Name: Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a montar complexos macromoleculares de sinalização CFTR dependentes de PDZ in vitro usando proteínas de fusão recombinantes purificadas. Este método permite detectar e visualizar diretamente a formação de complexos proteicos.

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Nosso trabalho foi suportado por concessões do American Heart Association (Grande Afiliado Sudeste) A partir de doações em ajuda-0765185B, a Elsa U. Pardee Foundation bolsa de investigação, e Wayne State University fundo de inicialização intramural e Cardiovascular Research Institute prêmio Iniciativa de Isis. Este método de in vitro conjunto complexo macromolecular CFTR foi originalmente pioneira pelo Dr. AP Naren (University of Tennessee Health Science Center).

1. Expressão e Purificação de Proteínas de Fusão recombinantes Tagged em bactérias <ol><li> Amplificar regiões definidas do C-caudas (os últimos 50-100 aminoácidos contendo os motivos PDZ em C-terminal) para CFTR, LPA 2, MRP2, MRP4, β 2 AR, e NHERFs (comprimento completo ou PDZ1 ou PDZ2 domínios ) por metodologia de PCR. </li><li> Clonar os produtos de PCR em pGEX4T-1 vector para GST-proteínas de fusão (tal como GST-NHERFs, GST-MRP4 CT), pMAL-C2 vector para MBP de fusão de proteínas (tais como MBP-β 2 AR CT, MBP-CFTR CT ), e pET30 para His-S-proteínas de fusão (como o seu-S-CFTR CT, His-S-PDZK1). </li><li> Transformar num E. protease deficiente coli estirpe (BL21-DE3) para minimizar a degradação da proteína recombinante possível. </li><li> Crescer a cultura durante a noite a 37 ° C em meio Luria-Bertani meio (pH 7,0) contendo antibióticos apropriados (tais como a ampicilina ou canamicina). Dilui-se a cultura durante a noite a 1:10 e crescer durante mais 2 h, a 37 ° C. Emduzir com 0,5-1 m M IPTG para a próxima 4 horas a 30 ° C. Sedimentar as células por centrifugação a 8000 × g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Lisar as células em tampão de sacarose (50 m M de Tris-HCl, pH 8,0, 1 m M de EDTA, 1 m M de PMSF, e 10% de sacarose) contendo lisozima (1 mg / mL), Triton 0,2% X-100, e protease inibidores. Use 20 mL de sedimento de células proveniente de 1 L de cultura. </li><li> Misturar num agitador rotativo durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Girar a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Recolher o sobrenadante claro. </li><li> Para o sobrenadante claro, adicionar 1 mL de resina nas seguintes / agarose (suspensão de 50% em tampão de sacarose): <ul><li> Pérolas de glutationa agarose para proteínas de fusão GST. </li><li> Contas Talon para His-S proteínas de fusão. </li><li> Amilose resina para proteínas de fusão MBP. </li></ul></li><li> Mistura-se durante 4 horas a 4 ° C em um agitador rotativo. </li><li> Lavar os grânulos por ressuspensão em PBS 1x (15 mL), misturando durante 2 min, girando a 800 × g durante 2 min, e descartar o sobrenadante. Repita este passo para seis vezes. </li><li> Eluir a proteína a partir das pérolas usando tampão de eluição respectivo (2 mL de tampão de eluição por 1 ml de esferas). <ul><li> Tampão de eluição para as proteínas de fusão GST: 25 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 140 m M de NaCl, e 20 m M glutationa reduzida. </li><li> Tampão de eluição de proteínas sua fusão: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 500 m M de NaCl, e 200 m M imidazol. </li><li> Tampão de eluição para proteínas de fusão MBP: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 200 m M de NaCl, 1 m M de EDTA, 1 m M de DTT, e 10 m M maltose. </li></ul></li><li> Dialisar as proteínas eluídas contra 2 L de 1x PBS a 4 ° C (para evitar a degradação da proteína possível). Alterar PBS a cada 4 horas, durante quatro vezes. Concentra-se a proteína utilizando um filtro de Centricon (10.000 cutoff MW, Millipore) e armazenada como pequenas alíquotas a -80 ° C. </li><li> Detarminho concentração da proteína pelo método de Bradford. Avaliar a qualidade de proteína por SDS-PAGE utilizando BSA como padrão. Se a integridade da proteína não for satisfatório, os processos de purificação secundários, tais como filtração em gel ou de permuta iónica podem ser utilizados. (Por exemplo, utilizou-se um G-75 coluna de Sepharose para purificar ainda mais GST-proteína de fusão). </li></ol> 2. Cultura de Células e Preparação lisado celular <ol><li> Cultura rim de hamster bebé (BHK) que de forma estável sobre-expresso CFTR-wt e CFTR-his10 ou células BHK que transitoriamente sobre-express-Flag LPA 2-peso ou Bandeira-LPA 2-ΔSTL e Madin-Darby rim canino (MDCK ) as células que expressam de forma estável sobre-MRP2 em meio essencial mínimo de Eagle (MEM) contendo 10% de soro fetal de vitelo e penicilina / estreptomicina em frascos de poliestireno a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Cultura de rim embrionário humano 293 (HEK293) células que de forma estável sobre-expresso CFTR-wt e CFTR-his10 em Dulbecco&#39;Média s modificado de Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e penicilina / estreptomicina, em