Name: Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:29:01.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Aprenda a técnica de eletroporação in ovo em embriões de galinha estágio HH 10 para manipulação genética do tubo neural. Este método permite estudar funções gênicas no desenvolvimento do sistema nervoso central.

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Manipulação de ovos <ol><li> Os ovos podem ser conservados a 13 ° C por até uma semana antes da incubação, sem perda significativa de viabilidade (um refrigerador do vinho pequeno é ideal para esta finalidade). </li><li> Antes da incubação, ovos para permitir que a temperatura ambiente, em seguida, coloque em uma galinha umidificado incubadora definido para 37,8 ° C (100 ° F). </li><li> Nós geralmente electroporate embriões aproximadamente 48 horas depois do início de incubação, quando o embrião atingiu Hamburger e Hamilton estágio 10. </li><li> Tempo de incubação pode variar de acordo com Hamburger desejado e estágio Hamilton. Temperatura é crítica e desvio da temperatura de incubação ideal irá alterar o tempo de incubação e viabilidade do embrião diminuir. </li><li> Durante a incubação, os ovos devem ser mantidos em seus lados para que o embrião vai ser posicionadas corretamente, de eletroporação. O embrião vai flutuar em cima da gema e é útil para marcar a parte superior do ovo com um lápis antes de janelas para que você saiba onde cortar. </li></ol> Preparação <ol><li> Quente Leibovitz L-15 media a 37 ° C. Puxe capilares de vidro em agulhas. Eletrodos posição e micromanipulador e conectar eletrodos ao gerador de pulsos. </li></ol> Windowing <ol><li> Usando uma seringa com agulha grande furo, furar a casca na extremidade pequena do ovo. </li><li> Apontando a agulha cuidadosamente para baixo para evitar a interrupção da gema, remover cerca de 5 ml de albumina. </li><li> Sele o orifício com um pequeno pedaço de fita. </li><li> Cobrir a parte superior do ovo com outro pedaço de fita adesiva (cerca de 4x4 cm). </li><li> Com uma tesoura curva, e tomando cuidado para não perturbar o embrião, cortar um buraco grande o suficiente para fornecer uma janela na qual trabalho. </li></ol> Opcional: Para visualizar o tubo neural, injectar a solução de tinta com agulha de calibre 26 debaixo do embrião (inserir a agulha sob o embrião de fora do anel de sangue). Tinta da Índia devem ser diluídas 1:5 com Hanks ou comparáveis ​​solução estéril tamponada. Injeção e Eletroporação <ol><li> Quebre a ponta capilar para diâmetro desejado usando uma pinça </li><li> Usando a pipeta na boca, coloque o capilar com plasmídeo / Fast corante verde. </li><li> Posição do embrião com a cabeça em direção a você e inserir a agulha no tubo neural em um ângulo raso. </li><li> Injetar a solução de plasmídeo para o lúmen do tubo neural até dye preenche todo o espaço. </li></ol> Nota: Tenha cuidado para não ter maiores ponta, em seguida, diâmetro do tubo neural. Em geral, você será capaz de dizer se o tamanho da ponta ideal tem sido alcançado por quão fácil ou difícil é para puxar líquido no capilar. Se houver resistência extrema, a abertura é provavelmente muito pequena ea ponta deve ser quebrado novamente mais acima. Se houver pouca ou nenhuma resistência, a abertura é muito grande e uma nova agulha deve ser usado. <ol><li> Coloque 1-2 gotas de estéril L-15 media sobre o embrião. </li><li> Imediatamente colocar os eletrodos em ambos os lados do embrião, em paralelo com o tubo neural, e pulso 5 vezes em 24/10 volts para 50 mseconds em intervalos de 1 segundo. Você vai ver as bolhas perto dos eletrodos se funcionou corretamente. </li><li> Remova cuidadosamente eletrodos, coloque 5 gotas de L-15 em cima dos embriões e selar o ovo com fita adesiva. Certifique-se que o ovo é bem fechados, como secagem é um dos principais contribuintes para a perda de embrião após eletroporação. </li><li> Coloque os ovos de volta para a incubadora, lado da janela para cima, e incubar até chegarem desejado H &amp; H estágio. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Este protocolo fornece um guia passo a passo para eletroporação do tubo neural de embriões de galinha HH10. Além de mostrar a técnica, as diretrizes para o armazenamento e manuseio de ovos também é fornecido. Esta técnica tem uma ampla gama de aplicações para análise genética e do custo baixo e facilidade de experimentos torna viável para muitos laboratórios.

