Name: Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado 15 Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Aprenda a identificar interações proteína-proteína específicas usando marcação metabólica com 15N, imunoprecipitação e espectrometria de massa quantitativa em Chlamydomonas. Este método diferencia parceiros verdadeiros de contaminantes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos Olivier Vallon para o anti-soro contra CF1β. Este trabalho foi financiado pela Sociedade Max Planck e bolsas da Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) eo Bundesministerium für Bildung und Forschung (Forsys Biologia de Sistemas, GoFORSYS iniciativa do projeto).

<ol><li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+a+macromolecular+complex%3A+the+toolkit+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li>
<li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction%3A+mass+spectrometry-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li>
<li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitations+revisited%3A+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li>
<li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+%28QUICK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li>
<li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+%28SILAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li>
<li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li>
<li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li>
<li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones%3A+cellular+functions+and+molecular+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li>
<li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas%3A+two+isoforms+generated+by+differential+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li>
<li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li>
<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarris%2C+EH+%22The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%22">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use</a>. , Elsevier, Academic Press. San Diego, CA. (2008).</li>
<li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSQuant%2C+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li>
<li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li>
<li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Introduzimos recentemente duas melhorias para a abordagem rápida: um passo para a captura de reticulação transitórios interações proteína-proteína (Quick-X), e uma precipitação de controle para normalizar a eficiência de precipitação desiguais 6. Aqui apresentamos um protocolo contendo duas melhorias mais de RÁPIDO: primeiro, substituir SILAC 5 para 15 N marcação metabólica. As vantagens são que 15 N marcação metabólica é muito mais barato do que SILAC, se 15 N é fornecida como sal inorgânico simples. Além disso, com 15 N metabólica rotulagem QUICK pode ser aplicado a prototrófica organismos para todos os aminoácidos, como a maioria das plantas, fungos e bactérias. E, finalmente, a arginina-prolina interconversão inerente ao SILAC 5,6 não apresenta um problema para a quantificação de 15 N rotulado peptídeos. Exemplos de instrumentos adequados para a avaliação quantitativa da proteômica 15 N são dados 12 MSQUANT ou euOMIQS 13. Em segundo lugar, introduz-se a afinidade de modulação como um meio para reduzir especificamente a quantidade de proteínas que interagem com uma proteína alvo em uma amostra dada em relação a outro. As vantagens desta abordagem são que contorna a construção de mutantes de knockdown, que para alguns sistemas modelo são difíceis de gerar ou não pode ser gerada em tudo, no caso de proteínas-alvo essenciais. Além disso, evita-se interpretações causadas pela expressão diferencial de proteínas potencialmente ocorrer como uma resposta da célula a bater para baixo uma proteína alvo: se outras proteínas são reprimidos bem e reagem de forma cruzada com o anti-soro utilizado para a imunoprecipitação, que seria interpretada como parceiros de interacção verdadeiros da proteína alvo. Por fim, a afinidade de modulação elimina a necessidade de se encontrar uma proporção de anticorpo para o antigénio-apropriada. Apesar de aplicar o nosso protocolo para Chlamydomonas reinhardtii como organismo modelo, Ele pode ser facilmente adaptado a qualquer outro organismo que pode ser cultivada em cultura de células e é capaz de utilizar de amónio ou nitrato como fonte de azoto. Afinidade modulação de complexos de proteínas por ATP / ADP pode ser directamente aplicada a outros chaperones cuja interacção com substratos e proteínas coorte depende do estado de ATP, tal como os sistemas de HSP90 GroEL/HSP60/Cpn60 ou chaperones 14,15, ou a qualquer outro sistema em que afinidades de ligação são modulados por ATP. Afinidade modulação deve funcionar também para os casos em que as afinidades entre interacções proteicas são alterados por drogas específicas, como radicicol geldanamicina ou, no caso de sistemas de Hsp90 15. Uma limitação clara do nosso protocolo é que ele requer purificados por afinidade de anticorpos contra uma proteína alvo conhecida para ser sensíveis a um tratamento específico / droga que modula a sua afinidade para as proteínas parceiras. Portanto, há um método de alto rendimento.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Proteína Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimetil pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Armazenar dessecado a -20 ° C, dissolvem-se directamente antes da utilização </td></tr><tr><td> Inibidor da protease (completo, EDTA-free) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (adenosina-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> O fosfato de creatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Creatinafosfoquinase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP Ditiobis [succinimidil propionato] </td><td> Thermo Sientific </td><td> 22585 </td><td> Armazenar dessecado a 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (endoproteinase Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Esferas de tripsina (tripsina imobilizada Poroszyme) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Misture vigorosamente diretamente antes de usar </td></tr><tr><td> Empore Disk mm C 18 47 </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína baseado<sup&gt; 15</sup&gt; etiquetagem n metabólica, imunoprecipitação, quantitativa espectrometria de massa e affinity modulação

