Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado ¹⁵ Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar proteínas que interagem especificamente com uma determinada proteína-alvo em extratos celulares contendo proteínas solúveis e de membrana. Primeiro, obtenha a marcação metabólica completa das células de chlamydomonas com nitrogênio 14 e nitrogênio 15 e gere lisados celulares contendo e sem TP. Uma etapa opcional de reticulação ajuda a estabilizar as interações transitórias entre proteínas e proteínas. Em seguida, separe os lisados celulares em frações, proteínas insolúveis e de membrana enriquecidas a partir das quais a proteína alvo, seus parceiros de interação específicos.

Uma proteína de controle e proteínas contaminantes são imunoprecipitadas e aludidas. Agora, misture as proteínas imunoprecipitadas e digere triplamente e analise-as por LCMS em tandem. Os resultados distinguiram entre parceiros de interação verdadeiros e falsos, mostrando diferentes proporções de nitrogênio, 14 nitrogênio, 15 peptídeos para proteínas que interagem especificamente com a proteína alvo e nitrogênio igual.

14 rácios de azoto 15 peptídeos para a proteína-alvo, a proteína de controlo e as proteínas contaminantes. O método de escolha para a análise das interações proteína-proteína é imunoprecipitar a proteína de escolha diretamente com sua interação. Parceiros de extratos celulares onde ambos ocorrem em sua confirmação e concentrações nativas.

No entanto, ao fazer isso, também as proteínas contaminantes são precipitadas principalmente porque interagem com os anticorpos usados, pois os espectrômetros de massa modernos são extremamente sensíveis. Eles também identificarão inequivocamente as proteínas contaminantes e, portanto, é impossível distinguir a falha dos verdadeiros parceiros de interação. Este problema é superado pela técnica mostrada aqui, que se baseia na modulação da afinidade de imunoprecipitação de marcação metabólica de 15 N aqui mediada pelo estado A TP e espectrometria de massa quantitativa.

A técnica será mostrada por Stefan SCH Malinger, que é um estudante de doutorado sênior em meu laboratório. Depois de rotular as células por 10 gerações, transfira duas alíquotas de células de chlamydomonas marcadas com nitrogênio 14 e nitrogênio 15 para tubos 4G SA colhidos por centrifugação Resus, suspenda os pellets em dois mililitros de tampão de lise gelada e para transferir as suspensões para tubos Falcon de 15 mililitros, colete as células restantes com um mililitro adicional de tampão de lise cada para cada Eloqua. Adicione 50 microlitros de 25 x inibidor de protease e 12,5 microlitros de amostras de sonicado de cloreto de magnésio molar quatro vezes 20 segundos no gelo para ISIS de célula completa com 22ª quebras entre eles para resfriamento.

Prepare quatro almofadas de sacarose de seis mililitros em tubos de parede fina SW 41 TI. Coloque cuidadosamente todo o volume dos lisados celulares nas almofadas de sacarose. Equilibre com lise, tampão e centrífuga para separar os complexos de proteínas solúveis das membranas.

Transfira os complexos de proteínas solúveis do topo do gradiente para quatro tubos de falcão de 15 mililitros. Certifique-se de evitar a transferência de partes da almofada de sacarose. Em seguida, a cada amostra, adicione 10% Triton X 100 a uma concentração final de 0,5% Misture cuidadosamente e adicione tampão de lise a um volume total de sete mililitros.

Para página SDS e análises imunosanguíneas. Reserve 70 microlitros de cada extrato de célula solúvel em um tubo cônico fresco de 1,5 mililitro e adicione 70 microlitros de dois tampão de amostra XSDS. Em seguida, descarte as almofadas de sacarose dos tubos de parede fina SW 41 TI e adicione três mililitros de tampão de lise a cada pellet.

Adicione um mililitro de 10%tritton X 100 a uma concentração final de 2%Após dissolver cada pellet por sonicação, adicione tampão de lise a um volume total de cinco mililitros e centrifugue. Como antes, colha as frações superiores dos complexos de proteínas de membrana em tubos de falcão de 15 mililitros. Adicionar tampão de lise contendo 2% de tritton X 100 a um volume final de sete mililitros.

Use 70 microlitros dessas amostras para análise de sangue e página SDS. Primeiro equilibre a proteína acoplada a anticorpos. Um sero contas com duas lavagens de quatro mililitros de tampão de lise diluídas para oito mililitros e alíquota.

Um mililitro da suspensão para cada um dos oito tubos de falcão de 15 mililitros contendo complexos de proteínas solúveis ou de membrana de um TP completo e um TP empobrecido de nitrogênio 14 e nitrogênio 15 células marcadas incubam por duas horas a quatro graus Celsius em um rolo de tubo para precipitar complexos de proteínas pelotas as esferas por centrifugação, Descarte os sobrenadantes, deixando um pequeno volume de líquido em cima das esferas para evitar a contaminação das proteínas aderidas às paredes plásticas. Transfira as amostras para tubos cônicos frescos de 1,5 mililitro para coletar todas as contas restantes nos tubos de falcão. Adicione mais 0,8 mililitros de tampão de lise contendo 0,1% tritton a cada vórtice, centrifugue suavemente e transfira o tampão com grânulos residuais para os tubos einor Após várias etapas de lavagem, centrifugue amostras por 15 segundos a 16, 100 vezes G e quatro graus Celsius.

