Name: Proteína amplificação cíclica misfolding de príons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a técnica PMCA para amplificar cepas de príons de hamster in vitro usando sonicação e ciclos de incubação. Este método auxilia pesquisadores a estudar conversão de príons e barreiras de espécie.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Vesper Fe Marie Ramos para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 e G20RR024001) e do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (2R01 NS052609).

1. Preparando o Equipamento <ol><li> Usar um 3000 Misonix ou sonicador Misonix 4000 (Farmingdale, NY) ligado a um banho de Thermo Electron Neslab EX-7 água (Newington, NH) para manter uma temperatura constante de 37 ° C. Sonicar as amostras em 200 uL de paredes finas tiras de tubos PCR com tampas abobadadas obtidos a partir de Thermo Scientific (Waltham, MA). </li><li> A sonicador novo requer um &quot;break-in&quot; período de operação contínua 9. Uma quebra-in período de dois meses é composto por uma onda de ultra-sons de 40 seg e ciclos de 10 minutos de incubação com o nível de amplitude definida para 10. Deve-se observar a erosão ao longo da superfície da microplaca titânio corno (Figura 1, painel B). A circulação de água vai ficar turva branca, devido à erosão da microplaca de titânio chifre. Substituir essa água por dia. </li><li> A amplificação da PrP Sc irá variar ao longo da trompa de microplacas. A melhor eficiência de amplificação da PrP Sc pode ser obtida dentro deum raio de 5 cm a partir do centro do feixe de microplacas (Ver Figura 1, Painel C). </li><li> Uma rodada de PMCA consiste 144 ciclos. Cada ciclo é constituído por cinco segundos de sonicação e 10 minutos de incubação. Isso vai implicar cerca de 24 horas por rodada de PMCA. </li><li> A saída de energia de ultra-sons, exibido no painel de controle do sonicador, varia de acordo com o número de tubos de PCR presentes na prateleira do sonicador e a temperatura da água de circulação do banho de água. Certifique-se de que a água é equilibrado a 37 ° C, e não encha mais do que 30% de cremalheira do sonicador do tubo (Figura 1, painel C). Espalhe os tubos de PCR através do chifre microplaca. Ter pelo menos uma linha de espaço vazio entre as tiras de tubos de PCR e permitir não mais do que quatro tubos ligados entre si por tiras (Figura 1, painel C). </li><li> A força de sonicação é crítica para uma amplificação bem sucedida de prião estirpe. Enquanto sonicando, ajustar a amplitude de ter uma saída de potênciavariando entre 155 ~ 170 watts. Em nosso laboratório o nível de energia está definido para seis e sete para o 3000 Misonix e Misonix 4000, respectivamente. </li><li> Uso de água destilada em banho de água para evitar a acumulação manchas de água dura. Substituir este semanário água. Durante os ciclos de incubação e de sonicação, a condensação de água irá ocorrer no interior da tampa de chifre de microplacas. Para evitar a condensação, coloque um bloco de calor pequeno aquário para o topo da caixa do sonicador do invólucro, conforme mostrado na Figura 1, o painel A. </li></ol> 2. Preparação das amostras <ol><li> Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Creighton University Use Comissão e cumprir com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Antes de qualquer recolha de tecido, o animal deve ser anestesiado e transcardially perfundidos com fosfato arrefecido com gelo, com solução salina tamponada com EDTA 5 mM, pH 7,4, para remover o sangue do cérebro e evitar a inibição daPMCA reação por sangue 7. Coletar tecidos animais rapidamente, usando técnica asséptica e ter instrumentos de dissecação dedicados para cada cepa príon. Após a dissecação, colocar o tecido em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, flash congelá-lo em gelo seco e armazená-lo a -80 ° C até à homogeneização. </li><li> Para preparar a solução de substrato PMCA (PrP C), homogeneizar o cérebro de hamster não infectadas (UN BH) para uma solução a 10% peso / volume (w / v) com tampão de gelo frio de conversão (ver parte 3), utilizando um triturador de tecidos Tenbroeck. Enquanto homogeneização, tome cuidado para não entrar ar dentro do moedor para evitar o excesso de espuma da solução. Clarificar a solução por centrifugação a 500 xg durante 30 seg e aliquota do sobrenadante em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Para preparar a semente PMCA (PrP Sc) de solução, homogeneizar um material infeccioso (gânglios cerebrais, baço, linfa, ou outros tecidos ou solo contaminado), a uma solução a 10% w / v de gelo frio water e alíquota da solução em tubos de microcentrífuga de 0,6 ml. Armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 3. Preparando buffer de conversão <ol><li> Pesar 0,5093 g de Triton X-100, num balão volumétrico de 50 ml (resultado é uma concentração final de 1% de Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH; Steinheim, Alemanha). </li><li> Adicionar