Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização

O objetivo geral deste procedimento é montar um regulador de condutância transmembrana de fibrose cística dependente de PDZ, ou complexo de sinalização macromolecular CFTR. In vitro, para fazer isso, as proteínas de fusão marcadas recombinantes são expressas em bactérias e purificadas. Os lisados celulares próximos são obtidos de culturas que expressam CFTR ou proteínas de ligação a CFTR.

Em seguida, o CFTR e as proteínas de ligação são combinados in vitro para montar o complexo de sinalização macromolecular contendo CFTR. O western blotting é então realizado, o que demonstra uma formação de complexos macromoleculares CFTR e é então avaliado por western blotting. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que podemos detectar e visualizar diretamente a formação de um C CT R contendo um indivíduo complexo macromolecular de alta proteína.

Portanto, este método pode fornecer informações sobre a formação de CT R contendo complexo macromolecular. Também pode ser aplicado na montagem de complexos não proteicos não envolvidos em CFTR, como o complexo de sinalização macromolecular do sexo C dois. Mais recentemente, usando esse mesmo método, demonstramos que nosso receptor de quimioterapia CXCR dois complexos de proteínas formados fisicamente com o efeito a jusante.

PRC beta três medeia o nervo selvagem em neutrófilos usando PCR. Amplificar o DNA que codifica os últimos 50 a 100 aminoácidos contendo os motivos PDZ no terminal C. Para o transportador CAMP, MRP quatro e PDZ um domínio do fator regulador do trocador de hidrogênio de sódio ou N-H-E-R-F.

Em seguida, clone os quatro produtos RP PCR R em PGE X quatro T um para gerar proteínas de fusão GST e o domínio PDZ um de N-H-E-R-F em PET 30. Para gerar proteínas de fusão de hiss, transforme as bactérias por choque térmico. Em meio SOC, em uma cepa de e coli deficiente em protease, cultive a cultura durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora agitada em meio LB de 50 mililitros contendo antibióticos apropriados para o vetor.

No dia seguinte, diluir a cultura em um para 10 e 500 mililitros. Luria berti médio, em seguida, incubar a cultura novamente tremendo a 37 graus Celsius após duas horas. Transcrição induzida da proteína recombinante com IPTG de 0,5 a um milimolar por quatro horas a 30 graus Celsius.

Após a incubação, transferir as culturas para tubos de centrifugação de 250 mililitros e granular as células por centrifugação a 8 000 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e adicione 20 mililitros de tampão sacarose contendo lisozima. Um miligrama por mililitro 0,2% Triton X 100 e inibidores de protease para lisar as células, transfira a suspensão bacteriana para um tubo de centrífuga limpo de 50 mililitros.

Misture em uma coqueteleira rotativa por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, gire a 20.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, o sobrenadante estará claro e um pellet de aplicação insolúvel estará presente no fundo do tubo.

Recolher o sobrenadante límpido num novo tubo cónico de 50 ml. Em seguida, ao sobrenadante, adicione um mililitro da resina apropriada. Esferas aerodinâmicas suspensas como uma pasta de 50% em tampão de sacarose glutationa.

As esferas aerodinâmicas devem ser usadas para proteínas de fusão GST e contas de garra para proteínas de fusão S sibilantes. Misture por quatro horas a quatro graus Celsius em um agitador rotativo. Em seguida, gire as contas a 800 vezes G por dois minutos.

Em seguida, lave-os com resus, suspendendo-os em 15 mililitros de PBS e misture-os em um rotador por dois minutos. E, finalmente, descartar o sobrenadante. Repita a etapa seis vezes após a sexta lavagem.

Para eluir a proteína das contas, adicione dois mililitros do tampão de eluição apropriado para cada mililitro de contas e misture por 10 minutos em temperatura ambiente. Despeje toda a proteína iludida com grânulos em uma coluna e colete o fluxo como proteína iludida. Em seguida, transfira a proteína UD para o tubo de diálise.

Dialise as proteínas eluídas contra dois litros de PBS enquanto mexe a quatro graus Celsius. Troque o PBS a cada quatro horas por quatro vezes após a diálise. Concentre a proteína em 0,5 a um mililitros.

