Name: Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na C. elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprenda a criar câmaras de hipóxia com fluxo contínuo para estudar efeitos da baixa oxigenação em C. elegans. Este método permite controlar precisamente concentrações de O₂ e investigar letalidade embrionária dependente de Hi F1.

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Agradecemos os membros do laboratório de Miller para a discussão e leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um prêmio de novo investigador do Centro de Choque Nathan de Excelência em Biologia Básica do Envelhecimento a DLM e pelo National Institutes of Health prêmio R00 AG030550 a DLM.

1. Construção das Câmaras Ambientais <ol><li> Selecione o menor volume razoável de câmara necessário para o alcance de seu projeto. Câmara deve ser feita de gás (O 2) de material impermeável. Pratos Pyrex de cristalização, caixas Anaeropack, ou grandes fundido acrílicos-caixas (Ellard Instrumentation), podem ser usados. Descobrimos que 50 placas de 9 mm, podem caber em um prato 100 x 50 KIMEX cristalização. Placas de vidro pode ser usado como tampas para pratos de cristalização Pyrex. </li><li> Perfurar um furo na câmara seleccionado e se encaixam com um macho de plástico Luer para encaixe da mangueira farpa (Cole Parmer). Acessórios podem ser asseguradas por encaixe de tubulação ou com epóxi. Instalar um acessório semelhante no lado oposto do recipiente para permitir que o gás flua para dentro e para fora da câmara. Se possível, compensar furos para aumentar a mistura turbulenta. </li><li> Obter os tanques de gás comprimido com definidas O 2 concentrações (equilibrada com N 2) que são certificados padrão para ó co 2ntent ou, para as condições anóxicas, puro N 2 (&lt;10 ppm O 2). Use-automáticas mudar mais de reguladores para estudos de longo prazo para evitar perturbar os níveis de oxigênio nas câmaras. </li><li> Resposta à hipoxia organismal foi mostrado para ser temperatura 15 dependente. Ao colocar a câmara numa incubadora, a diferentes temperaturas pode ser mantida. Temperaturas dentro de uma incubadora pode ser irregular e, como tal, é prudente fazer uso de um registador de dados de temperatura para medir constantemente a temperatura no interior da câmara. </li></ol> 2. Ligar o gás para a Câmara Ambiental <ol><li> Para todas as conexões, use um oitavo de polegada de diâmetro exterior tubo conectado por meio de conectores o snap ou acessórios de compressão. Tubos devem ser impermeável e não reactivo com O 2, tais como etileno propileno fluorado (FEP) ou nylon (Cole Parmer). Para um diagrama esquemático da instalação completa, ver Figura 1. </li><li> Conecte o comprensados ​​tanques de gás para um dispositivo de controlo de fluxo, tais como um controlador de fluxo de massa (Sierra Instruments) ou rotâmetro (Aalborg). Assegurar que a pressão a montante do tanque está dentro do alcance do dispositivo de fluxo e as mangueiras farpa. Dois estágios reguladores são geralmente usadas, com a segunda etapa definida como a pressão desejada [Veja a seção três para selecionar a taxa de fluxo adequado] </li><li> O gás hidrato por borbulhamento através de água destilada utilizando uma garrafa de lavagem de gás com o cilindro poroso, em seguida, directa em um dos acessórios na câmara ambiental, deixando o encaixe segundo aberto para gases de escape (ver Figura 1). Para estudos de curto prazo, a hidratação de gás protege contra dessecação placa, mas a monitorização de humidade pode ser necessário para estudos de longo prazo. </li><li> Dow Corning graxa vácuo pode ser utilizado para vedar a câmara. Pesos de lugar sobre a tampa da câmara de assegurar uma vedação hermética. Para confirmar uma vedação firme e fluxo adequado, mantenha uma pequena piscina de água na palma da ynossa mão enluvada para o apetrechamento da câmara e verifique se há bolhas. </li></ol> 3. Seleção de Vazão <ol><li> Assumindo perfeita mistura, existe a troca gasosa de 90% da atmosfera gasosa cada vez que o volume da câmara é substituído (Lei de Fick). Por exemplo, em uma câmara de cc 100 com um caudal