um inibidor de protease completo Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). </li><li> Adicionar 0,0931 g de EDTA (isto irá resultar numa concentração final de 5 mM de EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc.; Phillipsburg, NJ). </li><li> Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1N. </li><li> Ajustar o volume a 50 ml com fosfato salino tamponado de Dulbecco (DPBS) (Mediatech Inc., Manassas, VA). </li><li> Filtrar a solução através de uma membrana de nitrocelulose de 0,45 um, com um aparelho de filtração sob vácuo. O buffer de conversão pode ser armazenado a 4 ° C durante não mais de um mês. </li></ol> 4. Amplificação de Cepas Prion Usando PMCA <ol><li>Dilui-se a semente para dentro do substrato PMCA PMCA numa proporção de 1:20 (mistura ou seja, 5 ul da semente PMCA e 95 ul do substrato PMCA) para um tubo de PCR. Remover e armazenar-se uma alíquota de 15 uL a -80 ° C para o controle unsonicated; este controlo unsonicated será utilizada para quantificar a PrP Sc amplificação através de proteinase K de digestão (PK), seguido por análise Western blot (WB). Um controlo adicional pode ser gerado unsonicated colocando uma aliquota 15 segundo uL a 37 ° C durante a duração da reacção PMCA. Um mínimo de três repetições é necessária para fins estatísticos. </li><li> Objecto do restante da amostra (70 ul) para um ciclo de PMCA como representado na Figura 1, Painel A. Agitação tubos cada hora 5 para evitar a condensação de água na tampa abaulada do tubo de PCR. </li><li> Tubos da amostra deve ser girado para baixo e gentilmente agitadas (tendo o cuidado de que a solução não vão para a tampa abobadada) antes de abrir depois de qualquer procedimento para garantir homogeneity e evitar a contaminação potencial. </li><li> Para PMCA serial (sPMCA) de estirpes de incubação curtos períodos (isto é, HY TME, HaCWD ou 263K), dilui-se o material sonicado a uma proporção de 1:20 em transferir 5 ul da amostra sonicada de uma rodada em 95 ul de uninfected fresco homogenato cerebral (Figura 2, painel B). </li><li> Para sPMCA de estirpes de incubação longos (por exemplo, período de DY TME, 139H, 22CH, 22AH, ou ME7H), dilui-se o material sonicado a uma proporção de 1:1, transferindo 50 ul da amostra sonicada da rodada em 50 ul de uninfected fresco homogenato cerebral (Figura 2, painel B). </li><li> Remover duas alíquotas de 15 ul da mistura previamente diluída sonicado (a partir de etapas de 4,4 ou 4,5), e armazenar uma delas a -80 ° C e o outro a 37 ° C (solução de controlo para unsonicated PMCA dois redondos). Submeter os restos de uma rodada PMCA dois. </li><li> Este procedimento pode ser repetido indefinidamente. Em nosso laboratório, nóster realizado até 15 rodadas PMCA, com as propriedades de tensão permaneçam inalteradas. </li><li> PK digerir as amostras. Para um típico WB, misturar 5 ul de PK pi 80 ug / ml a 5 de amostra (esta solução irá ter uma concentração final de PK de 40 ug / ml) e incubar a 37 ° C durante uma hora. Adicionar 10 ul de tampão de carga de gel. Ferver esta solução durante 10 min. Deixar a solução arrefecer e 10 ul carregar no gel. </li><li> Para calcular o sucesso da amplificação realizar uma análise de WB nas amostras PK-digeridas para estimar a quantidade de PrP Sc amplificado comparando-os com um ou outro, os controles unsonicated 20,21 Figura 2, painel C ou a quantidades conhecidas de PK-recombinante não digerido PrP. </li></ol> 5. Evitando a contaminação cruzada Passos críticos têm de ser tomadas medidas para minimizar a contaminação cruzada e a ocorrência de falsos positivos devido a formação de novo de produtos resistentes a protease. </p&gt; <ol><li> Use um conjunto dedicado de instrumentos de dissecação (fórceps ou seja, pinças, tesouras) para coleta de amostras para cada estirpe príon. </li><li> Antes homogeneizando cérebro não infectados a serem utilizados como substrato PMCA, limpe as pipetas com lixívia a 1%. Mergulhe o rack sonicador do tubo de PCR, homogeneizadores, tecidos e racks de armazenamento de tubos de PCR com água sanitária a 1% por 10 minutos e enxaguar com água destilada. </li><li> Cobrir a área de trabalho com um Soaker Lab fresco Versi-Dry cada vez que uma nova amostra deve ser homogeneizada, numa experiência PMCA novo é para ser preparado, ou quando entre alíquotas sPMCA rodadas. </li><li> Use luvas novas a cada vez novas amostras são manipulados (especialmente quando a transferência de alíquotas entre as rodadas sPMCA). </li><li> Use rajadas curtas de sonicação para cada ciclo PMCA. Ciclos de 5 segundos de sonicação combinado com 10 min de incubação é suficiente para amplificar os priões, sem gerar de novo PrP Sc 1,20,21,23,24. Como outros laboratórios têm demonstrado, aumentando atempo de sonicação, o aumento da amplitude de sonicação, e estendendo-se o número de ciclos de PMCA aumenta a probabilidade de para PrP Sc novo de formação 2. </li></ol>

