Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na C. elegans

O objetivo do experimento a seguir é configurar e manter uma câmara de hipóxia usando um método de fluxo contínuo. Isso é conseguido obtendo e fabricando os tubos, frascos e câmaras necessários para o procedimento. Como segunda etapa, conecte o tanque de oxigênio e selecione a taxa de fluxo para criar o nível desejado de hipóxia.

Hidrate o gás passando-o por um frasco de bolha cheio de água deionizada. Conecte o gás hidratado à câmara de hipóxia e coloque as amostras de teste na câmara para expô-las a condições hipóxicas. Obtém-se resultados que mostram letalidade embrionária dependente de Hi F1 em hipóxia com base na observação da viabilidade para a idade adulta.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como porta-luvas, é que é fácil e barata de fabricar em laboratório e fornece uma concentração precisa e reprodutível de gases na câmara ambiental. Embora este método forneça informações sobre a resposta hipóxica na elegância do nematóide C, ele também pode ser adaptado a outros sistemas, incluindo organismos modelo maiores e cultura de células. Além disso, pode ser usado para estudar outros gases, incluindo dióxido de carbono e sulfeto de hidrogênio.

Este protocolo demonstra como construir uma câmara de hipóxia. O gás é armazenado em tanques de gás comprimido com concentrações de oxigênio definidas e um regulador de dois estágios é conectado. O gás entra na parte inferior do tubo de fluxo, saindo da parte superior na vazão correta.

O gás então flui para o frasco de bolhas hidratando o gás. O hidrogás então passa para a câmara de hipóxia na válvula de entrada, expondo as amostras à hipóxia. O gás finalmente sai para a sala através de um orifício de exaustão perfurado na câmara.

Um prato de cristalização Pyrex ou em uma caixa de pacote de setas pode ser usado como o corpo da câmara ambiental. O volume do recipiente deve ser reduzido ao mínimo e o material deve ser impermeável ao gás. Faça um furo em um lado do recipiente com uma ponta de carbono ou diamante, perfure e encaixe com um encaixe de farpa de mangueira de plástico.

Misture o epóxi antes de aplicar na caixa e no encaixe. Em seguida, repita o mesmo procedimento no lado oposto do recipiente com o segundo orifício deslocado do primeiro. Para aumentar a mistura turbulenta, use um diâmetro externo de oito polegadas, FEP ou tubulação de náilon para conectar os tanques de gás comprimido a um dispositivo de controle de fluxo, como um controlador de fluxo de massa ou um medidor de rotor.

Os tanques de gás devem ter concentrações de oxigênio definidas equilibradas com nitrogênio que um padrão certificado para o teor de oxigênio ou para condições anóxicas. O nitrogênio puro usa um regulador de dois estágios com o segundo estágio ajustado para a pressão desejada. Consulte as instruções no protocolo escrito para selecionar uma taxa de fluxo apropriada.

Em seguida, conecte a tubulação do regulador de dois estágios ao tubo de fluxo que controla a vazão do gás que entra na câmara. As saídas do tubo de fluxo são conectadas a uma garrafa de lavagem de gás com cilindro frito contendo água destilada. Em seguida, conecte o tubo do outro lado do frasco de lavagem a uma das conexões na câmara ambiental.

Isso hidratará o gás que entra na câmara ambiental. Use graxa a vácuo para selar a câmara. Em seguida, coloque pesos na tampa da câmara para garantir uma vedação hermética.

Teste a vedação segurando uma pequena quantidade de água na palma da mão enluvada no encaixe de exaustão de gás na câmara e verificando se há bolhas. Primeiro, gere populações sincronizadas de Elgan do mar. Coloque de um a 100 adultos GR em uma gota de solução alcalina de alvejante na superfície de uma placa de meio de crescimento de nematóides sem sementes.

Deixe a solução de alvejante ser absorvida pela placa após um período de incubação de pelo menos oito horas. Transfira as larvas sincronizadas de L one para uma placa semeada com bactérias OP 50 vivas. Como alternativa, permita que os adultos GRA ponham ovos no prato por duas a três horas para gerar um grupo de vermes que se desenvolverão de forma síncrona ou colhem L quatro larvas de uma população mista para coletar embriões jovens.