de 100 cc / min, o ar casa original na câmara de irá ser substituído com 90% do seu gás desejado depois de 1 minuto, e vai assintoticamente aproximar troca completa em 90% a cada minuto depois disso. </li><li> Maiores taxas de fluxo e recipientes menores vai chegar a sua concentração de oxigênio desejado mais rapidamente. Para 100 x 50 KIMEX recipientes (400 cc), uma taxa de fluxo de 120 cc / min atingirá troca 99,9% em 10 minutos (3 trocas). Esta taxa de fluxo é adequado para a maioria das condições de oxigénio. Para o nosso conhecimento, não houve uma investigação sistemática de como a taxa de variação da concentração de O 2 influencia a resposta em C. elegans. </li></ol><ol><li> Worms expostas a condições hipóxicas comumente escapar a superfície de placas de agar. Para evitar isso, colocar um anel de ácido palmítico (10 mg / ml em etanol) em torno da borda das placas. O ácido palmítico irá sair da solução como se evapora etanol, formando uma barreira física. Barreiras de ácido palmítico não afetar a taxa de postura de ovos, a fecundidade ou longevidade em C. elegans 16,17. Buraqueira não ocorre mais freqüentemente em condições de hipóxia, de modo adicionais medidas preventivas não são geralmente necessários. </li><li><ol><li> Gerar populações sincronizadas pelo branqueamento adultos grávidas em uma pequena gota de solução de lixívia alcalina em unseeded nematóides de crescimento da mídia (NGM) placas 18. Em contraste com protocolos padrão de lote-grande de hipoclorito de branqueamento, escolher 1-100 animais em uma gota de solução de lixívia na superfície de uma placa NGM, então permitir que a solução de lixívia para absorver na placa <sup&gt; 18. Após pelo menos 12 horas, transferir as larvas L1 sincronizado para placas semeadas com vivos OP50 bactérias. Alternativamente, pode-se permitir aos adultos fêmeas grávidas a pôr ovos na placa durante 2-3 horas para gerar um grupo de vermes que irá desenvolver síncrona ou escolher L4 larvas de uma população mista. </li><li> Evite expor embriões clareados à hipóxia, pois isso pode reduzir a viabilidade 13. Para recolher os embriões jovens (2-4 células), adultos fêmeas grávidas pode ser cortado em um pequeno volume de água com uma lâmina de barbear e embriões movido para placas por pipeta boca por exposição subsequente à hipoxia. </li></ol></li><li> Selar placas na câmara ambiental. Os animais de controlo deve ser mantido em normóxia (casa de ar), à mesma temperatura como vermes tratados. Não existe nenhuma diferença entre as amostras deixadas observável na casa de ar e as mantidas em uma câmara idêntica com casa de ar que flui sobre eles. Iniciar o fluxo de gás e manter uma exposição durante o tempo desejado. Para assegurar a uniformidade na rampa, certifique-se desubstituir a água no frasco de lavagem de gás antes da exposição. </li><li> Para a sobrevivência de embriões de ensaio, permitem que os vermes para desenvolver durante 48 h após o retorno ao ar ambiente, altura em que eles devem ser quarta fase larvas / dia um adultos. Pontuação para a sobrevivência, a censura quaisquer vermes que não podem ser contabilizados. </li><li> Para visualizar os animais expostos à hipoxia, mover vermes para uma gota de M9 sobre uma lamela 22 mm 2, e inverter para uma almofada de agarose a 2% em M9 18. Se o levamisole, necessário (25 mM) ou azida de sódio (10 mM) pode ser usado como anestésico. A azida de sódio e levamisole podem confundir algumas observações devido à toxicidade e deve ser judiciosamente usado 19. </li></ol> 5. Colheita rápida de hipoxemia expostas Worms (Exemplo: preparação de amostras para HIF-1 Análise ocidental) Muitos induzida por hipóxia efeitos são rapidamente revertidos após o retorno ao ar ambiente, incluindo a retomada de produção de ovos, 12 de fosforilação de epítopos de mitosena embriogénese 13 e degradação da proteína HIF-1 9,20. Isolamento rápido de animais expostos à hipoxia é necessária para se obter efeitos reprodutíveis nestas condições. Com esta configuração, os animais podem ser colhidos e congelados em azoto líquido em menos de dois minutos. Enquanto câmaras de hipóxia Porta-luvas