Name: Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:29:01.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Aprenda a técnica de eletroporação in ovo em embriões de galinha estágio HH 10 para manipulação genética do tubo neural. Este método permite estudar funções gênicas no desenvolvimento do sistema nervoso central.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Manipulação de ovos <ol><li> Os ovos podem ser conservados a 13 ° C por até uma semana antes da incubação, sem perda significativa de viabilidade (um refrigerador do vinho pequeno é ideal para esta finalidade). </li><li> Antes da incubação, ovos para permitir que a temperatura ambiente, em seguida, coloque em uma galinha umidificado incubadora definido para 37,8 ° C (100 ° F). </li><li> Nós geralmente electroporate embriões aproximadamente 48 horas depois do início de incubação, quando o embrião atingiu Hamburger e Hamilton estágio 10. </li><li> Tempo de incubação pode variar de acordo com Hamburger desejado e estágio Hamilton. Temperatura é crítica e desvio da temperatura de incubação ideal irá alterar o tempo de incubação e viabilidade do embrião diminuir. </li><li> Durante a incubação, os ovos devem ser mantidos em seus lados para que o embrião vai ser posicionadas corretamente, de eletroporação. O embrião vai flutuar em cima da gema e é útil para marcar a parte superior do ovo com um lápis antes de janelas para que você saiba onde cortar. </li></ol> Preparação <ol><li> Quente Leibovitz L-15 media a 37 ° C. Puxe capilares de vidro em agulhas. Eletrodos posição e micromanipulador e conectar eletrodos ao gerador de pulsos. </li></ol> Windowing <ol><li> Usando uma seringa com agulha grande furo, furar a casca na extremidade pequena do ovo. </li><li> Apontando a agulha cuidadosamente para baixo para evitar a interrupção da gema, remover cerca de 5 ml de albumina. </li><li> Sele o orifício com um pequeno pedaço de fita. </li><li> Cobrir a parte superior do ovo com outro pedaço de fita adesiva (cerca de 4x4 cm). </li><li> Com uma tesoura curva, e tomando cuidado para não perturbar o embrião, cortar um buraco grande o suficiente para fornecer uma janela na qual trabalho. </li></ol> Opcional: Para visualizar o tubo neural, injectar a solução de tinta com agulha de calibre 26 debaixo do embrião (inserir a agulha sob o embrião de fora do anel de sangue). Tinta da Índia devem ser diluídas 1:5 com Hanks ou comparáveis ​​solução estéril tamponada. Injeção e Eletroporação <ol><li> Quebre a ponta capilar para diâmetro desejado usando uma pinça </li><li> Usando a pipeta na boca, coloque o capilar com plasmídeo / Fast corante verde. </li><li> Posição do embrião com a cabeça em direção a você e inserir a agulha no tubo neural em um ângulo raso. </li><li> Injetar a solução de plasmídeo para o lúmen do tubo neural até dye preenche todo o espaço. </li></ol> Nota: Tenha cuidado para não ter maiores ponta, em seguida, diâmetro do tubo neural. Em geral, você será capaz de dizer se o tamanho da ponta ideal tem sido alcançado por quão fácil ou difícil é para puxar líquido no capilar. Se houver resistência extrema, a abertura é provavelmente muito pequena ea ponta deve ser quebrado novamente mais acima. Se houver pouca ou nenhuma resistência, a abertura é muito grande e uma nova agulha deve ser usado. <ol><li> Coloque 1-2 gotas de estéril L-15 media sobre o embrião. </li><li> Imediatamente colocar os eletrodos em ambos os lados do embrião, em paralelo com o tubo neural, e pulso 5 vezes em 24/10 volts para 50 mseconds em intervalos de 1 segundo. Você vai ver as bolhas perto dos eletrodos se funcionou corretamente. </li><li> Remova cuidadosamente eletrodos, coloque 5 gotas de L-15 em cima dos embriões e selar o ovo com fita adesiva. Certifique-se que o ovo é bem fechados, como secagem é um dos principais contribuintes para a perda de embrião após eletroporação. </li><li> Coloque os ovos de volta para a incubadora, lado da janela para cima, e incubar até chegarem desejado H &amp; H estágio. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Este protocolo fornece um guia passo a passo para eletroporação do tubo neural de embriões de galinha HH10. Além de mostrar a técnica, as diretrizes para o armazenamento e manuseio de ovos também é fornecido. Esta técnica tem uma ampla gama de aplicações para análise genética e do custo baixo e facilidade de experimentos torna viável para muitos laboratórios.