<ol><li>Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strain-encoded+relationship+between+PrP+replication%2C+stability+and+processing+in+neurons+is+predictive+of+the+incubation+period+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease.</a> PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).</li>
<li>Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+infectious+prions+in+vitro+produces+a+new+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype.</a> PLoS Pathog. 5, e1000421(2009).</li>
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<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+PrP+properties+suggest+the+molecular+basis+of+strain+variation+in+transmissible+mink+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy.</a> J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+biologically+distinct+strains+of+transmissible+mink+encephalopathy+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters.</a> J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).</li>
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<li>Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+high+fidelity+prion+amplification+within+and+across+prion+species+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers.</a> PLoS Pathog. 4, e1000139(2008).</li>
<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+distribution+of+transmissible+mink+encephalopathy+virus+in+mink+inoculated+subcutaneously%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously.</a> J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).</li>
<li>Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+of+protease-resistant+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation of protease-resistant prion protein.</a> Nature. 370, 471-474 (1994).</li>
<li>Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-species+amplification+of+PrP%28CWD%29+and+correlation+with+rigid+loop+170N%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N.</a> Virology. 387, 3235-3240 (2009).</li>
<li>Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of scrapie prions.</a> J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).</li>
<li>Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protease-resistant+cervid+prion+protein+in+water+from+a+CWD-endemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area.</a> Prion. 3, 171-183 (2009).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216, 136-144 (1982).</li>
<li>Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+pathological+prion+protein+by+cyclic+amplification+of+protein+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding.</a> Nature. 411, 810-813 (2001).</li>
<li>Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+treatment+of+soil-bound+prions+effectively+inhibits+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).</li>
<li>Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+efficiency+of+soil-bound+prions+varies+with+soil+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Schutt, C. R., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+interference+with+multiple+prion+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Prion interference with multiple prion isolates.</a> Prion. 2, 61-63 (2008).</li>
<li>Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infecting+prion+strains+compete+for+a+limiting+cellular+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource.</a> Journal of. 84, 5706-5714 (2010).</li>
<li>Shikiya, R. A., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+high+titer+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of high titer prions.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genuine+prion+infectivity+by+serial+PMCA%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+microbiology%22%5BJournal%5D)">Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA.</a> Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Desafios da amplificação príons infecciosos são os longos períodos de incubação e as despesas de experimentos in vivo. A técnica PMCA é um meio rentável para ampliar agentes príon infeccioso. Vários laboratórios confirmaram a capacidade de amplificar PMCA com precisão as estirpes de priões in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24. Doenças de priões, pode ser transmitida entre as espécies. Bessen e Marsh efetivamente inoculados hamsters com encefalopatia transmissíve...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / Equipamento </td><td> Fabricante </td><td> Gato. Número </td></tr><tr><td> Misonix 3000 </td><td> Misonix </td><td> S-3000 </td></tr><tr><td> Misonix 4000 </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td></tr><tr><td> Tenbroeck Grinder Tissue </td><td> Kontes </td><td> 885000-0007 </td></tr><tr><td> Neslab Bath EX-7 Água </td><td> Thermo Electron </td><td> Neslab EX-7 </td></tr><tr><td> Tubo 0,2 ml Tiras de PCR </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0451 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T9284-100ML </td></tr><tr><td> Inibidor de Protease Completo </td><td> Roche </td><td> 11 697 498 001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> JT Baker </td><td> 4040-00 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Mallinckrodt Baker Mediatech </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Versi-Dry Soakers Lab </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 206 28 </td></tr><tr><td> Aquecedor Repti Therm </td><td> Zoo Med Laboratories, Inc. </td><td> RH-4 </td></tr></tbody></table>