frascos de poliestireno a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Lisar as células em tampão de lise (PBS - 0,2% de Triton-X-100 suplementado com uma mistura de inibidores de protease contendo 1 M de fluoreto de fenilmetilsulfonil m, 1 ug / ml de aprotinina, 1 ug / mL de leupeptina, 1 ug / mL de pepstatina); utilização 500 uL de tampão de lise para cada placa de Petri de 60 mm, e 1000 uL de tampão de lise para cada placa de Petri de 100 mm. </li><li> Balançar a célula lisados ​​durante 20 min a 4 ° C, e remover o material insolúvel por centrifugação a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Determinar a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford. </li></ol> 3. Em Assembléia Vitro de um complexo macromolecular contendo CFTR (CFTR-PDZK1-MRP4) <ol><li> Em 200 uL de tampão de lise (PBS - 0,2% de Triton-X 100 + inibidores da protease), adicionar 20 ug de GST-purificada MRP4-C-terminal50 aa (CT50) proteína de fusão. </li><li> Adicionar várias quantidades (0-40 ug) de Purificou His-S-PDZK1 proteína de fusão. </li><li> Misturar as duas proteínas num misturador rotativo a 22 ° C durante 1-2 h. </li><li> Adicionar 20 pérolas de glutationa microlitro (50% de lama) na mistura de proteínas, e continuar a misturar por mais 1 h. Este passo é também referido como pares de ligação. </li><li> Durante este tempo, preparar os lisados ​​de células HEK293 que superexpressam a bandeira-CFTR (em peso) como acima descrito no Passo 2). </li><li> Lavar o complexo duas vezes com tampão de lise. Girar a 800 × g durante 1 min para cada lavagem e aspirar cuidadosamente o sobrenadante após cada lavagem. Tenha cuidado para não sugar as contas no fundo. </li><li> Adicionar os preparados acima HEK293 lisados ​​de células para os grânulos, e misturar suavemente a 4 ° C durante 3 h (ou durante a noite). </li><li> Lavar os grânulos extensivamente três vezes com tampão de lise, conforme descrito no Passo 3,6). </li><li> Eluir as proteínas utilizando 30 uL Tampão de amostra (5 ×): 0,6 M<html> Tris-HCl (pH 6,8), glicerol a 50%, SDS a 2%, e 0,1% de azul de bromofenol; contendo 5% de β-mercaptoetanol. </li><li> Incubar a 37 ° C banho de água durante 10-15 min, e giram a 5000 × g durante 30 s para precipitar os grânulos. </li><li> Carregar todo o eluído em gel de 4-15%. </li><li> Executar SDS-PAGE para cerca de 30-40 min. </li><li> Transferir bandas de proteína para a membrana PVDF, durante 1,5 horas. </li><li> Bloquear a membrana em TBS-Tween contendo gordura do leite a 5% não. </li><li> Incubar a membrana com o anticorpo primário (tais como anti-CFTR IgG, R1104) a 4 ° C, durante a noite. </li><li> Lava-se a membrana com TBS-Tween durante 5 min, seis vezes. </li><li> Incubar a membrana com anticorpo secundário (tal como o anticorpo de cabra anti-rato conjugado com HRP nd 2) durante 45 min a 22 ° C. </li><li> Lava-se a membrana com TBS-Tween durante 5 min, seis vezes. </li><li> Visualizar as bandas de proteínas através de ECL. </li><li> Os dados representativos são mostrados na Figura 1. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. resultados representativos Um exemplo de CFTR contendo complexo macromolecular de sinalização que foi montado in vitro é mostrado na Figura 1. Um complexo macromolecular foi formado entre MRP4 C-terminal 50 aminoácidos (MRP4-CT50) e PDZK1, e de comprimento completo CFTR (Figura 1, parte inferior). A formação do complexo aumentou dose-dependente com quantidades crescentes de proteína do intermediário, PDZK1 (Figura 1, parte inferior) 18. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4091/4091fig1.jpg" /> Figura 1. Uma representação pictórica do ensaio complexo macromolecular (topo). Um complexo macromolecular foi detectada in vitro com três proteínas (GST-MRP4-CT50, His-S-PDZK1, e-Flag CFTRwt) de uma forma dependente da dose (inferior) 18. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; CFTR-NHERF1-β 2 AR (ref. 14) </td><td> CFTR-NHERF2-LPA 2 (ref. 15) </td><td> CFTR-PDZ proteínas-MRP 2 (ref. 17) </td><td> CFTR-PDZK1-MRP4 (ref. 16) </td></tr><tr><td> Contas de afinidade </td><td> Resina de amilose </td><td> S-proteína de agarose </td><td> Resina de amilose </td><td> Glutationa agarose </td></tr><tr><td> Purificou-proteína-1 </td><td> MBP β-2 AR CT </td><td> His-S-CFTR CT </td><td> MBP-CFTR CT </td><td> GST-MRP4 CT </td></tr><tr><td> Purificou-2 de proteína </td><td> GST-NHERF1 </td><td> GST-NHERF2 </td><td> GST-PDZ proteínas </td><td> His-S-PDZK1 </td></tr><tr><td> Proteína purificada-3 (ou lisados ​​de células) </td><td> CFTR-wt ou CFTR-his10 (BHK ou lisados ​​de células HEK) </td><td> BandeiraLPA-2-em peso ou bandeira-LPA 2-ΔSTL (lisados ​​de células BHK) </td><td> MRP2 (lisados ​​de células MDCK) </td><td> Purificou-Flag CFTR-wt ou CFTR-his10 (ou lisados ​​de células) </td></tr><tr><td> Anticorpo </td><td> Anti-IgG CFTR </td><td> Anti-Flag HRP </td><td> Anti-IgG MRP2 </td><td> Anti-Flag HRP </td></tr></tbody></table> Resumo Tabela 1. De vários complexos de CFTR contendo macromoleculares montadas in vitro.

