Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar proteínas que interajam especificamente com uma determinada proteína alvo em extratos celulares contendo proteínas solúveis e de membrana. Primeiro, realize a marcação metabólica completa de células de chlamydomonas com nitrogênio 14 e nitrogênio 15 e gere lisados celulares contendo e não contendo uma TP. Um passo opcional de reticulação ajuda a estabilizar interações transitórias entre proteínas. Em seguida, separe os lisados celulares em frações, enriquecendo proteínas insolúveis e de membrana das quais a proteína alvo e seus parceiros específicos de interação.

Uma proteína controle e proteínas contaminantes são imunoprecipitadas e eluídas. Em seguida, misture as proteínas imunoprecipitadas, triplamente digira e analise-as por LCMS em tandem. Os resultados distinguiram entre interatores verdadeiros e falsos ao mostrar diferentes proporções de nitrogênio, peptídeos com nitrogênio-14 e nitrogênio-15 para proteínas que interagem especificamente com a proteína alvo e nitrogênio igual.

Proporções de peptídeos com nitrogênio 15 para a proteína alvo, a proteína controle e proteínas contaminantes. O método escolhido para analisar interações entre proteínas é imunoprecipitar diretamente a proteína de interesse juntamente com seus parceiros de interação a partir de extratos celulares onde ambas estejam em suas conformações e concentrações nativas.

No entanto, ao fazê-lo, proteínas contaminantes também são precipitadas, principalmente porque interagem com os anticorpos, já que os espectrômetros de massa modernos são extremamente sensíveis. Eles identificarão inequivocamente também as proteínas contaminantes e, assim, será impossível distinguir artefatos de verdadeiros parceiros de interação. Esse problema é superado pela técnica apresentada aqui, baseada na modulação da afinidade por imunoprecipitação com marcação metabólica por 15 N, mediada aqui pelo estado de A TP, e espectrometria de massa quantitativa.

A técnica será demonstrada por Stefan SCH Malinger, que é um estudante de doutorado sênior no meu laboratório. Após rotular as células por 10 gerações, transfira duas alíquotas de células de *Chlamydomonas* marcadas com nitrogênio 14 e nitrogênio 15 para tubos 4G SA, colha por centrifugação, ressuspenda os pellets em dois mililitros de tampão de lise gelado e transfira as suspensões para tubos Falcon de 15 mililitros. Colete as células restantes com um mililitro adicional de tampão de lise para cada eppendorf. Adicione 50 microlitros de inibidor de protease 25x e 12,5 microlitros de cloreto de magnésio um molar, sonique as amostras quatro vezes por 20 segundos em gelo para completa lise celular, com pausas de 22 segundos entre cada ciclo para resfriamento.

Prepare quatro tampões de sacarose de seis mililitros em tubos de parede fina SW 41 TI. Deite cuidadosamente todo o volume dos lisados celulares sobre os tampões de sacarose. Equilibre com tampão de lise e centrifugue para separar os complexos proteicos solúveis das membranas.

Transfira os complexos proteicos solúveis do topo do gradiente para quatro tubos cónicos de 15 mililitros. Certifique-se de evitar a transferência de partes do colchão de sacarose. Em seguida, adicione a cada amostra Triton X-100 a 10% para obter uma concentração final de 0,5%. Misture cuidadosamente e adicione o tampão de lise até um volume total de sete mililitros.

Para análises imunológicas e eletroforese em gel de SDS. Reserve 70 microlitros de cada extrato celular solúvel em um novo tubo cônico de 1,5 mililitro e adicione 70 microlitros de tampão amostral 2X SDS. Em seguida, descarte os colchões de sacarose dos tubos de parede fina SW 41 TI e adicione três mililitros de tampão de lise a cada pellet.

Adicione um mililitro de Triton X-100 a 10% para uma concentração final de 2%. Após a dissolução de cada pellet por sonicação, adicione o tampão de lise até um volume total de cinco mililitros e centrifugue. Como antes, colete as frações superiores dos complexos de proteínas de membrana em tubos cónicos de 15 mililitros. Adicione o tampão de lise contendo Triton X-100 a 2% até um volume final de sete mililitros.

Utilize 70 microlitros dessas amostras para análises de eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e imunoblot. Primeiro, equilibre a proteína conjugada com anticorpo. Uma suspensão de microesferas com anticorpo sérico é diluída a oito mililitros e alíquotada após duas lavagens com quatro mililitros de tampão de lise.

Um mililitro da suspensão em cada um dos oito tubos tipo falcon de 15 mililitros contendo complexos proteicos solúveis ou de membrana de células marcadas com nitrogênio 14 e nitrogênio 15, repletas e esgotadas de TP, incubados por duas horas a quatro graus Celsius em um agitador rotativo para precipitar os complexos proteicos. Pelotizar as esferas por centrifugação, descartar os sobrenadantes, deixando um pequeno volume de líquido sobre as esferas para evitar contaminação por proteínas aderidas às paredes de plástico. Transferir as amostras para tubos cónicos frescos de 1,5 mililitro para recolher todas as esferas remanescentes nos tubos falcon. Adicionar mais 0,8 mililitros de tampão de lise contendo 0,1% de Triton a cada tubo, vórtex, centrifugar suavemente e transferir o tampão com as esferas residuais para os tubos eppendorf. Após várias etapas de lavagem, centrifugar as amostras por 15 segundos a 16.100 × g e quatro graus Celsius.

Remova primeiro os sobrenatantes das amostras com uma pipeta comum. Em seguida, remova completamente qualquer sobrenatante remanescente com a seringa Hamilton de 50 microlitros. Adicione a cada amostra 100 microlitros de tampão de eluição recém-preparado e incube em um termomixer a 800 RPM, centrifugue as amostras por 15 segundos a 16.100 ×g e 25 °C.