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Interacções proteína-proteína são fundamentais para muitos processos biológicos na célula. Portanto, a sua caracterização desempenha um papel importante na investigação actual e de uma pletora de métodos para a sua investigação é disponível 1. Interacções proteína-proteína são muitas vezes altamente dinâmico e pode depender da localização subcelular, modificações pós-tradução da proteína e do ambiente local 2. Por isso, devem ser investigados no seu ambiente natural, para a qual co-imunoprecipitação abordagens são o método de escolha 3. Parceiros de co-precipitados de interacção são identificados quer por imunotransferência em uma abordagem orientada, ou por espectrometria de massa (LC-MS/MS) de uma forma não segmentados. A última estratégia muitas vezes é negativamente afetada por um grande número de falsos positivos descobertas, principalmente derivada da alta sensibilidade dos espectrômetros de massa modernas que confiantemente detectar vestígios de proteínas não específica precipitantes. A Recent abordagem para ultrapassar este problema é baseada na ideia de que quantidades reduzidas de parceiros específicos de interacção irá co-precipitado com uma dada proteína alvo, cuja concentração celular é reduzido por RNAi, enquanto as quantidades de proteínas não específica, não deve ser afectada precipitantes. Esta abordagem, chamada QUICK por imunoprecipitação quantitativos em conjunto com Knockdown 4, emprega Labeling isótopo estável de Aminoácidos em cultura celular (SILAC) 5 e MS para quantificar as quantidades de proteínas imunoprecipitadas a partir de estirpes do tipo selvagem e knock-down. Proteínas encontradas em uma proporção de 1:1 podem ser considerados como contaminantes, aqueles enriquecidos em precipitados a partir do tipo selvagem, como parceiros específicos de interacção da proteína alvo. Embora inovador, QUICK possui algumas limitações: em primeiro lugar, é SILAC custo intensivo e limitado para os organismos que, idealmente, são auxotróficas para arginina e / ou lisina. Além disso, quando a arginina pesado é alimentada, a arginina-to-proline resultados de interconversão em additmassa ional desloca para cada prolina num péptido e dilui ligeiramente pesado com arginina luz, o que faz com que a quantificação mais tediosa e menos precisa 5,6. Em segundo lugar, QUICK requer que os anticorpos são titulados de tal forma que eles não se tornam saturado com a proteína alvo em extractos de knock-down mutantes. Aqui, apresentamos um protocolo modificado rápido que supera as limitações acima referidas do QUICK substituindo SILAC para a rotulagem 15 N metabólica e pela substituição de RNAi mediada por knock-down para afinidade modulação de interações proteína-proteína. Nós demonstrar a aplicabilidade do presente protocolo utilizando as unicelulares Chlamydomonas reinhardtii alga verde como organismo-modelo e o acompanhante HSP70B cloroplasto como proteína alvo 7 (Figura 1). HSP70s são conhecidos por interagir com determinados colegas de acompanhantes e substratos apenas no estado ADP 8. Nós explorar essa propriedade como um meio de verificar a específicainteração de HSP70B com seu fator de troca de nucleotídeos CGE1 9.

