantidades de PrP Sc, a uma taxa acelerada, a partir de um sistema contendo quantidades em excesso de PrP C e pequenas quantidades de sementes a PrP Sc 19. Esta técnica provou ser eficaz para recapitular a especificidade de espécie e estirpe de PrP Sc conversão da PrP C, para emular interferência estirpe do prião, e para amplificar os níveis muito baixos de PrP Sc em tecidos infectados, fluidos e amostras ambientais 6,7,16, 23. Este trabalho detalha o protocolo PMCA, incluindo recomendações para minimizar a contaminação, gerando resultados consistentes, e quantificar esses resultados. Também discutimos várias aplicações PMCA, incluindo a geração e caracterização de cepas de príon infeccioso, interferência tensão prião, e na detecção de príons no ambiente.

Proteína de amplificação cíclica misfolding (PMCA) é usado para amplificar a PrP Sc in vitro 7, 12, 14, 19, 24. Uma bem sucedida PrP Sc amplificação é mostrado por um aumento na intensidade da banda em Western blots da proteína do prião PK-resistente (migrando entre 19 e 30 kDa para as estirpes derivadas do hamster prion), como mostrado na Figura 3. O aumento da intensidade da banda após a sua PMCA indica a amplificação do material resistente ao PK PrPSc.</...

Proteína de amplificação cíclica misfolding (PMCA) é um ensaio in vitro em para o estudo da conversão de prião e as barreiras de tensão e espécies. Também pode ser utilizado como um ensaio de detecção de prião.

Proteína amplificação cíclica misfolding de príons

Prions são agentes infecciosos que causam a encefalopatia espongiforme transmissível (EET), inevitavelmente fatal, em animais e humanos9,18. A proteína priônica ...