para permitir a manipulação de amostras em condições anóxicas, o seu custo e praticidade para outras condições de anoxia limitar a sua utilidade. <ol><li> Crescer Bristol N2 vermes em 4 10 cm crescimento elevado (HG) placas até que a maioria dos vermes são adultos fêmeas grávidas 18. Lavar vermes para um tubo cónico de 15 mL contendo uma solução 01:05 de lixívia alcalina e incubar com rotação, até que os vermes começam a dissolver-se, não mais de 5 minutos 9. Lave os vermes três vezes com M9, girando para baixo a 1500 xg entre cada lavagem sem frenagem. </li><li> Embriões placa branqueada para 8 150 placas NGM mm e permitam desenvolver a L4 larvas (~ 48 horas para Bristol N2 a 22 ° C).Mover as placas para as câmaras ambientais e expor a hipóxica (1000 ppm, 5000 ppm) e (N2) anóxicas condições durante 4 horas. Os tempos de exposição variam de acordo com desenho experimental. Embora a exposição à hipoxia tem um efeito imediato sobre a taxa de postura de ovos, dois embriões de células morrem após 16-18 horas de exposição 12. Com esta configuração câmara de hipoxia, o limite inferior de exposição é limitada pela taxa de câmbio atmosfera necessária para atingir o equilíbrio. </li><li> Rótulo um tubo de microcentrífuga 1,5 mL e um tubo de 15 mL cónica para cada amostra experimental. Worms expostos à hipoxia são mais propensos a aderir aos lados do tubo, durante a colheita. Para evitar isto, o local de 100 uL de sulfato de sódio a 1% de dodecil (SDS) em cada tubo 15 mL cónico. Se SDS inibe aplicações a jusante, albumina de soro bovino (BSA) pode ser usado para evitar a aderência. O uso rotineiro de SDS ou BSA não parecem ter uma diferença aparente. Adicionar 50 ul de proteína 2x carregamento corante (4% de SDS, 10% 2-mercaptoetanol e umUm traço de azul de bromofenol em glicerol 30% (w / v)) para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Tenha um Dewar de nitrogênio líquido pronto. </li><li> Horário das etapas após remover os vermes de hipóxia e registro. Remover a tampa para a câmara de hipóxico, tomar uma placa de amostra, e feche a câmara. Use água destilada para lavar os vermes para um filtro de nylon e, em seguida, derramar para dentro do tubo 15 mL cónico. Gire os vermes para baixo em uma centrífuga de mesa a 1500 xg durante 15-20 segundos com freio. </li><li> Use um vácuo para remover a maior parte do sobrenadante do tubo, deixando o verme pelete intacto. </li><li> Usando uma pipeta, mover o verme pellet em 50 uL para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Selar o tubo e imerso em nitrogênio líquido. </li><li> Repita até que todas as amostras terem sido isolado. Siga estes procedimentos para casa amostras de controle de ar para a consistência. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C. </li></ol> 6. Os resultados representativos Efeitos organismal de hipóxia pode ser vistoexaminando a viabilidade para a vida adulta de C. elegans (Figura 2). Embriões estabelecidas por tipo selvagem Bristol (N2) e hif-1 (ia04) mutantes de deleção são todos sobrevivem em casa com ar de O 2 concentrações (210.000 ppm O 2). N 2 vermes são capazes de se adaptar e sobreviver até a idade adulta em 5.000 ppm O 2, enquanto HIF-1 embriões não são viáveis. Isto mostra que HIF-1 é essencial para a adaptação a alteração dos níveis de oxigénio disponível no ambiente de 10. Nem N2 nem HIF-1 animais podem sobreviver a exposição a 1000 ppm O 2. A visualização verme directamente em hipoxia é viável com a utilização de um âmbito de dissecação e recipiente transparente (Figura 3). Por directamente colocando a câmara de hipóxia sobre o âmbito de dissecação, não há necessidade de remover os vermes de hipóxia para observar as reacções dos organismos. O âmbito pode ser equipado com illumation fluorescência (como na Figura 3 </strong&gt;), ampliando ainda mais os tipos de observações em hipóxia que são possíveis. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> Figura 1. Exemplo de direcção da câmara. Hipoxia do fluxo de gás é indicado por setas. O gás é armazenado em tanques de gás comprimido com definidas O 2 concentrações (1) e um regulador de dois estágios está ligado (2). Gás entra no fundo do tubo de fluxo (3), que sai do topo, à taxa de fluxo correcta. Gás flui então para o balão de bolha (4), hidratar o gás (garantir a ligação correcta do balão bolha observando bolhas). Gás hidratado em seguida, passa para a câmara de hipóxia na válvula de entrada (5), expondo as amostras a hipoxia. O gás finalmente aberturas para dentro da sala através de um orifício de escape perfurados na câmara. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> Figura 2. Viabilidade de embriões expostos a 1.000 ppm O 2, 5.000 ppm S <sub&gt; 2 e normóxia (~ 210.000 ppm O 2). Os embriões foram expostas a cada condições de oxigénio como embriões por 24 horas em câmaras de oxigénio de fluxo contínuo. Worms foram transferidas para condições normóxicas, deixou-se desenvolver até à idade adulta, durante 48 horas, e depois marcou para a viabilidade até à idade adulta. n&gt; 50, N = 5. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> Figura 3. Visualização de C. elegans em hipóxia com microscopia. Worms estão expostos a hipóxia usando os métodos descritos. A câmara transparente ambiental (construído com um prato de cristalização pirex e placa de vidro) é colocado diretamente no palco de um escopo de dissecação. Dois pontos de vista são apresentados, incluindo um fluxo de gás de todo o conjunto para cima, o outro apenas com a câmara no palco microscópio.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este método apresenta uma estratégia para a construção de um ambiente hipóxico que permite a ambientes com concentrações precisas de oxigénio possa ser mantida no laboratório. Estas câmaras fornecer um método simples para expor os organismos específicos para baixas concentrações de O 2 e monitorização das saídas moleculares e fisiológicas. A câmara ambiental descrito é montado pelo laboratório, em vez de adquirida comercialmente e podem assim ser alterado para se adequar às necessidades da experiência. <p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tubulação (FEP e PTFE) </td><td> Cole Parmer Tygon </td><td> YO-95821-00 (1/8 &quot;FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8 &quot;PTFE) &#39;R-3603 </td></tr><tr><td> Acessórios de compressão </td><td> Sistemas de Seattle dos Fluidos </td><td> 06363-58 (M. acoplador 1/16 &quot;) 06363-62 (F. acoplador 1/16 &quot;) 06363-60 (M. acoplador 1/8 &quot;) 06363-61 (F. acoplador 1/8 &quot;) </td></tr><tr><td> Tubo de fluxo </td><td> Aalborg </td><td> PMR3-010073 (3 saídas) PMR1-013520 (1 saída) </td></tr><tr><td> Controlador de fluxo de massa </td><td> Sierra Instruments </td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Trak inteligente 2) </td></tr><tr><td> Tanque de gás comprimido </td><td> Airgas </td><td> Feito à ordem &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Plástico Luer macho para acessórios espigão </td><td> Cole Parmer </td><td> 45505-41 (série 500 1/16 &quot;) </td></tr><tr><td> Elenco caixas de acrílico </td><td> Ellard Instrumentação </td><td> Feito sob encomenda </td></tr><tr><td> Acessórios para tubos (latão ou aço inoxidável) </td><td> Sistemas de Seattle dos Fluidos </td><td> B-402-1 (1/4 porca &quot;) B-200-3 (1/8 &quot;tee união) B-400-set (1/4 de virolas) B-QM2 B1-200 (QM QC Body) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 &quot;conn macho) </td></tr><tr><td> Dow Corning graxa para vácuo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> Caixa AnaeroPack </td><td> Misubishi Gas Chemical Company </td><td> R684004 (0,4 litro) R685025 (2,5 litro) R685070 (7,0 litro) </td></tr><tr><td> Pyrex frasco de lavagem de gás </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> O ácido palmítico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0500 </td></tr><tr><td> Cabra anti-ratinho de peroxidase de rábano-IgG </td><td> Southern Biotechnology Associates </td><td> 1032-1005 </td></tr><tr><td> SuperSignal Oeste Substrato Chemiluminsecent Pico </td><td> Pierce Chemical </td><td> 34077 </td></tr><tr><td> 100 x 50 pratos de vidro de cristalização </td><td> Kimax Kimble </td><td> 23000 </td></tr></tbody></table>

criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na<em&gt; c. elegans</em

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

O oxigênio é essencial para todos os metazoários para sobreviver, com uma exceção conhecida 1. Diminuição da disponibilidade de O 2 (hipóxia) podem surgir durante estados de desenvolvimento da doença, normal ou mudanças nas condições ambientais 2-5. Compreender as vias de sinalização celular que estão envolvidos na resposta à hipóxia poderia fornecer uma nova visão sobre estratégias de tratamento para diversas patologias humanas, por acidente vascular cerebral ao câncer. Este objectivo tem sido impedida, pelo menos em parte, por dificuldades técnicas associadas com a exposição hipóxico controlada em organismos modelo geneticamente passíveis. Os Caenorhabditis elegans nematóide é idealmente adequada como organismo modelo para o estudo da resposta hipóxica, como é fácil de cultura e manipular geneticamente. Além disso, é possível estudar a resposta celular a específicos hipóxicas O 2 concentrações sem efeitos de confusão desde C. elegans obter O 2 (e outros gases) por difusão, em oposição a um sistema respiratório facilitada 6. Factores conhecidos para ser envolvido na resposta à hipoxia são conservados em C. elegans. A resposta à hipoxia real depende da concentração específica de O 2 que está disponível. Em C. elegans, a exposição a moderada hipóxia elicia uma resposta de transcrição mediada em grande parte por hif-1, os altamente conservadas hipóxia induzível-factor de transcrição 6-9. C embriões. elegans requerem hif-1 para sobreviver em 5,000-20,000 ppm O 2 7,10 . A hipóxia é um termo geral para &quot;menos de O normal 2&quot;. Normóxia (normal O 2) pode também ser difícil de definir. Nós geralmente consideram ar ambiente, que é 210.000 ppm O 2 estar normóxia. No entanto, tem sido mostrado que a C. elegans tem uma preferência comportamental para O 2 concentrações de 5-12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. Em larvae e adultos, HIF-1 atua para evitar hipóxia induzida por diapausa em 5.000 ppm O 2 12. No entanto, hif-1 não desempenha um papel na resposta a concentrações mais baixas de O 2 (anoxia, definição operacional &lt;10 ppm O 2) 13. Em anoxia, C. elegans entra em um estado reversível de animação suspensa em que toda a atividade microscopicamente observável deixa 10. O fato de que diferentes respostas fisiológicas ocorrem em diferentes condições ressalta a importância de ter o controle experimental sobre a concentração hipóxica de O 2. Aqui, apresentamos um método para a construção e implementação de câmaras ambientais que produzem confiáveis ​​e reprodutíveis condições de hipóxia, com concentrações definidas de O 2. O método de fluxo contínuo assegura equilíbrio rápido da câmara, e aumenta a estabilidade do sistema. Além disso, a transparência eaacessibilidade das câmaras permitem a visualização direta de animais expostos à hipóxia. Nós ainda demonstrar um método eficaz de colheita C. elegans amostras rapidamente após a exposição à hipoxia, o que é necessário observar que muitas das alterações rapidamente-invertidas que ocorrem em 10,14 hipóxia. Este método proporciona uma fundação de base que pode ser facilmente modificado para as necessidades individuais de cada laboratório, incluindo sistemas de modelos diferentes e uma variedade de gases.

Este artigo detalha como usar contínuo fluxo de câmaras de hipóxia para gerar atmosferas com concentrações definidas de O<sub&gt; 2</sub&gt; Para entender as respostas biológicas à diminuição da O<sub&gt; 2</sub&gt;. Este sistema é fácil de configurar e manter, e flexível o suficiente para atender uma ampla gama de O<sub&gt; 2</sub&gt; Concentrações e sistemas modelo

Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na<em&gt; C. elegans</em

O oxigênio é essencial para a sobrevivência de todos os metazoários, com uma exceção conhecida1. A diminuição da disponibilidade de O2 (hipóxia) pode ocorrer durante estados patológicos, ...