Nós apresentamos uma variação da abordagem QUICK (Imunoprecipitação quantitativos em conjunto com Knockdown) que foi introduzida anteriormente para distinguir entre verdadeiros e falsos interacções proteína-proteína. A nossa abordagem é baseada<sup&gt; 15N</sup&gt; Marcação metabólica, a modulação da afinidade das interacções proteína-proteína com a presença / ausência de ATP, imunoprecipitação, e por espectrometria de massa quantitativo.

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado<sup&gt; 15</sup&gt; Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

As interações proteína-proteína são fundamentais para muitos processos biológicos na célula. Portanto, a sua caracterização desempenha um papel importante em...

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar proteínas que interajam especificamente com uma determinada proteína alvo em extratos celulares contendo proteínas solúveis e de membrana. Primeiro, realize a marcação metabólica completa de células de chlamydomonas com nitrogênio 14 e nitrogênio 15 e gere lisados celulares contendo e não contendo uma TP. Um passo opcional de reticulação ajuda a estabilizar interações transitórias entre proteínas. Em seguida, separe os lisados celulares em frações, enriquecendo proteínas insolúveis e de membrana das quais a proteína alvo e seus parceiros específicos de interação.Uma proteína controle e proteínas contaminantes são imunoprecipitadas e eluídas. Em seguida, misture as proteínas imunoprecipitadas, triplamente digira e analise-as por LCMS em tandem. Os resultados distinguiram entre interatores verdadeiros e falsos ao mostrar diferentes proporções de nitrogênio, peptídeos com nitrogênio-14 e nitrogênio-15 para proteínas que interagem especificamente com a proteína alvo e nitrogênio igual.Proporções de peptídeos com nitrogênio 15 para a proteína alvo, a proteína controle e proteínas contaminantes. O método escolhido para analisar interações entre proteínas é imunoprecipitar diretamente a proteína de interesse juntamente com seus parceiros de interação a partir de extratos celulares onde ambas estejam em suas conformações e concentrações nativas.No entanto, ao fazê-lo, proteínas contaminantes também são precipitadas, principalmente porque interagem com os anticorpos, já que os espectrômetros de massa modernos são extremamente sensíveis. Eles identificarão inequivocamente também as proteínas contaminantes e, assim, será impossível distinguir artefatos de verdadeiros parceiros de interação. Esse problema é superado pela técnica apresentada aqui, baseada na modulação da afinidade por imunoprecipitação com marcação metabólica por 15 N, mediada aqui pelo estado de A TP, e espectrometria de massa quantitativa.A técnica será demonstrada por Stefan SCH Malinger, que é um estudante de doutorado sênior no meu laboratório. Após rotular as células por 10 gerações, transfira duas alíquotas de células de *Chlamydomonas* marcadas com nitrogênio 14 e nitrogênio 15 para tubos 4G SA, colha por centrifugação, ressuspenda os pellets em dois mililitros de tampão de lise gelado e transfira as suspensões para tubos Falcon de 15 mililitros. Colete as células restantes com um mililitro adicional de tampão de lise para cada eppendorf. Adicione 50 microlitros de inibidor de protease 25x e 12,5 microlitros de cloreto de magnésio um molar, sonique as amostras quatro vezes por 20 segundos em gelo para completa lise celular, com pausas de 22 segundos entre cada ciclo para resfriamento.Prepare quatro tamp&otilde;es de sacarose de seis mililitros em tubos de parede fina SW 41 TI. Deite cuidadosamente todo o volume dos lisados celulares sobre os tamp&otilde;es de sacarose. Equilibre com tamp&atilde;o de lise e centrifugue para separar os complexos proteicos sol&uacute;veis das membranas.Transfira os complexos proteicos solúveis do topo do gradiente para quatro tubos cónicos de 15 mililitros. Certifique-se de evitar a