proteína amplificação cíclica misfolding de príons

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Os príons são os agentes infecciosos que causam a encefalopatia espongiforme inevitavelmente fatal transmissível (EET) em animais e seres humanos 9,18. A proteína de prião tem duas isoformas distintas, a não infecciosa da proteína codificada hospedeira (PrP C) e a proteína infecciosa (PrP Sc), uma isoforma anormal de dobrado PrP C 8. Um dos desafios de trabalhar com agentes prião é o longo período de incubação antes do desenvolvimento de sinais clínicos após a inoculação de acolhimento 13. Isto tradicionalmente, imposto estudos bioensaio longas e caras animais. Além disso, as propriedades bioquímicas e biofísicas da PrP Sc ainda são pouco caracterizados devido à sua conformação invulgar e estados de agregação. PrPSc pode semear a conversão da PrP C e PrP Sc in vitro 14. PMCA é uma técnica in vitro, em que toma advantage desta capacidade utilizando ciclos de sonicação e a incubação para a produção de grandes quantidades de PrP Sc, a uma taxa acelerada, a partir de um sistema contendo quantidades em excesso de PrP C e pequenas quantidades de sementes a PrP Sc 19. Esta técnica provou ser eficaz para recapitular a especificidade de espécie e estirpe de PrP Sc conversão da PrP C, para emular interferência estirpe do prião, e para amplificar os níveis muito baixos de PrP Sc em tecidos infectados, fluidos e amostras ambientais 6,7,16, 23. Este trabalho detalha o protocolo PMCA, incluindo recomendações para minimizar a contaminação, gerando resultados consistentes, e quantificar esses resultados. Também discutimos várias aplicações PMCA, incluindo a geração e caracterização de cepas de príon infeccioso, interferência tensão prião, e na detecção de príons no ambiente.

Proteína de amplificação cíclica misfolding (PMCA) é usado para amplificar a PrP Sc in vitro 7, 12, 14, 19, 24. Uma bem sucedida PrP Sc amplificação é mostrado por um aumento na intensidade da banda em Western blots da proteína do prião PK-resistente (migrando entre 19 e 30 kDa para as estirpes derivadas do hamster prion), como mostrado na Figura 3. O aumento da intensidade da banda após a sua PMCA indica a amplificação do material resistente ao PK PrPSc.</...

Proteína de amplificação cíclica misfolding (PMCA) é um ensaio in vitro em para o estudo da conversão de prião e as barreiras de tensão e espécies. Também pode ser utilizado como um ensaio de detecção de prião.

Proteína amplificação cíclica misfolding de príons

Prions são agentes infecciosos que causam a encefalopatia espongiforme transmissível (EET), inevitavelmente fatal, em animais e humanos9,18. A proteína priônica ...