Agora transfira cada sobrenadante para um tubo novo usando uma seringa Hamilton de 50 microlitros limpa. Adicione também 50 microlitros de tampão de eluição aos grânulos, seguindo o mesmo procedimento realizado anteriormente com as amostras, e reúna os eluatos correspondentes. Lembre-se de reservar 30 microlitros de todos os EITs das amostras para análises em gel de SDS-PAGE e imunoblot.

Agora combine os precipitados eluídos das proteínas solúveis e de membrana tratadas com ATP mais e menos, marcadas com nitrogênio 14 e nitrogênio 15. Em seguida, realize a redução, alquilação e digestão inicial em alta concentração de ureia conforme descrito no manuscrito suplementar. Prossiga então para uma digestão triptíca em roda rotatória por pelo menos 16 horas.

A 37 graus Celsius. Peliculize as microesferas de tripsina com uma centrifugação de cinco minutos a 16.100 × g e 4 graus Celsius. Transfira os sobrenadantes para tubos Eppendorf novos de dois mililitros.

Lave os tubos antigos com 50 microlitros de bicarbonato de amônio 20 milimolar, 0,5% de ácido acético e reúna com os primeiros sobrenadantes. Para preparar ponteiras C18 caseiras para dessalinização das amostras, recorte dois discos do material C18 emcor com uma agulha de seringa e insira-os em uma ponteira de pipeta de 200 microlitros. Em seguida, faça furos nas tampas de quatro tubos einor de dois mililitros e insira as ponteiras. Pré-condicione as ponteiras C18 com 50 microlitros da solução B, centrifugue por três minutos a 800 ×g e 25 graus Celsius.

Em seguida, equilibre as pontas C 18 com 100 microlitros da solução, centrifugando por três minutos a 800 G e 25 graus Celsius. Repita este passo de equilibração mais uma vez. Prossiga carregando 100 microlitros dos sobrenadantes das amostras provenientes das digestões tripticas nas pontas C 18, centrifugando por três minutos a 800 G e 25 graus Celsius.

Repita a aplicação na coluna para completa aplicação dos sobrenadantes da amostra. Após lavar as pontas tipo C 18, elua os peptídeos triptícos para um novo tubo einor de 1,5 mililitro com 50 microlitros da solução B, centrifugue por três minutos a 800 ×g e 25 °C. Repita a etapa de eluição uma vez e, em seguida, seque completamente os peptídeos em um evaporador speed VAC.

Suspenda os peptídeos secos em 20 microlitros da solução A e incube por pelo menos uma hora em gelo, interrompida por duas incubações de 15 minutos em banho de ultrassom, seguida de centrifugação por 20 minutos a 16.100 × g e quatro graus Celsius, e aplique Senna ao nano C-M-S-M-S HSP 70. As proteínas de choque térmico são conhecidas por interagirem com co-chaperonas específicas e substratos apenas na ausência de ATP; nestes extratos celulares marcados com nitrogênio-14, hs P 70 B e CGE um estão quase exclusivamente localizados na fração solúvel, independentemente do estado de ATP. Em contraste, CF um beta está localizada tanto na fração solúvel quanto na fração enriquecida em membrana.

Como a sonicação cisalha parte da CF um beta da ATP Sintase localizada na membrana, ela serve como controle de carga para ambas as frações. Quantidades semelhantes de HSP 70 B foram precipitadas com os anticorpos anti-HSP 70 B a partir de extratos solúveis marcados com nitrogênio 14 e nitrogênio 15, independentemente do estado de ATP. Em contraste, baixos níveis da proteína HSP 70 B foram precipitados das frações de membrana, com quantidades ligeiramente maiores provenientes de frações de membrana desprovidas de ATP em comparação com frações de membrana repletas de ATP, conforme esperado pela afinidade da CGE E um pela hs.

P 70 B depende do contexto. Nenhuma CGE um foi co-precipitada com HS P 70 B em frações solúveis ou de membrana repletas de TP. As quantidades de proteína CGE um co-precipitadas com HS P 70 B a partir de frações solúveis e de membrana esgotadas de TP correlacionam-se quantitativamente com a quantidade de HSP 70 B precipitada. A interação de CGE um com HS P 70 B apenas no estado A DP também é observada na análise por espectrometria de massas.

Neste experimento, os precipitados foram preparados a partir de misturas de extratos marcados com nitrogênio 14, sem TP e nitrogênio, e extratos marcados com nitrogênio 15, contendo TP. Embora as formas marcadas com leve e pesado do peptídeo HSP 70 B tenham sido detectadas com intensidades iguais, apenas a forma marcada com leve do peptídeo CGE um, proveniente dos extratos esgotados de TP, foi detectada. Os mesmos peptídeos do precipitado anti-HSP 70 D DB, derivado de misturas de extratos celulares solúveis marcados reciprocamente, são mostrados aqui. Assim, apenas a forma marcada com pesado do peptídeo CGE um em extratos esgotados de TP foi detectada, bem como os peptídeos HSP 70 B marcados com leve e pesado.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa noção de como realizar um experimento de co-imunoprecipitação com preparação de amostra para análise por espectrometria de massas. Não se esqueça de que contaminações com proteínas humanas, especialmente queratina, interferirão nas suas medições de perfil proteico no espectrômetro de massas e, portanto, precauções de segurança, como o uso de luvas, ambiente limpo e reagentes de grau LCMS, são fundamentais durante a realização deste procedimento.