Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização

O objetivo geral deste procedimento é montar um complexo sinalizador macromolecular dependente de PDZ do regulador da condutância transmembranar da fibrose cística, ou CFTR, in vitro. Para isso, proteínas de fusão marcadas recombinantes são expressas em bactérias e purificadas. Em seguida, lisados celulares são obtidos a partir de culturas que expressam CFTR ou proteínas que se ligam ao CFTR.

Em seguida, o CFTR e as proteínas ligantes são combinados in vitro para montar o complexo sinalizador macromolecular contendo CFTR. É então realizada a eletroforese em gel e transferência para membrana (Western blotting), que demonstra a formação de complexos macromoleculares de CFTR e é posteriormente avaliada por meio de Western blotting. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que podemos detectar e visualizar diretamente a formação de um complexo macromolecular individual de alta massa proteica contendo CFTR.

Portanto, este método pode fornecer informações sobre a formação de complexos macromoleculares contendo CT R. Também pode ser aplicado na montagem de complexos não proteicos que não envolvem CFTR, como o complexo sinalizador macromolecular sexo C dois. Mais recentemente, utilizando este mesmo método, demonstramos que nosso quimiorreceptor CXCR dois forma fisicamente um complexo proteico com o efeito downstream.

PRC beta três media a nervura selvagem um em neutrófilos utilizando PCR. Amplifique o DNA que codifica os últimos 50 a 100 aminoácidos contendo os motivos PDZ no extremo C. Para o transportador CAMP, MRP quatro e o domínio PDZ um do fator regulador do trocador sódio-hidrogênio ou N-H-E-R-F.

Em seguida, clone os quatro produtos de PCR do RP em PGE X quatro T um para gerar proteínas de fusão GST e o domínio PDZ um de N-H-E-R-F em PET 30. Para gerar proteínas de fusão com hiss s, transforme as bactérias por choque térmico. Em meio SOC, em uma linhagem de e coli deficiente em protease, cultive o cultivo durante a noite a 37 graus Celsius em um incubador com agitação, em 50 mililitros de meio LB contendo os antibióticos apropriados para o vetor.

No dia seguinte, dilua o cultivo em uma proporção de um para 10 em 500 mililitros de meio Luria Bertani, então incube o cultivo novamente sob agitação a 37 graus Celsius por duas horas. Induza a transcrição da proteína recombinante com 0,5 a um milimolar de IPTG por quatro horas a 30 graus Celsius.

Após a incubação, transfira as culturas para tubos de centrífuga de 250 mililitros e pelote as células por centrifugação a 8.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e adicione 20 mililitros de tampão de sacarose contendo lisozima, 1 miligrama por mililitro de 0,2% Triton X-100 e inibidores de protease para lisar as células. Transfira a suspensão bacteriana para um tubo de centrífuga de 50 mililitros limpo.

Agite em um agitador rotativo por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue a 20.000 ×g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, o sobrenadante estará claro e um pellet insolúvel visível estará presente no fundo do tubo.

Colete o sobrenadante claro em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, ao sobrenadante, adicione um mililitro da resina apropriada. Perlas de aerogel suspensas como uma suspensão a 50% em tampão de sacarose glutatião.

As microesferas Aero devem ser usadas para proteínas de fusão GST e as microesferas Talon para proteínas de fusão His-S. Incube por quatro horas a quatro graus Celsius em agitador rotativo. Em seguida, centrifugue as microesferas a 800 × g por dois minutos.

Em seguida, lave-os por ressuspensão, suspendendo-os em 15 mililitros de PBS e misturando-os em um agitador rotativo durante dois minutos. E, por fim, descarte o sobrenadante. Repita o passo seis vezes após a sexta lavagem.

Para eluir a proteína das perolas, adicione dois mililitros do tampão de eluição apropriado para cada um mililitro de perolas e misture por 10 minutos à temperatura ambiente. Despeje toda a proteína eluída com as perolas em uma coluna e colete o fluxo que passa como proteína eluída. Em seguida, transfira a proteína UD para um tubo de diálise.

Dialise as proteínas eluídas contra dois litros de PBS sob agitação a quatro graus Celsius. Troque o PBS a cada quatro horas por quatro vezes após a diálise. Concentre a proteína para 0,5 a um mililitro.