O objetivo deste procedimento é amplificar com sucesso cepas PreOn adaptadas a hamster in vitro. Isso é realizado primeiramente homogeneizando cérebro de hamster não infectado para ser usado como substrato, e então preparando o tecido infectado para ser usado como semente. O segundo passo é misturar o substrato e a semente em tubos de PCR, e em seguida realizar a amplificação cíclica de desdobramento proteico, ou PMCA, por ciclos de sonicação e incubação.Em seguida, o material amplificado é diluído com substrato fresco e amplificado serialmente in vitro, e então realiza-se a PMCA. Por fim, as amostras são digeridas com proteinase K e analisadas por western blot. Em última instância, o aumento na intensidade da banda no western blot pode ser utilizado para determinar a amplificação in vitro da cepa priônica.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais para a área de PreOn, como quais são os cofatores importantes envolvidos na amplificação de PreOn? Geralmente, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades com detalhes pequenos, mas importantes, relacionados ao procedimento, bem como em evitar a contaminação cruzada de amostras. Antes da homogeneização, limpe as pipetas com hipoclorito a 1%, sature com hipoclorito o suporte de tubos PCR, os homogeneizadores de tecidos e os suportes de armazenamento de tubos PCR.Após 10 minutos, enxágue cada peça de equipamento completamente com água destilada e, em seguida, cubra a área de trabalho com um novo absorvente Verly dry lab. Agora, utilize um homogeneizador de tecidos de 10 buris e tampão de conversão recém-preparado e gelado para homogeneizar um cérebro de hamster não infectado até obter uma solução de 10% peso por volume. Para usos com a solução substrato PMCA, coloque o homogenato em tubos cônicos de 15 mililitros e clarifique a solução homogeneizada por centrifugação a 500 vezes G durante 30 segundos.Em seguida, tomando cuidado para evitar a alíquota do grande pellet, transfira o sobrenadante resultante para tubos microcentrífuga de 1,5 mililitro. Para preparar a solução semente PMCA, homogeneíze o material infeccioso colhido em uma solução de 10% peso por volume conforme demonstrado anteriormente, mas utilizando solução salina tamponada com fosfato de daros ou DPBS em vez do tampão de conversão, e então distribua a solução em tubos microcentrífuga de 0,6 mililitro. Antes de iniciar o procedimento de amplificação, cubra a área de trabalho com uma nova toalha de laboratório absorvente seca, adicione o substrato PMCA a uma tira de tubos PCR de paredes finas contendo 200 microlitros e dilua a semente PMCA nele numa proporção de um para 20, colocando um total de quatro réplicas em tubos marcados com vermelho.Coloque duas réplicas de uma alíquota de 15 microlitros de cada amostra em tubos PCR rotulados com cor azul para uso como controle não saturado a menos 80 graus Celsius. Coloque outras duas réplicas de uma alíquota de 15 microlitros de cada amostra em tubos PCR para serem armazenadas a 37 graus Celsius como um controle não saturado adicional. Em seguida, coloque os controles não saturados a menos 80 graus Celsius em um congelador a menos 80 graus Celsius e coloque os outros controles não saturados em uma incubadora a 37 graus Celsius pelo tempo da reação de PMCA.Agora, inicie a primeira rodada de amplificação PMCA colocando a tira de tubos PCR contendo os 70 microlitros restantes de cada amostra em um sonicador conectado a um banho de água recirculante ajustado a uma temperatura constante de 37 graus Celsius. Um tubo PCR contendo apenas substrato PMCA pode ser incluído como controle simulado para verificar contaminação cruzada. Preencha no máximo 30% do recipiente do sonicador distribuindo os tubos PCR por todo o chifre da microplaca. Mantenha pelo menos uma fileira de espaço vazio entre as tiras de tubos PCR e conecte não mais do que quatro tubos por tira.A amplificação de P-R-P-S-C varia ao longo do chifre da microplaca. A melhor eficiência de amplificação de P-R-P-S-C é obtida dentro de um raio de cinco centímetros a partir do centro do chifre da microplaca. Uma rodada de PMCA consiste em 144 ciclos, com cinco segundos de sonicação e 10 minutos de incubação por ciclo, durante aproximadamente 24 horas por rodada de PMCA, enquanto, ao ajustar, regula-se a amplitude para obter uma potência de saída variando entre 155 e 170 watts.Coloque uma almofada de aquecimento para aquário na tampa do banho ultrassônico para evitar a condensação de água, o que poderia levar à contaminação cruzada das amostras. Agite os tubos a cada cinco horas para evitar a condensação de água nas tampas abobadadas dos tubos de PCR após a conclusão da rodada. Remova a tira de tubos do ator e centrifugue as amostras.Em seguida, vorte as tubos suavemente, mantendo a solução longe da tampa para evitar contaminação ao abrir as tampas, minimizando ainda mais a contaminação ao abrir os tubos. Evite tocar na borda e coloque a tampa sobre um lenço Kim limpo. Depois, para a PMCA em série da cepa PreOn, transfira cinco microlitros da amostra sonificada para 95 microlitros de substrato PMCA fresco.Use luvas novas para cada amostra. Em seguida, retire dois alíquotas de 15 microlitros de cada uma das amostras sonicadas e armazene um alíquota a menos 80 graus Celsius e o outro a 37 graus Celsius. Para as soluções controle não submetidas ao PMCA da segunda rodada, submeta os resíduos a uma segunda rodada de PMCA conforme acabou de ser demonstrado.Esta etapa pode ser repetida quantas vezes forem desejadas. Um tubo de PCR contendo o substrato de PMCA do cérebro não infectado isoladamente pode ser incluído para verificar contaminação cruzada após a realização do número desejado de ciclos; misture cinco microlitros de proteinase K a 18 microgramas por mililitro com cinco microlitros da amostra sonicada, o controle a menos 80 graus Celsius e o controle a 37 graus Celsius em tubos de PCR separados e incube a amostra a 37 graus Celsius por uma hora.Em seguida, adicione 10 microlitros de tampão de carga para gel à amostra digerida e aqueça a solução em banho-maria fervente por 10 minutos. Após o resfriamento, carregue 10 microlitros da mistura de amostra com tampão de carga em um gel tipo Western block. Para determinar a quantidade de P-R-P-S-C amplificado, compare a quantidade da amostra digerida pela proteinase K no blot de Western com os controles não saturados ou com quantidades conhecidas de proteinase.K recombinante não digerido. P-R-P-C-P-M-C-A é usado para amplificar P-R-P-S-C in vitro. A amplificação bem-sucedida da proteína PreOn adaptada ao hamster, CWD do hamster e TME sonolento pode ser observada nesta análise western BLO, comparando-se as intensidades das bandas antes e depois da digestão com proteinase K por meio de PMCA. A análise western BLO mostra uma banda superior, intermediária e inferior, correspondentes à fração di, mono e glicosilada da proteína priónica, respectivamente. Algumas cepas de PreOn podem ser diferenciadas pela sua mobilidade eletroforética.Por exemplo, há uma diferença de migração de dois quilodaltons entre as cepas de CWD de hámster e de TME sonolento PreOn. Essa amplificação de alta fidelidade é observada pela migração eletroforética semelhante da cepa PreOn de CWD de hámster amplificada por PMCA em comparação com sua semente correspondente de CWD de hámster, bem como para a cepa de TME sonolento em comparação com sua semente de TME sonolento. Caso não ocorra contaminação cruzada ou formação de novo de P-R-P-S-C, as amostras de controle OFM de PMCA devem permanecer limpas após a digestão com proteinase K.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de limpar todos os equipamentos antes de usar uma nova amostra, evitando assim a contaminação cruzada.

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