transferência de partes do colchão de sacarose. Em seguida, adicione a cada amostra Triton X-100 a 10% para obter uma concentração final de 0,5%. Misture cuidadosamente e adicione o tampão de lise até um volume total de sete mililitros.Para análises imunológicas e eletroforese em gel de SDS. Reserve 70 microlitros de cada extrato celular solúvel em um novo tubo cônico de 1,5 mililitro e adicione 70 microlitros de tampão amostral 2X SDS. Em seguida, descarte os colchões de sacarose dos tubos de parede fina SW 41 TI e adicione três mililitros de tampão de lise a cada pellet.Adicione um mililitro de Triton X-100 a 10% para uma concentração final de 2%. Após a dissolução de cada pellet por sonicação, adicione o tampão de lise até um volume total de cinco mililitros e centrifugue. Como antes, colete as frações superiores dos complexos de proteínas de membrana em tubos cónicos de 15 mililitros. Adicione o tampão de lise contendo Triton X-100 a 2% até um volume final de sete mililitros.Utilize 70 microlitros dessas amostras para análises de eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e imunoblot. Primeiro, equilibre a proteína conjugada com anticorpo. Uma suspensão de microesferas com anticorpo sérico é diluída a oito mililitros e alíquotada após duas lavagens com quatro mililitros de tampão de lise.Um mililitro da suspensão em cada um dos oito tubos tipo falcon de 15 mililitros contendo complexos proteicos solúveis ou de membrana de células marcadas com nitrogênio 14 e nitrogênio 15, repletas e esgotadas de TP, incubados por duas horas a quatro graus Celsius em um agitador rotativo para precipitar os complexos proteicos. Pelotizar as esferas por centrifugação, descartar os sobrenadantes, deixando um pequeno volume de líquido sobre as esferas para evitar contaminação por proteínas aderidas às paredes de plástico. Transferir as amostras para tubos cónicos frescos de 1,5 mililitro para recolher todas as esferas remanescentes nos tubos falcon. Adicionar mais 0,8 mililitros de tampão de lise contendo 0,1% de Triton a cada tubo, vórtex, centrifugar suavemente e transferir o tampão com as esferas residuais para os tubos eppendorf. Após várias etapas de lavagem, centrifugar as amostras por 15 segundos a 16.100 × g e quatro graus Celsius.Remova primeiro os sobrenatantes das amostras com uma pipeta comum. Em seguida, remova completamente qualquer sobrenatante remanescente com a seringa Hamilton de 50 microlitros. Adicione a cada amostra 100 microlitros de tampão de eluição recém-preparado e incube em um termomixer a 800 RPM, centrifugue as amostras por 15 segundos a 16.100 ×g e 25 °C.Agora transfira cada sobrenadante para um tubo novo usando uma seringa Hamilton de 50 microlitros limpa. Adicione também 50 microlitros de tampão de eluição aos grânulos, seguindo o mesmo procedimento realizado anteriormente com as amostras, e reúna os eluatos correspondentes. Lembre-se de reservar 30 microlitros de todos os EITs das amostras para análises em gel de SDS-PAGE e imunoblot.Agora combine os precipitados eluídos das proteínas solúveis e de membrana tratadas com ATP mais e menos, marcadas com nitrogênio 14 e nitrogênio 15. Em seguida, realize a redução, alquilação e digestão inicial em alta concentração de ureia conforme descrito no manuscrito suplementar. Prossiga então para uma digestão triptíca em roda rotatória por pelo menos 16 horas.A 37 graus Celsius. Peliculize as microesferas de tripsina com uma centrifugação de cinco minutos a 16.100 × g e 4 graus Celsius. Transfira os sobrenadantes para tubos Eppendorf novos de dois mililitros.Lave os tubos antigos com 50 microlitros de bicarbonato de amônio 20 milimolar, 0,5% de ácido acético e reúna com os primeiros sobrenadantes. Para preparar ponteiras C18 caseiras para dessalinização das amostras, recorte dois discos do material C18 emcor com uma agulha de seringa e insira-os em uma ponteira de pipeta de 200 microlitros. Em seguida, faça