<table><tbody><tr><td>Incubadora para ovos de galinha</td><td></td><td></td><td>umidificada, ajustada para 37,80&amp;#x00B0;C (100F). </td></tr><tr><td>Gerador de pulsos </td><td>Genetronics</td><td>BTX T820</td><td>Gerador de onda quadrada ou equivalente</td></tr><tr><td>Eletrodos</td><td></td><td></td><td>nossos eletrodos foram feitos com fio de platina de 0,25 mm de diâmetro, com 5 mm de comprimento e espaçados 1 mm entre si</td></tr><tr><td>Cabos de conexão</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lupa estereoscópica </td><td></td><td></td><td>com grande distância de trabalho</td></tr><tr><td>Capilares de vidro </td><td></td><td></td><td>e puxador de capilares ou agulhas de vidro comerciais</td></tr><tr><td>Meio Leibovitz&amp;rsquo;s L-15</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovos de galinha</td><td></td><td></td><td>fertilizados</td></tr><tr><td>Tesoura curva</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha de grande calibre </td><td></td><td></td><td>16-18G</td></tr><tr><td>Pipeta de boca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tinta da Índia </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina/siringa </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo de DNA </td><td></td><td></td><td>&amp;#8805; 1&amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;l em TE estéril ou PBS 1X contendo 0,05% de corante Fast Green</td></tr></tbody></table>

em electroporations ovo de estágio hh 10 embriões de galinha

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Grande tamanho e desenvolvimento externo do embrião de galinha há muito tempo tornou uma ferramenta valiosa no estudo da biologia do desenvolvimento. Com o advento da técnicas da biologia molecular, a garota tornou-se um sistema útil para se estudar a regulação do gene e função. Por electroporating construções de DNA ou RNA no embrião de galinha em desenvolvimento, os genes podem ser expressos ou derrubado a fim de analisar in vivo a função do gene. Da mesma forma, constrói repórter pode ser usado para o mapeamento de destino ou para analisar elementos gene putativo de regulamentação. Comparação com experiências similares em mouse, eletroporação pintinho tem a vantagem de ser rápido, fácil e barato. Este vídeo demonstra como fazer primeiro uma janela na casca de ovo para manipular o embrião. Em seguida, o embrião é visualizado com uma solução diluída de nanquim injetado abaixo do embrião. Uma agulha de vidro e pipetas são utilizadas para injetar DNA e corante verde rápido dentro do tubo neural em desenvolvimento, em seguida, são colocados eletrodos de platina paralelo ao embrião e curta pulsos elétricos são administrados com um gerador de pulsos. Finalmente, o ovo é selada com fita adesiva e colocados de volta para uma incubadora para o desenvolvimento. Além disso, o vídeo mostra a estocagem e manuseio apropriado e discute as possíveis causas do embrião eletroporação seguintes perda.

Pinto no ovo eletroporação é uma técnica que permite a manipulação genética do embrião aviária. Aplicações mais comuns desta técnica incluem a análise funcional de genes e elementos enhancer putativa. Este vídeo demonstra eletroporação do tubo neural em HH 10 embriões de galinha. Técnica de injeção e manuseio adequado de ovo são discutidos.

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O pintinho é um bom sistema modelo porque os embriões são muito passíveis de manipulação e seu grande tamanho também os torna muito mais fáceis de manipular do que outros embriões. Experimentos de eletroporação em pintinhos também permitem a triagem de um grande número de genes em um curto período de tempo. Olá, sou Marissa Blank.Sou estudante de pós-graduação no laboratório de Kathy Millon, do Departamento de Genética Humana da Universidade de Chicago. Hoje vou falar sobre como realizar a eletroporação em embriões de galinha e em ovo, e vamos eletroporar embriões de galinha no estágio 10 de Hamburger e Hamilton, o que corresponde a cerca de dois dias de desenvolvimento embrionário na galinha. O procedimento é realizado rotineiramente em nosso laboratório, e normalmente estudamos o efeito da superexpressão ou da inibição de genes na medula espinhal, pois estamos interessados em genes envolvidos no desenvolvimento do sistema nervoso central.Então, a técnica que mostrarei a vocês hoje, a eletroporação in ovo, envolve várias etapas. A primeira etapa será a abertura de uma janela no ovo. A segunda etapa consistirá na injeção de DNA na luz do tubo neural.E o terceiro passo será usar um

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Biologia

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A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-eletroporação

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Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha

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Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

Aprenda a técnica de eletroporação in ovo em embriões de galinha estágio HH 10 para manipulação genética do tubo neural. Este método permite estudar funções gênicas no desenvolvimento do sistema nervoso central.

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

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