Remova os sobrenadantes da amostra primeiro com uma pipeta normal. Em seguida, remova completamente qualquer sobrenadante restante com a seringa Hamilton de 50 microlitros. Para cada amostra, adicione 100 microlitros de tampão de eluição recém-preparado e incube em um misturador térmico a 800 RPM centrifugue as amostras por 15 segundos a 16, 100 vezes G e 25 graus Celsius.

Agora transfira cada sobrenadante para um tubo novo usando uma seringa Hamilton limpa de 50 microlitros. Adicione também 50 microlitros de tampão de eluição ao processo de esferas, como nas amostras anteriores, e agrupe os respectivos elados. Lembre-se de reservar 30 microlitros de todas as amostras de EITs para a página SDS e análises imunosanguíneas.

Agora combine os precipitados iludidos de mais e menos nitrogênio tratado com TP 14 e nitrogênio 15 marcado com proteínas solúveis e de membrana. Em seguida, execute a alquilação de redução e a digestão inicial de alta ureia, conforme descrito no manuscrito anexo. Prossiga para um tríptico digerido em uma roda de rotação por pelo menos 16 horas.

A 37 graus Celsius. Pulverize os grânulos de tripsina com uma centrifugação de cinco minutos a 16, 100 vezes G e quatro graus Celsius. Transferir os sobrenadantes para tubos novos de dois mililitros.

Lave os tubos antigos com 50 microlitros de bicarbonato de amônio 20 milimolar, ácido acético a 0,5% e piscina com os primeiros sobrenadantes. Para preparar pontas caseiras C 18 para dessalinizar as amostras, corte dois discos do material emcor C 18 com uma agulha de seringa e insira-os em uma ponta de pipeta de 200 microlitros. Em seguida, faça furos nas tampas de quatro tubos einor de dois mililitros e insira as pontas pré-condicionando as pontas do estágio C 18 com 50 microlitros de solução B centrifugue por três minutos a 800 G e 25 graus Celsius.

Em seguida, equilibre as pontas do estágio C 18 com 100 microlitros de solução, uma centrífuga por três minutos a 800 G e 25 graus Celsius. Repita este passo de equilíbrio mais uma vez. Prossiga para carregar 100 microlitros dos sobrenadantes de amostra das digestão tríptica nas pontas do estágio C 18 centrifugue por três minutos a 800 G e 25 graus Celsius.

Repita o carregamento da coluna para aplicação completa dos sobrenadantes de amostra. Depois de lavar as pontas do estágio C 18, eluir os peptídeos trípticos em um tubo einor novo de 1,5 mililitro com 50 microlitros de solução B centrifugar por três minutos a 800 G e 25 graus Celsius. Repita a etapa eluciana uma vez e, em seguida, seque os peptídeos até a conclusão em um VAC reus rápido.

Suspender os peptídeos secos em 20 microlitros de solução A e incubar por pelo menos uma hora em gelo, interrompido por duas incubações de 15 minutos em uma centrífuga de banho de sonicado por 20 minutos a 16, 100 vezes G e quatro graus Celsius e aplicar Senna ao nano C-M-S-M-S HSP 70. Sabe-se que as proteínas de choque térmico interagem com cos chaperonas e substratos específicos apenas na ausência de um TP nesses extratos celulares marcados com nitrogênio 14 hs, P 70 B e CGE um estão quase exclusivamente localizados na fração solúvel independente do estado A TP. Em contraste, o CF one beta está localizado nas frações solúvel e enriquecida com membrana.

Como a sonicação corta parte do CF um beta da membrana localizada A TP Synthes, ela serve como controle de carga para ambas as frações. Quantidades semelhantes de H HSP 70 B foram precipitadas com os anticorpos anti HSP 70 B de extratos solúveis marcados com nitrogênio 14 e nitrogênio 15 independentes do estado A TP. Em contraste, baixos níveis de proteína HS P 70 B precipitados de frações de membrana com quantidades ligeiramente maiores originadas de frações de membrana depletadas de TP em comparação com frações repletas de TP como afinidade esperada de CGE E um para hs.

P 70 B é dependente do contexto. Nenhum CGE foi coprecipitado com HS P 70 B.In uma fração solúvel ou de membrana repleta de TP. As quantidades de proteína CGE one coprecipitada com HS P 70 B a partir de frações solúveis e depletadas de TP e frações de membrana depletadas de TP correlacionam-se quantitativamente com a quantidade de HSP 70 B. A interação de CGE one com HS P 70 B apenas no estado A DP também é observada na análise por espectrometria de massas.

Neste experimento, precipitados foram preparados para misturas de extratos marcados com nitrogênio 14 sem TP e nitrogênio, 15 extratos marcados contendo A TP. Enquanto as formas pesadas e leves marcadas do peptídeo HS P 70 B foram detectadas em intensidades iguais, apenas a forma leve marcada do peptídeo CGE um dos extratos empobrecidos de A TP foi detectada. Os mesmos peptídeos do precipitado anti HS P 70 D DB derivados de misturas de extratos de células solúveis marcados reciprocamente são mostrados aqui. Assim, apenas a forma fortemente marcada do peptídeo CGE um em extratos depletados de TP foi detectada, bem como os peptídeos HSP 70 B marcados leves e pesados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa impressão sobre como realizar um experimento de precipitação de país com preparação de amostras para análise de espectrometria de massa. Não se esqueça de que as contaminações com proteína humana, especialmente queratina, perturbarão suas medições de profilaxia no espectrômetro de massa e, portanto, precauções de segurança, como luvas, ambiente limpo e regiões de grau LCMS, são cruciais durante a realização deste procedimento.