<ol><li>Anderson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+that+CFTR+is+a+chloride+channel+by+alteration+of+its+anion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity.</a> Science. 253, 202-205 (1991).</li>
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<li>Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+activates+aquaporin+3+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).</li>
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<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CFTR+chloride+channels+by+syntaxin+and+Munc18+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms.</a> Nature. 390, 302-305 (1997).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+1A+is+expressed+in+airway+epithelial+cells%2C+where+it+modulates+CFTR+Cl%28-%29+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents.</a> J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macromolecular+complex+of+beta+2+adrenergic+receptor%2C+CFTR%2C+and+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin-binding+phosphoprotein+50+is+regulated+by+PKA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).</li>
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<li>Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).</li>
<li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CFTR+Interactome+in+the+Macromolecular+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes.</a> Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine+receptor+CXCR2+macromolecular+complex+regulates+neutrophil+functions+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste protocolo que demonstraram um método para a montagem in vitro e detecção de um complexo macromolecular CFTR contendo sinalização utilizando proteínas purificadas (ou fragmentos de proteínas) e / ou lisados ​​celulares como relatado anteriormente 16-19,29,30. Para alcançar melhores resultados os seguintes pontos críticos durante o processo de preparação requerem especial atenção: <ul><li> É importante que o pH do tampão de eluição ser ajustado para 8,0 após a adição de glutationa reduzida qu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> pGEX4T-1 vector </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td> anteriormente Amersham Biosciences </td></tr><tr><td> pMAL-C2 vector </td><td> New England Biolabs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> pET30 vector </td><td> Merck Química </td><td> 69077-3 </td><td> anteriormente Novagen </td></tr><tr><td> Esferas de agarose de glutationa </td><td> BD Biosciences </td><td> 554780 </td><td></td></tr><tr><td> Resina de amilose </td><td> New England Biolabs </td><td> E8021S </td><td></td></tr><tr><td> Contas Talon </td><td> Clontech </td><td> 635501 </td><td></td></tr><tr><td> glutationa reduzida </td><td> BD Biosciences </td><td> 554782 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> imidazol </td><td> Pescador </td><td> BP305-50 </td><td></td></tr><tr><td> maltose </td><td> Pescador </td><td> BP684-500 </td><td></td></tr><tr><td> S-proteína de agarose </td><td> Merck Química </td><td> 69704-3 </td><td> anteriormente Novagen </td></tr><tr><td> Anti-Flag HRP </td><td> Sigma </td><td> A8592 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-IgG CFTR </td><td> Feito sob encomenda </td><td> R1104 </td><td> mAb reconhecendo CFTR epítopo em aa 722-734 </td></tr><tr><td> Anti-IgG MRP2 </td><td> Chemicon International </td><td> MAB4148 </td><td> Agora uma parte da Millipore </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes específicos e equipamentos.