furos nas tampas de quatro tubos einor de dois mililitros e insira as ponteiras. Pré-condicione as ponteiras C18 com 50 microlitros da solução B, centrifugue por três minutos a 800 ×g e 25 graus Celsius.Em seguida, equilibre as pontas C 18 com 100 microlitros da solução, centrifugando por três minutos a 800 G e 25 graus Celsius. Repita este passo de equilibração mais uma vez. Prossiga carregando 100 microlitros dos sobrenadantes das amostras provenientes das digestões tripticas nas pontas C 18, centrifugando por três minutos a 800 G e 25 graus Celsius.Repita a aplicação na coluna para completa aplicação dos sobrenadantes da amostra. Após lavar as pontas tipo C 18, elua os peptídeos triptícos para um novo tubo einor de 1,5 mililitro com 50 microlitros da solução B, centrifugue por três minutos a 800 ×g e 25 °C. Repita a etapa de eluição uma vez e, em seguida, seque completamente os peptídeos em um evaporador speed VAC.Suspenda os peptídeos secos em 20 microlitros da solução A e incube por pelo menos uma hora em gelo, interrompida por duas incubações de 15 minutos em banho de ultrassom, seguida de centrifugação por 20 minutos a 16.100 × g e quatro graus Celsius, e aplique Senna ao nano C-M-S-M-S HSP 70. As proteínas de choque térmico são conhecidas por interagirem com co-chaperonas específicas e substratos apenas na ausência de ATP; nestes extratos celulares marcados com nitrogênio-14, hs P 70 B e CGE um estão quase exclusivamente localizados na fração solúvel, independentemente do estado de ATP. Em contraste, CF um beta está localizada tanto na fração solúvel quanto na fração enriquecida em membrana.Como a sonicação cisalha parte da CF um beta da ATP Sintase localizada na membrana, ela serve como controle de carga para ambas as frações. Quantidades semelhantes de HSP 70 B foram precipitadas com os anticorpos anti-HSP 70 B a partir de extratos solúveis marcados com nitrogênio 14 e nitrogênio 15, independentemente do estado de ATP. Em contraste, baixos níveis da proteína HSP 70 B foram precipitados das frações de membrana, com quantidades ligeiramente maiores provenientes de frações de membrana desprovidas de ATP em comparação com frações de membrana repletas de ATP, conforme esperado pela afinidade da CGE E um pela hs.P 70 B depende do contexto. Nenhuma CGE um foi co-precipitada com HS P 70 B em frações solúveis ou de membrana repletas de TP. As quantidades de proteína CGE um co-precipitadas com HS P 70 B a partir de frações solúveis e de membrana esgotadas de TP correlacionam-se quantitativamente com a quantidade de HSP 70 B precipitada. A interação de CGE um com HS P 70 B apenas no estado A DP também é observada na análise por espectrometria de massas.Neste experimento, os precipitados foram preparados a partir de misturas de extratos marcados com nitrogênio 14, sem TP e nitrogênio, e extratos marcados com nitrogênio 15, contendo TP. Embora as formas marcadas com leve e pesado do peptídeo HSP 70 B tenham sido detectadas com intensidades iguais, apenas a forma marcada com leve do peptídeo CGE um, proveniente dos extratos esgotados de TP, foi detectada. Os mesmos peptídeos do precipitado anti-HSP 70 D DB, derivado de misturas de extratos celulares solúveis marcados reciprocamente, são mostrados aqui. Assim, apenas a forma marcada com pesado do peptídeo CGE um em extratos esgotados de TP foi detectada, bem como os peptídeos HSP 70 B marcados com leve e pesado.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa noção de como realizar um experimento de co-imunoprecipitação com preparação de amostra para análise por espectrometria de massas. Não se esqueça de que contaminações com proteínas humanas, especialmente queratina, interferirão nas suas medições de perfil proteico no espectrômetro de massas e, portanto, precauções de segurança, como o uso de luvas, ambiente limpo e reagentes de grau LCMS, são fundamentais durante a realização deste procedimento.