O objetivo deste procedimento é amplificar com sucesso cepas PreOn adaptadas a hamster in vitro. Isso é realizado primeiramente homogeneizando cérebro de hamster não infectado para ser usado como substrato, e então preparando o tecido infectado para ser usado como semente. O segundo passo é misturar o substrato e a semente em tubos de PCR, e em seguida realizar a amplificação cíclica de desdobramento proteico, ou PMCA, por ciclos de sonicação e incubação.Em seguida, o material amplificado é diluído com substrato fresco e amplificado serialmente in vitro, e então realiza-se a PMCA. Por fim, as amostras são digeridas com proteinase K e analisadas por western blot. Em última instância, o aumento na intensidade da banda no western blot pode ser utilizado para determinar a amplificação in vitro da cepa priônica.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais para a área de PreOn, como quais são os cofatores importantes envolvidos na amplificação de PreOn? Geralmente, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades com detalhes pequenos, mas importantes, relacionados ao procedimento, bem como em evitar a contaminação cruzada de amostras. Antes da homogeneização, limpe as pip

protein-misfolding-cyclic-amplification-of-prions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

SDD-AGE é uma técnica útil para a detecção e caracterização de amilóide como polímeros nas células. Aqui nós demonstramos uma adaptação que torna esta técnica passível de aplicações em larga escala.

Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a purificação de altamente ativa Hsp104, a AAA hexamérica + proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP a desagregação de proteína. Este esquema explora uma construção His6 marcadas para a purificação de...

Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

Incubar com uma enzima proteolítica para digerir os príons normais, deixando intactos os agregados resistentes.

Detecção de agregados de proteína príon mal dobrados em tecido cerebral de camundongo usando Western Blotting

Este vídeo descreve um ensaio de degradação para proteínas mal dobradas usando tratamento com cicloheximida junto com fracionamento de detergente. Este método ajuda a estudar a dinâmica de proteínas mal dobradas e a descobrir os mecanismos aprofundados de renovação de proteínas.

Ensaio de degradação de proteínas propensas a dobramento incorreto: uma técnica para monitorar a degradação de proteínas mal dobradas usando tratamento com cicloheximida e fracionamento de detergente

A propagação de agregados proteicos semelhante ao príon surgiu recentemente como implicada em muitas doenças neurodegenerativas. O objetivo deste protocolo é descrever como usar o nematóide C. elegans como um sistema modelo para monitorar a disseminação de proteínas e investigar fenômenos semelhantes a príons.

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em&gt; C. elegans</em

Este relatório descreve protocolos para medir as taxas de degradação de proteínas mal dobradas por ensaios baseados em western blot ou fluorescência. Os métodos podem ser aplicados à análise de outras proteínas mal dobradas e para triagem de alto rendimento.

Os ensaios para a degradação de proteínas em células deformadas

Este protocolo descreve uma metodologia de alta produtividade para a tela funcionalmente para herança à base de proteínas no S. cerevisiae.

Elevado-throughput Screening para herança à base de proteínas no S. cerevisiae

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever uma técnica de amplificação de prião simples, rápido e eficiente, o método de conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC).

Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

Acumular evidências suporta a ideia que agregados de proteínas patogênicas associam com doenças neurodegenerativas espalhados entre as células com o prião-como propriedades. Aqui, descrevemos um método que permite a visualização de propagação de célula para célula de príon como agregados no organismo modelo, Drosophila melanogaster.

Monitoramento de transmissão de celular para celular da proteína príon como agregados em Drosophila Melanogaster.

Aqui usamos a eletroforese em gel de agarose semi desnaturação bidimensional para confirmar a presença de amiloide-como fibras de tamanho heterogêneo e excluir a possibilidade de que a heterogeneidade de tamanho é devido à dissociação das fibras de amiloides durante o gel processo em execução.

Utilização de eletroforese em Gel de Agarose detergente semi desnaturação Dimensional dois para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras de amiloides ou Amyloid-como

Aprenda a técnica PMCA para amplificar cepas de príons de hamster in vitro usando sonicação e ciclos de incubação. Este método auxilia pesquisadores a estudar conversão de príons e barreiras de espécie.

Proteína amplificação cíclica misfolding de príons

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