Usando um filtro de centavo de corte de 10.000 megawatts. Alíquota da amostra em 200 microlitros cada. Guarde um para análise e coloque os outros a menos 80 graus Celsius para armazenamento.

Determine a concentração de proteínas pelo Método de Bradford. Avalie a qualidade da proteína por página SDS usando os padrões BSAS. Se a integridade da proteína não for satisfatória, podem ser utilizados procedimentos de purificação secundária, tais como filtração em gel ou permuta iónica.

As células HEK 2 93 que expressam CFTR de tipo selvagem devem ser cultivadas conforme descrito no documento anexo. Remova o meio das células e lave com PBS. Em seguida, para analisar as células, adicione 500 microlitros de tampão de lise para cada placa de cultura de 60 milímetros e agite os lisados celulares por 20 minutos a quatro graus Celsius.

Transferir os lisados para novos tubos de microcentrífuga. Em seguida, para remover as proteínas insolúveis, centrifugue a 16.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius e colete sobrenadantes. Determinar a concentração de proteínas pelo ensaio de Bradford para montar in vitro os complexos macromoleculares contendo CFTR.

Comece combinando 20 microgramas de proteína de fusão purificada de G-S-T-M-R-P quatro C terminais 50 aminoácidos e quantidades crescentes que variam de zero a 40 microgramas de proteína de fusão purificada S PD zk em 200 microlitros de tampão de lise e um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Misture as duas proteínas em um misturador rotativo a 22 graus Celsius por uma a duas horas. Em seguida, adicione 20 microlitros de uma pasta de 50% de grânulos de glutationa na mistura de proteínas e continue a misturar por mais uma hora.

Esta etapa também é chamada de ligação em pares, na qual G-S-T-M-R-P quatro CT 50 se liga a SPD zk um. Durante esse tempo, prepare os lisados de células HEK 2 93 que expressam o sinalizador de tipo selvagem CFTR, conforme descrito na seção anterior do vídeo após a etapa de ligação em pares. Lavar o complexo duas vezes com tampão de lise a 800 vezes G durante um minuto por cada lavagem e aspirar cuidadosamente o sobrenadante após cada lavagem.

Tenha cuidado para não aspirar as contas por baixo. Adicione os lisados de células HT K 2 93 aos grânulos e misture delicadamente em um misturador rotativo a quatro graus Celsius por três horas ou durante a noite após a incubação. Lave os grânulos três vezes com tampão de lise centrifusion após cada lavagem como antes, após a última lavagem.

Para eluir as proteínas, adicione 30 microlitros de cinco tampão de amostra e incube em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Em seguida, gire a 5.000 vezes G por um minuto para precipitar as contas. Em seguida, carregue todo o Eliot em um gel de página de quatro a 15% SDS e execute-o a 200 volts até o final do gel após a execução Transfira as bandas de proteína para a membrana PVDF por 1.5 horas a 60 volts em um aparelho de transferência BioRad.

Após a conclusão da transferência, bloqueie a membrana na pré-adolescente TBS contendo 5% de leite desnatado por uma hora. Prossiga com o western blotting conforme descrito no documento anexo para visualizar as proteínas que interagem com CFTR. A-C-F-T-R contendo complexo de sinalização macromolecular foi montado in vitro conforme descrito neste vídeo, conforme mostrado nesta representação pictórica.

Um complexo macromolecular formado entre os aminoácidos C terminal 50 de Mr.RRP quatro PD zk um e CFTR de comprimento total para determinar a dependência da dose da formação do complexo macromolecular. Quantidades crescentes da proteína intermediária PD ZK foram incluídas como mostrado aqui. Complexo aumentou a dose de forma dependente, sugerindo que a proteína intermediária PD ZK one mediou a interação entre CCF TR e Mr.Rrp quatro.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não ferver as amostras de complexo de micromoléculas do recipiente FTR preparadas para western blotting, pois a agregação FTR é um problema comum. Em vez disso, as amostras devem ser aquecidas a 37 graus por 10 a 15 minutos antes de serem carregadas no gel após este procedimento. Outros métodos, como precipitação de coun, podem ser realizados para avaliar os complexos CFTR endógenos em células como vias aéreas, células epiteliais e células epiteliais intestinais.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar um complexo de sinalização macromolecular CFDR dependente de PTC in vitro.