análise in vitro de pdz-dependentes complexos macromoleculares cftr sinalização

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

A fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR), um canal de cloreto localizados principalmente nas membranas apicais das células epiteliais, desempenha um papel crucial na homeostasia de fluidos transepitelial 1-3. CFTR tem sido implicado em duas doenças principais: fibrose cística 4 (CF) e secretora diarreia 5. Na FC, a síntese ou a actividade funcional do CFTR Cl-canal é reduzida. Esta doença afecta cerca de 1 em 2500 caucasianos nos Estados Unidos 6. Actividade CFTR excessiva também tem sido implicado em casos de toxina induzida por diarreia secretória (por exemplo, por toxina da cólera e enterotoxina calor coli estável E.) que estimula a produção de cAMP ou cGMP no intestino 7. Evidências sugerem a existência de interações físicas e funcionais entre CFTR e um número crescente de outras proteínas, incluindo os transportadores, canais iônicos, receptores, quinases, fosfatases, sinalmoléculas ing, e os elementos do citoesqueleto, e estas interacções entre CFTR e as suas proteínas de ligação têm sido mostrados para ser criticamente envolvidos na regulação mediada por CFTR transporte de iões transepitelial in vitro e também in vivo 8-19. Neste protocolo, vamos nos concentrar apenas sobre os métodos que auxiliam no estudo das interações entre CFTR cauda carboxilo terminal, que possui um motivo de ligação às proteínas [referido como PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motivo], e um grupo de andaime proteínas, que contêm um módulo de ligação específica referida como domínios PDZ. Até agora, várias proteínas diferentes PDZ andaime têm sido relatados para se ligar ao terminal carboxilo da cauda de CFTR, com afinidades diferentes, tais como NHERF1 e NHERF2 e PDZK1 e PDZK2, CAL (CFTR-associated ligando), Shank2, e agarrar 20-27. O motivo PDZ dentro CFTR que é reconhecido pelo PDZ andaime proteínas são os últimos quatro aminoácidos no terminal C (ie, 1477-DTRL-1480 em CFTR humano) 20. Curiosamente,CFTR pode ligar mais do que um domínio PDZ de ambos os NHERFs e PDZK1, embora com diferentes afinidades 22. Este multivalência com respeito à ligação CFTR foi mostrado para ser de importância funcional, sugerindo que as proteínas PDZ andaime pode facilitar a formação de complexos macromoleculares CFTR sinalização para a sinalização específicas / selectiva e eficaz em células 16-18. Vários ensaios bioquímicos têm sido desenvolvidos para estudar CFTR-envolvendo interacções proteína, tais como co-imunoprecipitação, suspenso ensaio, pares ensaio de ligação, por pares de ensaio colorimétrico de ligação, e doseamento macromolecular montagem complexa 16-19,28,29 . Aqui vamos nos concentrar sobre os procedimentos detalhados de montagem de um PDZ motivo dependente da CFTR macromolecular contendo complexo in vitro, que é usado amplamente por nosso laboratório para estudar proteína-proteína ou domínio domínio interações envolvendo CFTR 16-19,28,29.

A fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR), um canal de cloreto epitelial, tem sido relatado para interagir com várias proteínas e regulam importantes processos celulares, entre eles os CFTR PDZ motivo mediadas-interacções têm sido bem documentados. Este protocolo descreve métodos desenvolvidos para montar um macromolecular CFTR PDZ-dependente sinalização complexo<em&gt; In vitro</em&gt;.

Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização

O regulador de condutância transmembrana da fibrose cística (CFTR), um canal de cloreto localizado principalmente nas membranas apicais de células epiteliais, desempenha um...