No estágio de duas a quatro células, use uma lâmina de barbear para cortar adultos GR em um pequeno volume de água e, em seguida, transfira os embriões por pipeta oral antes de transferir os vermes para a placa para exposição a condições hipóxicas. Coloque um anel de 10 miligramas por mililitro de ácido palmítico em etanol ao redor da borda das placas. Para evitar que os vermes escapem da superfície da placa de ágar.

O ácido palmítico sairá da solução. À medida que o etanol evapora formando uma barreira física para garantir a uniformidade, certifique-se de substituir a água na garrafa de lavagem de gás antes da exposição na câmara ambiental. Depois de transferir os vermes para as placas, sele as placas na câmara ambiental, inicie o fluxo de gás e mantenha a exposição pelo tempo desejado para o ensaio.

Para a viabilidade dos embriões até a idade adulta, permita que os vermes se desenvolvam 48 horas após o retorno ao ar ambiente, momento em que deveriam estar. Larvas do quarto estágio ou adultos de um dia pontuam para viabilidade até a idade adulta. Para visualizar a exposição hipóxica dos vermes, transfira os vermes para uma gota de M nove em uma lamínula quadrada de 22 milímetros e inverta em uma almofada de 2%aros em M nove, se necessário.

25 milimolares de amol ou 10 milimolares de azida sódica podem ser usados como anestésicos. Alternativamente, após a exposição à hipóxia, a câmara ambiental transparente pode ser colocada diretamente no palco de um escopo de dissecação. Duas visualizações são mostradas, uma, incluindo toda a configuração do fluxo de gás.

O outro com apenas a câmara no estágio do microscópio. Cultive Bristol N dois vermes em quatro placas de crescimento de 10 centímetros de altura até que a maioria dos vermes sejam adultos GR. Lave os vermes em um tubo cônico de 15 mililitros com uma solução alcalina de alvejante de um a cinco e incube com rotação até que os vermes comecem a se dissolver.

Não mais do que cinco minutos. Lave as minhocas três vezes com M nove girando a 1.500 vezes G entre cada lavagem sem quebrar a placa. Os embriões branqueados em placas NGM de 8 150 milímetros permitem que os embriões se desenvolvam em larvas L quatro por cerca de 48 horas.

A 22 graus Celsius, mover as placas para a câmara ambiental e expô-las a condições hipóxicas e anóxicas por quatro horas ou pela duração especificada pelo projeto experimental. Para colher amostras rapidamente, remova a tampa da câmara hipóxica. Pegue uma placa de amostra e feche novamente o tempo da câmara e registre as etapas.

Depois de remover os vermes da hipóxia, todo esse processo deve levar menos de dois minutos. Use água destilada para lavar as minhocas em um filtro de náilon e, em seguida, despeje em um tubo cônico rotulado de 15 mililitros contendo 100 microlitros de centrífuga 1% SDS. Os vermes no SDS em uma centrífuga de mesa são 1.500 vezes G por 15 a 20 segundos.

Com a pausa, use um aspirador para remover a maior parte do supinato do tubo, deixando o pellet de minhoca intocado. Usando uma pipeta, transfira o pellet de minhoca com um volume predeterminado de líquido para um tubo de micro lixo rotulado de 1,5. Se a amostra for usada para a página SDS, este tubo pode conter um volume igual de duas vezes o corante de carga de proteína, selar o tubo e mergulhar em nitrogênio líquido.

Repita até que todas as amostras tenham sido isoladas. Siga estes procedimentos para amostras de controle de ar doméstico para consistência As amostras podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius. Este número mostra a viabilidade de embriões expostos a 1000 partes por milhão de oxigênio, 5.000 partes por milhão de oxigênio e normóxia em torno de 210.000 partes por milhão de oxigênio.

Os embriões são expostos a cada condição por 24 horas em câmaras de oxigênio de fluxo contínuo. Os vermes foram movidos para condições normóxicas, permitiram que se desenvolvessem até a idade adulta por 48 horas e, em seguida, pontuaram a viabilidade até a idade adulta. Após este procedimento, as amostras podem ser coletadas para análise subsequente por Western blot QPCR ou ensaios fisiológicos, como vida útil ou produção de progênie.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como configurar uma câmara de hipóxia de fluxo contínuo em seu próprio laboratório.