O objetivo do seguinte experimento é montar e manter uma câmara de hipóxia utilizando um método de fluxo contínuo. Isso é conseguido mediante a obtenção e fabricação dos tubos, frascos e câmaras necessários para o procedimento. Como segundo passo, conecte o tanque de oxigênio e selecione a taxa de fluxo para criar o nível desejado de hipóxia.Hidrate o gás passando-o por um frasco de bolhas contendo água deionizada. Conecte o gás hidratado à câmara de hipóxia e coloque as amostras de teste na câmara para expô-las a condições hipóxicas. São obtidos resultados que mostram letalidade embrionária dependente de Hi F1 na hipóxia, com base na observação da viabilidade até a fase adulta.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como caixas de luvas, é que ela é fácil e barata para fabricar em laboratório e fornece uma concentração precisa e reprodutível de gases na câmara ambiental. Embora este método forneça informações sobre a resposta hipóxica no nematódeo C. elegans, ele também pode ser adaptado a outros sistemas, incluindo organismos modelo maiores e culturas celulares. Além disso, pode ser usado para estudar outros gases, incluindo dióxido de carbono e sulfeto de hidrogênio.Este protocolo demonstra como construir uma câmara de hipóxia. O gás é armazenado em cilindros de gás comprimido com concentrações definidas de oxigênio, e um regulador de dois estágios é acoplado. O gás entra pela parte inferior do tubo de fluxo e sai pelo topo na vazão correta.O gás então flui para o frasco de bolhas, hidratando o gás. O gás hidrogenado passa então para a câmara de hipóxia pela válvula de entrada, expondo as amostras à hipóxia. O gás finalmente é liberado no ambiente através de um orifício de exaustão perfurado na câmara.Um recipiente de cristalização de Pyrex ou uma caixa de flechas pode ser usado como corpo da câmara ambiental. O volume do recipiente deve ser mantido no mínimo, e o material deve ser impermeável a gases. Faça um furo em um dos lados do recipiente com uma broca de ponta de carbono ou diamante e instale um adaptador de mangueira plástica.Misture o epóxi antes da aplicação na caixa e no encaixe. Em seguida, repita o mesmo procedimento no lado oposto do recipiente, com o segundo orifício deslocado em relação ao primeiro. Para aumentar a mistura turbulenta, utilize um tubo de diâmetro externo de um oitavo de polegada, de FEP ou náilon, para conectar os tanques de gás comprimido a um dispositivo de controle de fluxo, como um controlador de fluxo de massa ou um medidor de rotor.Os tanques de gás devem conter concentrações definidas de oxigênio, equilibradas com nitrogênio, conforme um padrão certificado para teor de oxigênio ou para condições anóxicas. Para uso de nitrogênio puro, utilize um regulador de duas etapas, com a segunda etapa ajustada à pressão desejada. Consulte as instruções no protocolo escrito para selecionar uma taxa de fluxo apropriada.Em seguida, conecte a tubulação do regulador de duas etapas ao tubo de fluxo que controla a taxa de fluxo do gás que entra na câmara. As saídas do tubo de fluxo são conectadas a um frasco de lavagem de gases com cilindro fritado contendo água destilada. Em seguida, conecte a tubulação do outro lado do frasco de lavagem a uma das conexões da câmara ambiental.Isso irá umidificar o gás que entra na câmara ambiental. Use graxa para vácuo para selar a câmara. Em seguida, coloque pesos sobre a tampa da câmara para garantir um selamento hermético.Teste o selo mantendo uma pequena quantidade de água na palma da mão com luva contra o encaixe de escape de gás na câmara e verifique a presença de bolhas. Primeiro, gere populações sincronizadas de Elgan marinho. Coloque de um a 100 adultos GR em uma gota de solução alvejante alcalina sobre a superfície de uma placa de meio de crescimento para nematoides sem semeadura.Deixe a solução de hipoclorito penetrar no meio após um período de incubação de pelo menos oito horas. Transfira as larvas L1 sincronizadas para a placa semada com bactérias OP50 vivas. Alternativamente, permita que adultos GRA depositem ovos na placa por duas a três horas para gerar um grupo de vermes que se desenvolverão de forma sincronizada ou selecione larvas L4 de uma população mista para coletar embriões jovens.Na fase de duas a quatro células, utilize uma lâmina de barbear para cortar adultos de GR em um pequeno volume de água e, em