O objetivo geral deste procedimento é montar um complexo sinalizador macromolecular dependente de PDZ do regulador da condutância transmembranar da fibrose cística, ou CFTR, in vitro. Para isso, proteínas de fusão marcadas recombinantes são expressas em bactérias e purificadas. Em seguida, lisados celulares são obtidos a partir de culturas que expressam CFTR ou proteínas que se ligam ao CFTR.Em seguida, o CFTR e as proteínas ligantes são combinados in vitro para montar o complexo sinalizador macromolecular contendo CFTR. É então realizada a eletroforese em gel e transferência para membrana (Western blotting), que demonstra a formação de complexos macromoleculares de CFTR e é posteriormente avaliada por meio de Western blotting. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que podemos detectar e visualizar diretamente a formação de um complexo macromolecular individual de alta massa proteica contendo CFTR.Portanto, este método pode fornecer informações sobre a formação de complexos macromoleculares contendo CT R. Também pode ser aplicado na montagem de complexos não proteicos que não envolvem CFTR, como o complexo sinalizador macromolecular sexo C dois. Mai

in-vitro-analysis-pdz-dependent-cftr-macromolecular-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A célula permeável reticulador DSP [dithiobis (succinimidyl propionato)] estabiliza interações transitória e...

Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

Para testar a interação de uma proteína com o seu alvo de lipídios foi utilizado MACS e anexina V conjugada esferas magnéticas e vesículas de lipídios sintetizados a partir de lipídios alvo e fosfatidilserina anexina V vinculativo. Proteínas vinculado à lipídica alvo são co-purificados e analisados ​​após eluição dos grânulos.

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

Um procedimento eficiente para avaliar a propensão oligomerização de domínios de uma única passagem transmembrana (DTM) é descrito. Proteínas quiméricas que consiste na DTM fundido a ToxR são expressos em uma cepa de E. coli repórter. DTM induzida por oligomerização causas dimerização de ToxR, a ativação de transcrição e de produção da proteína repórter, galactosidase.

Transmembrana Propensão Oligomerização Domínio determinado pelo Assay ToxR

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular fornece um método quantitativo de alto rendimento para estudar a interação proteína-proteína. Esta metodologia pode ser aplicada ao mapeamento de locais de ligação de proteína e para o rastreio de factores que regulam a interacção proteína-proteína.

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

A expressão heteróloga e purificação da fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR) são desafios significativos e fatores limitantes para o desenvolvimento de drogas terapêuticas para a fibrose cística. Este protocolo descreve dois métodos para o isolamento de quantidades de miligrama de CFTR adequados para estudos funcionais e estruturais.

Purificação da fibrose cística condutância transmembrana Regulador proteína expressa em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Descrito aqui é um procedimento rápido e eficaz para a reconstituição funcional da purificado do tipo selvagem e proteína CFTR mutante que preserva a atividade para este canal de cloro, que está com defeito na Fibrose Cística. Efluxo de iodeto de proteoliposomes reconstituídos mediadas por CFTR permite estudos da atividade do canal e os efeitos de pequenas moléculas.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

Aqui nós apresentamos um protocolo para monitorar a montagem e desmontagem da toxina antraz usando interferometria biolayer (BLI). Na sequência de montagem/desmontagem na superfície biosensor, os grandes complexos de proteínas são liberados da superfície para visualização e identificação dos componentes dos complexos usando microscopia eletrônica e espectrometria de massa, respectivamente.

Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

Nós fornecemos um protocolo para in vitro ensaios de auto-organização da mente e da minha em uma bicamada lipídica suportados numa câmara aberta. Além disso, descrevemos como delimitar o ensaio em lipídios-folheados microcompartments PDMS para imitar as condições na vivo por confinamento de reação.

In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Aqui descrevemos um protocolo para um método de pulso-perseguição geral que permite a análise cinética de dobramento, transporte e degradação de proteínas a serem seguidos em células vivas.

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Este protocolo apresenta um método para medir a ligação de adenina nucleotídica a receptores em tempo real em ambiente celular. A ligação é medida como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre derivados de nucleotídeos trinitrofenila e proteínas marcadas com um aminoácido fluorescente não canônico.

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

Aprenda a montar complexos macromoleculares de sinalização CFTR dependentes de PDZ in vitro usando proteínas de fusão recombinantes purificadas. Este método permite detectar e visualizar diretamente a formação de complexos proteicos.

Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização

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