Utilizando um filtro centrífugo com corte de 10.000 megawatts. Aliquotar a amostra em 200 microlitros cada. Guardar uma para análise e colocar as demais a menos 80 graus Celsius para armazenamento.

Determine a concentração proteica pelo método de Bradford. Avalie a qualidade da proteína por eletroforese em gel de SDS usando padrões de BSAS. Se a integridade da proteína não for satisfatória, procedimentos de purificação secundários, como filtração em gel ou troca iônica, podem ser utilizados.

Células HEK 293 que expressam CFTR com flag do tipo selvagem devem ser cultivadas conforme descrito no documento anexo. Remova o meio das células e lave com PBS. Em seguida, para lisar as células, adicione 500 microlitros de tampão de lise para cada placa de cultura de 60 milímetros e agite os lisados celulares durante 20 minutos a quatro graus Celsius.

Transfira os lisados para novos tubos de microcentrífuga. Em seguida, para remover as proteínas insolúveis, centrifugue a 16.000 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius e colete os sobrenadantes. Determine a concentração proteica pelo ensaio de Bradford para montar os complexos macromoleculares contendo CFTR in vitro.

Inicie combinando 20 microgramas da proteína de fusão purificada G-S-T-M-R-P quatro com os 50 aminoácidos C terminais e quantidades crescentes variando de zero a 40 microgramas da proteína de fusão purificada hiss S PD zk um em 200 microlitros de tampão de lise em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Misture as duas proteínas em um agitador rotativo a 22 graus Celsius por um a duas horas. Em seguida, adicione 20 microlitros de uma suspensão a 50% de perlas de glutationa à mistura proteica e continue a misturar por mais uma hora.

Esta etapa também é denominada ligação em pares, na qual o G-S-T-M-R-P quatro CT 50 se liga ao SPD zk um. Durante este período, prepare os lisados celulares de HEK 2 93 que superexpressam CFTR com marcação flag do tipo selvagem, conforme descrito na seção anterior do vídeo, após a etapa de ligação em pares. Lave o complexo duas vezes com tampão de lise span a 800 vezes G durante um minuto para cada lavagem e remova cuidadosamente o sobrenadante após cada lavagem.

Use cuidado para não aspirar as esferas do fundo. Adicione os lisados celulares HT K 2 93 às esferas e misture suavemente em um agitador rotativo a quatro graus Celsius por três horas ou durante a noite após a incubação. Lave as esferas três vezes com tampão de lise, fazendo centrifugação após cada lavagem como antes, após a última lavagem.

Para eluir as proteínas, adicione 30 microlitros de tampão amostra 5x e incube em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Em seguida, centrifugue a 5.000 ×g por um minuto para precipitar as pérolas. A seguir, carregue todo o eluato em um gel SDS-PAGE de 4 a 15% e execute a 200 volts até o final do gel. Após a eletroforese, transfira as bandas proteicas para uma membrana de PVDF por 1,5 hora a 60 volts em um aparelho de transferência BioRad.

Após a transferência ser concluída, bloquee a membrana em TBS tween contendo 5% de leite desnatado durante uma hora. Prossiga com o western blot conforme descrito no documento anexo para visualizar as proteínas que interagem com o CFTR. O complexo sinalizador macromolecular contendo A-C-F-T-R foi montado in vitro conforme descrito neste vídeo, como mostrado nesta representação pictórica.

Um complexo macromolecular formado entre os 50 aminoácidos da extremidade C-terminal de Mr.RRP quatro PD zk um e a CFTR de comprimento completo foi utilizado para determinar a dependência em relação à dose na formação do complexo macromolecular. Foram incluídas quantidades crescentes da proteína intermediária PD ZK um, conforme mostrado aqui. O complexo aumentou de forma dependente da dose, sugerindo que a proteína intermediária PD ZK um mediou a interação entre CCF TR e Mr.Rrp quatro.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de não ferver as amostras do complexo de micro moléculas contendo o FTR preparadas para o western blot, pois a agregação do FTR é um problema comum. Em vez disso, as amostras devem ser aquecidas a 37 graus por 10 a 15 minutos antes de serem carregadas no gel, seguindo este procedimento. Outros métodos, como co-imunoprecipitação, podem ser realizados para avaliar os complexos endógenos de CFTR em células, como células das vias aéreas, células epiteliais e células epiteliais intestinais.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar in vitro um complexo sinalizador macromolecular dependente de PTC em um CFDR.