seguida, transfira os embriões com uma pipeta de boca antes de transferir os vermes para a placa para exposição a condições hipóxicas. Coloque um anel de ácido palmítico a 10 miligramas por mililitro em etanol ao redor da borda das placas. Para impedir que os vermes escapem da superfície da placa de ágar.O ácido palmítico sairá da solução. À medida que o etanol evapora, formando uma barreira física para garantir uniformidade, certifique-se de substituir a água no frasco lava-gases antes da exposição na câmara ambiental. Após transferir os vermes para as placas, feche as placas na câmara ambiental, inicie o fluxo de gás e mantenha a exposição pelo tempo desejado para o ensaio.Para avaliar a viabilidade dos embriões até a fase adulta, permita que os vermes se desenvolvam por 48 horas após o retorno ao ar ambiente, momento em que deverão estar em estágio de larva quarta instar ou adultos de um dia; nesse ponto, avalie a viabilidade até a fase adulta. Para visualizar os vermes após exposição hipóxica, transfira-os para uma gota de M nove em uma lamínula quadrada de 22 milímetros e inverta sobre uma almofada de agarose 2% em M nove, se necessário.25 milimolar de amol ou 10 milimolar de azida de sódio podem ser usados como anestésicos. Alternativamente, após a exposição à hipóxia, a câmara ambiental transparente pode ser colocada diretamente sobre a platina de um microscópio estereoscópico. Duas vistas são mostradas, uma incluindo todo o conjunto de fluxo de gás.O outro apenas com a câmara sobre a platina do microscópio. Cultive vermes Bristol N2 em quatro placas de crescimento de 10 centímetros de diâmetro até que a maioria dos vermes esteja na fase adulta de GR. Lave os vermes para um tubo cônico de 15 mililitros com uma solução alcalina de hipoclorito na proporção de 1:5 e incube com rotação até que os vermes comecem a se dissolver.Não mais de cinco minutos. Lave os vermes três vezes com M nove, centrifugando a 1.500 × g entre cada lavagem, sem placa de ruptura. Coloque os embriões clorados em oito placas NGM de 150 milímetros e permita que os embriões se desenvolvam até larvas L4 por cerca de 48 horas.A 22 graus Celsius, transfira as placas para a câmara ambiental e exponha às condições hipóxicas e anóxicas por quatro horas ou pelo tempo especificado pelo delineamento experimental. Para coletar as amostras, remova rapidamente a tampa da câmara hipóxica. Retire uma placa de amostra e refeche a câmara, anotando o tempo e registrando os passos.Após remover os vermes da hipóxia, todo esse processo deve levar menos de dois minutos. Use água destilada para lavar os vermes para um filtro de náilon e, em seguida, despeje em um tubo cônico de 15 mililitros rotulado, contendo 100 microlitros de SDS 1% centrifugado. Os vermes em SDS são centrifugados em uma centrífuga de bancada a 1.500 × g por 15 a 20 segundos.Com uma pausa, use uma bomba de vácuo para remover a maior parte do sobrenadante do tubo, deixando o pellet de vermes intocado. Usando uma pipeta, transfira o pellet de vermes com um volume predeterminado de líquido para um tubo microfugão de 1,5 mL devidamente identificado. Se a amostra for utilizada para eletroforese SDS-PAGE, este tubo pode conter um volume igual de corante de carga proteica duas vezes concentrado. Feche bem o tubo e imerja-o em nitrogênio líquido.Repita até que todas as amostras tenham sido isoladas. Siga estes procedimentos para amostras de controle de ar ambiente; amostras de consistência podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius. Esta figura mostra a viabilidade de embriões expostos a 1000 partes por milhão de oxigênio, 5.000 partes por milhão de oxigênio e normoxia, em torno de 210.000 partes por milhão de oxigênio.Os embriões são expostos a cada condição por 24 horas em câmaras de oxigênio com fluxo contínuo. Os vermes foram transferidos para condições normóxicas, permitindo-se que se desenvolvessem até a fase adulta por 48 horas, e então foram avaliados quanto à viabilidade até a fase adulta. Após este procedimento, as amostras podem ser coletadas para análises subsequentes por Western blot, QPCR ou ensaios fisiológicos, como determinação de longevidade ou produção de prole.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como montar uma câmara de hipóxia de fluxo contínuo em seu próprio laboratório.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões

Este vídeo mostra um método para testar a hipóxia em larvas de Drosophila, avaliando suas habilidades de escavação e tunelamento. Usando essa técnica, os pesquisadores podem distinguir larvas com privação de oxigênio daquelas com déficits de desenvolvimento. O protocolo de exemplo demonstra a configuração para este ensaio.

drosófila Ensaio de escavação e tunelamento: um método para avaliar a hipóxia tecidual em larvas de moscas

Um protocolo é descrito que utiliza anoxia / inanição em C. elegans para modelo de isquemia / reperfusão. Os resultados funcionais incluem um aumento da mortalidade, anormalidades visíveis em processos neuronais marcado com GFP, e respostas comportamentais comprometidas que requerem a função neuronal.

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

C. elegans é normalmente cultivadas em placas de agar sólido ou em meio líquido semeadas com E. coli. Para evitar subprodutos bacterianos de confundir os estudos toxicológicos e nutricionais, utilizamos um meio líquido axênico, CEHR, para crescer e sincronizar um grande número de vermes para uma gama de aplicações a jusante.

A cultura Caenorhabditis elegans Em Axenic Liquid Media e Criação de transgênicos Worms por bombardeamento com micropartículas

Aqui detalhamos protocolos projetados especificamente para monitorar defeitos morfogênicos que ocorrem durante as fases inicial e tardia do alongamento embrionário do nematóide Caenorhabditis elegans. Em última análise, esses protocolos são projetados para identificar genes que regulam essas fases e caracterizar suas necessidades diferenciais ao longo do eixo ântero-posterior do embrião.

Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Apresentamos um novo sistema de câmara hipóxico para uso com organismos aquáticos, como embriões de sapos e zebrafish. Nosso sistema é simples, robusto, econômico e permite a indução e sustentação da hipoxia in vivo e até 48 h. Apresentamos 2 métodos reprodutíveis para monitorar a eficácia da hipoxia.

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

O protocolo descreve um ensaio simples para identificar larvas de Drosophila melanogaster que estão enfrentando a hipóxia sob os níveis de oxigénio atmosférico normal. Este protocolo permite hipóxicos larvas ser distinguido de outros mutantes que mostram fenótipos sobrepostos como lentidão ou crescimento lento.

Um ensaio de buraqueira/Tunneling para deteção de hipóxia em larvas de Drosophila melanogaster

Respiração mitocondrial é fundamental para a sobrevivência; Portanto, a taxa de consumo de oxigênio é um excelente indicador de saúde mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos a utilização de um respirometer comercialmente disponível para medir basal e taxas de consumo máximo de oxigênio em viver, intacto e livremente motile Caenorhabditis elegans.

Medição das taxas de consumo de oxigênio em intacta Caenorhabditis elegans

Os efeitos trans e multigeracionais dos produtos químicos persistentes são essenciais para julgar as suas consequências a longo prazo no ambiente e na saúde humana. Nós fornecemos métodos detalhados novos para estudar efeitos trans e multi-Generational usando elegans da Caenorhabditisdo nematóide da livre-vida.

Usando Caenorhabditis elegans para estudar trans-e multi-Generational efeitos de toxicants

Aqui, caracterizamos as respostas de estresse proteotóxico celular no nematoide C. elegans medindo a ativação de repórteres transcritores fluorescentes e atribuindo sensibilidade ao estresse fisiológico.

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

Este estudo apresenta protocolos para duas abordagens semi-automatizadas de análise de atividade locomotor em C. elegans complexo I disease gas-1(fc21) worms, ou seja, ZebraLab (um ensaio de rendimento médio) e WormScan (um ensaio de alto rendimento) e fornecem análise comparativa entre uma ampla gama de métodos de pesquisa para quantificar o comportamento nematoides e função neuromuscular integrada.

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Aprenda a criar câmaras de hipóxia com fluxo contínuo para estudar efeitos da baixa oxigenação em C. elegans. Este método permite controlar precisamente concentrações de O₂ e investigar letalidade embrionária dependente de Hi F1.

Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na

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