<table><tbody><tr><td>Incubadora para ovos de galinha</td><td></td><td></td><td>umidificada, ajustada para 37,80&amp;#x00B0;C (100F). </td></tr><tr><td>Gerador de pulsos </td><td>Genetronics</td><td>BTX T820</td><td>Gerador de onda quadrada ou equivalente</td></tr><tr><td>Eletrodos</td><td></td><td></td><td>nossos eletrodos foram feitos com fio de platina de 0,25 mm de diâmetro, com 5 mm de comprimento e espaçados 1 mm entre si</td></tr><tr><td>Cabos de conexão</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lupa estereoscópica </td><td></td><td></td><td>com grande distância de trabalho</td></tr><tr><td>Capilares de vidro </td><td></td><td></td><td>e puxador de capilares ou agulhas de vidro comerciais</td></tr><tr><td>Meio Leibovitz&amp;rsquo;s L-15</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovos de galinha</td><td></td><td></td><td>fertilizados</td></tr><tr><td>Tesoura curva</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha de grande calibre </td><td></td><td></td><td>16-18G</td></tr><tr><td>Pipeta de boca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tinta da Índia </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina/siringa </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo de DNA </td><td></td><td></td><td>&amp;#8805; 1&amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;l em TE estéril ou PBS 1X contendo 0,05% de corante Fast Green</td></tr></tbody></table>

em electroporations ovo de estágio hh 10 embriões de galinha

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Grande tamanho e desenvolvimento externo do embrião de galinha há muito tempo tornou uma ferramenta valiosa no estudo da biologia do desenvolvimento. Com o advento da técnicas da biologia molecular, a garota tornou-se um sistema útil para se estudar a regulação do gene e função. Por electroporating construções de DNA ou RNA no embrião de galinha em desenvolvimento, os genes podem ser expressos ou derrubado a fim de analisar in vivo a função do gene. Da mesma forma, constrói repórter pode ser usado para o mapeamento de destino ou para analisar elementos gene putativo de regulamentação. Comparação com experiências similares em mouse, eletroporação pintinho tem a vantagem de ser rápido, fácil e barato. Este vídeo demonstra como fazer primeiro uma janela na casca de ovo para manipular o embrião. Em seguida, o embrião é visualizado com uma solução diluída de nanquim injetado abaixo do embrião. Uma agulha de vidro e pipetas são utilizadas para injetar DNA e corante verde rápido dentro do tubo neural em desenvolvimento, em seguida, são colocados eletrodos de platina paralelo ao embrião e curta pulsos elétricos são administrados com um gerador de pulsos. Finalmente, o ovo é selada com fita adesiva e colocados de volta para uma incubadora para o desenvolvimento. Além disso, o vídeo mostra a estocagem e manuseio apropriado e discute as possíveis causas do embrião eletroporação seguintes perda.

Pinto no ovo eletroporação é uma técnica que permite a manipulação genética do embrião aviária. Aplicações mais comuns desta técnica incluem a análise funcional de genes e elementos enhancer putativa. Este vídeo demonstra eletroporação do tubo neural em HH 10 embriões de galinha. Técnica de injeção e manuseio adequado de ovo são discutidos.

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

O tamanho grande e o desenvolvimento externo do embrião de galinha tornaram-no, há muito tempo, uma ferramenta valiosa no estudo da biologia do desenvolvimento. Com o advento de...