a-protocol-for-identification-protein-protein-interactions-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Experimentos de imunoprecipitação SILAC representar um poderoso meio para descobrir nova proteína: interações protéicas. Ao permitir que a quantificação relativa exacta da abundância de proteína em ambas as amostras de controlo e de ensaio, os verdadeiros interacções podem ser facilmente distinguidos dos contaminantes experimentais, e interacções de baixa afinidade preservado através da utilização de condições de tampão menos rigorosas.

Identificação de parceiros de interação de proteínas em células de mamíferos utilizando SILAC-imunoprecipitação quantitativos Proteômica

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Nós estabelecemos um método para a purificação de proteínas de interacção co-regulação que utilizam o sistema de LC-MS / MS.

Uma proteína Método de Preparação para a Identificação de alto rendimento de proteínas que interagem com um co-fator nuclear utilizando LC-MS / MS Análise

Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Nós fornecemos um protocolo passo a passo para dividir-BioID, um ensaio de fragmentos-complementação de proteínas com base na técnica de criação de etiquetas de proximidade BioID. Ativado na interação das duas proteínas determinadas, permite a análise proteômica de contexto-dependente da proteína em seu ambiente nativo do celular. O método é simples e econômica e só requer equipamentos de laboratório padrão.

Split-BioID — Proteomic análise de complexos de proteínas específicas do contexto em seu ambiente nativo do celular

Interações da proteína-proteína e proteína-metabólito são cruciais para todas as funções celulares. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a análise paralela dessas interações com uma proteína de escolha. Nosso protocolo foi otimizado para culturas de células de plantas e combina a purificação da afinidade com espectrometria de massa base de proteína e deteção do metabólito.

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica da digestão da em-membrana para a preparação das amostras para a espectrometria maciça. Esta técnica facilita a análise conveniente das interações proteína-proteína.

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

Este protocolo centra-se na identificação de proteínas que se ligam a fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos. Ele usa a cromatografia de afinidade com fosfatos de inositol biotinylated ou fosfoinositídeos que são imobilizados via estreptavidina para agarose ou grânulos magnéticos. Fosfato de inositol ou proteínas de ligação Fosfoinositídeo são identificados por western blotting ou espectrometria de massa.

Identificação de fosfato de inositol ou proteínas Fosfoinositídeo interagindo por cromatografia de afinidade acoplada a Western blot ou espectrometria de massas

A imunoprecipitação quantitativa Multiplex (QMI) utiliza citometria de fluxo para detecção sensível de diferenças na abundância de interações proteína-proteína direcionadas entre duas amostras. O QMI pode ser realizado usando uma pequena quantidade de biomaterial, não requer Tags geneticamente projetadas e pode ser adaptado para qualquer rede de interação protéica previamente definida.

Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

Descrito é um fluxo de trabalho proteômico para identificar parceiros de interação proteica de uma fração subcelular nuclear usando enriquecimento de imunoafinidade de uma determinada proteína de interesse e espectrometria de massa sem rótulo. O fluxo de trabalho inclui fracionação subcelular, imunoprecipitação, preparação de amostras auxiliadas por filtro, limpeza off-line, espectrometria de massa e um pipeline de bioinformática a jusante.

Fluxo de trabalho de espectrometria de massa de imunoprecipitação sem rótulos para perfis de interactom nuclear em larga escala

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir a captura e identificação de interações proteína-proteína específicas da doença de células e tecidos nativos usando sondas químicas e espectrometria de massa. Os conjuntos de dados de interação resultantes são analisados por meio de uma plataforma dedicada baseada na web para revelar disfunções de rede dinâmica e alterações de vias ligadas à doença.

Mapeando interações proteína-proteína disfuncionais na doença

Aprenda a identificar interações proteína-proteína específicas usando marcação metabólica com 15N, imunoprecipitação e espectrometria de massa quantitativa em Chlamydomonas. Este método diferencia parceiros verdadeiros de contaminantes.

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado 15 Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação (Vídeo) | JoVE Journal

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado

Explorar mais vídeos