O pintinho é um bom sistema modelo porque os embriões são muito passíveis de manipulação e seu grande tamanho também os torna muito mais fáceis de manipular do que outros embriões. Experimentos de eletroporação em pintinhos também permitem a triagem de um grande número de genes em um curto período de tempo. Olá, sou Marissa Blank.Sou estudante de pós-graduação no laboratório de Kathy Millon, do Departamento de Genética Humana da Universidade de Chicago. Hoje vou falar sobre como realizar a eletroporação em embriões de galinha e em ovo, e vamos eletroporar embriões de galinha no estágio 10 de Hamburger e Hamilton, o que corresponde a cerca de dois dias de desenvolvimento embrionário na galinha. O procedimento é realizado rotineiramente em nosso laboratório, e normalmente estudamos o efeito da superexpressão ou da inibição de genes na medula espinhal, pois estamos interessados em genes envolvidos no desenvolvimento do sistema nervoso central.Então, a técnica que mostrarei a vocês hoje, a eletroporação in ovo, envolve várias etapas. A primeira etapa será a abertura de uma janela no ovo. A segunda etapa consistirá na injeção de DNA na luz do tubo neural.E o terceiro passo será usar um

in-ovo-electroporations-of-hh-stage-10-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra como visualizar caminhos axonal de grupos geneticamente definido de neurônios na medula espinhal utilizando pinto...

Decifrando Pathways Axonal dos Grupos geneticamente definidos de neurônios no tubo Neural Utilizando Pintainho In ovo Eletroporação

O objetivo geral deste vídeo é mostrar como executar alvo injeção de retina...

Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário

Para avaliar a função e regulação de genes durante o desenvolvimento de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo, nós descrevemos um método que...

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Um método de transferência de genes em embriões de galinha em fases posteriores de incubação (com mais de Hamburger e Hamilton fase (HH) 22) é descrito. Este método supera as desvantagens...

Transferência de Embriões em Gene de frango por mais velhos<em&gt; Ovo ex</em&gt; Eletroporação

Um método através do qual a expressão do gene no tubo neural pode ser downregulated em um tipo de célula específico forma rastreável é descrito. Demonstramos...

Em Eletroporação ovo de miRNA-base de plasmídeos no Tubo Neural Desenvolvimento e Avaliação de Fenótipos por Dil Injeção em livro aberto Preparações

Como as redes neuronais são estabelecidas no cérebro embrionário é uma questão fundamental no desenvolvimento da neurobiologia. Aqui nós combinamos uma técnica de eletroporação com novas ferramentas genéticas, como Cre / Lox-plasmídeos e sistema de transposição de DNA PiggyBac mediada no hindbrain aviária para rotular interneurons dorsal e rastrear suas projeções axonais e metas sinápticas em diferentes estágios de desenvolvimento.

Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

O órgão auditivo medeia a audição. Aqui apresentamos um método de micro-eletroporação in ovo modificado otimizado para estudar a proliferação e diferenciação de células progenitoras auditivas no órgão auditivo de galinhas em desenvolvimento.

A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-eletroporação

Os neurônios auditivos de tronco encefálico de aves e mamíferos são especializados para codificação neural rápida, um processo fundamental para funções auditivas normais. Esses neurônios surgem de precursores distintos do antígeno cervical embrionário. Apresentamos técnicas que utilizam eletroporação para expressar genes no colo de embriões de frango para estudar a função genética durante o desenvolvimento auditivo.

Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha

Nós relatamos o electroporation do RNA do mensageiro (mRNA) como um método que permita a expressão rápida e eficiente de proteínas múltiplas no sistema do modelo do embrião de codorniz. Este método pode ser usado para cDNAs etiquetar pilhas e gravar seus movimentos in vivo pela microscopia do tempo-lapso logo após o electroporation.

Expressão rápida e eficiente de múltiplas proteínas em embriões aviários usando o mRNA Electroporation

Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios a partir de embriões midgastrula estágio Drosophila. Pontos de vista de culturas vivas mostram as células de 1 hora após o plaqueamento e neurônios diferenciados após 2 dias de crescimento em um meio de bicarbonato baseado definido. Os neurônios são eletricamente excitáveis ​​e formam conexões sinápticas.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

Aprenda a técnica de eletroporação in ovo em embriões de galinha estágio HH 10 para manipulação genética do tubo neural. Este método permite estudar funções gênicas no desenvolvimento do sistema nervoso central.

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

Explorar mais vídeos