C. elegans Acompanhamento e Medição do Comportamento

Fenotipagem. A locomoção da *Caenorhabditis elegans* é uma ferramenta importante na descoberta de genes e neurônios envolvidos no comportamento de *C. elegans*. *C. elegans* realiza comportamentos locomotores estereotipados, como movimentos para frente e para trás e diversos tipos de curvas, alterando sua forma. Para quantificar esses movimentos em longas distâncias e com alta resolução espacial e temporal, desenvolvemos um rastreador de vermes para capturar o movimento de *C. elegans* enquanto ele se arrasta sobre a superfície de uma placa de ágar.

Também desenvolvemos um software para isolar e analisar esses movimentos quantitativamente utilizando programas personalizados escritos no LabVIEW e MATLAB. Um desafio de todos os sistemas de rastreamento por vídeo é que eles geram uma quantidade enorme de dados altamente dimensionais. Nosso programa de processamento de imagens e análise de dados enfrenta esse desafio reduzindo as formas do verme a um conjunto de componentes independentes, tendo reconstruído abrangentemente o comportamento do verme como uma função de apenas três a quatro dimensões.

Uma placa de ágar é iluminada por uma fonte de luz de fibra e fotografada com uma câmera. Este sistema é montado em uma plataforma de translação XY. A plataforma é movida por motores de passo padrão, que são conectados a um controlador de motor de passo.

O controlador e a câmera são conectados ao computador e controlados por programas personalizados escritos em LabVIEW. A câmera capta a imagem da superfície de uma placa de ágar e identifica objetos escuros sobre um fundo claro. Uma marca de calibração para o processo automático de calibração é feita perfurando a superfície do ágar.

Com um bastão para vermes, ajusta-se a qualidade da imagem para que o programa de computador possa quantificar objetos em tempo real. O ganho, o brilho e a velocidade do obturador da câmera podem ser ajustados para fornecer um objeto escuro sobre um fundo branco. Pode-se verificar a imagem binária filtrada, que é utilizada pelo programa de rastreamento.

O software possui um recurso de calibração automática que calcula a matriz de calibração movendo um objeto de teste a uma distância fixa. A distância em pixels é calibrada em relação aos passos dados pelo motor de passo por meio da matriz de calibração.

Após a calibração, o sistema está pronto para uso e não precisa ser recalibrado, a menos que a magnificação seja alterada ou a câmera seja reposicionada. Um anel de cobre será usado para conter os vermes e impedir que migrem para a borda da placa. Aqueça primeiro o anel colocando-o sobre um bloco de aquecimento ou equivalente.

O anel deve ser aquecido por aproximadamente um minuto. Coloque o anel em uma placa de ágar fresca e pressione levemente para fixá-lo na superfície do ágar. E uma placa de ágar contendo tampão NGM será usada para lavar resíduos de alimento de vermes nas fases L4 e adulta jovem.

Após transferir os vermes para o tampão NGM, deixe-os nadar por alguns minutos. Coloque cuidadosamente um dos vermes lavados na placa de rastreamento próximo ao centro do anel. Esta placa será posteriormente usada para o rastreador de vermes.

Coloque a placa preparada sobre a plataforma do rastreador de vermes. Execute o programa LabVIEW e selecione as opções necessárias, como local para imagens, tipos de imagens, medições e configurações da câmera. Usando o joystick, mova o microscópio até que uma imagem do verme apareça no campo de visão na tela do computador.

Em seguida, pressione a tecla de rastreamento para ativar o programa de rastreamento. Aqui, estamos mostrando um verme rastreado em tempo real. O programa de computador mede os movimentos de imagens filtradas binariamente conforme mostrado e pode realizar medições dessa imagem em tempo real.

Após o rastreamento, pode-se fazer uma reconstrução da trajetória global a partir dos movimentos do motor de passo, enquanto as mudanças locais na forma do verme podem ser observadas em detalhes. Os vermes se arrastam realizando movimentos ondulatórios. Capturamos esses movimentos esqueletizando o verme em uma única curva central e, em seguida, descrevendo essa curva como um conjunto de ângulos.

Em seguida, decompomos os esqueletos em suas formas fundamentais, também conhecidas como vetores próprios. Com esses modos próprios, podemos reconstruir as formas do verme e quantificar seus movimentos. Utilizando os dois primeiros modos, podemos especificamente capturar a posição de fase do ciclo ondulatório do verme, conforme visto no segundo painel.

O primeiro painel mostra a distribuição conjunta dos modos um e dois, destacando um ciclo limite circular. O movimento de fase em uma direção corresponde ao movimento para frente, e o movimento de fase na direção oposta corresponde ao movimento para trás. Assim, a velocidade de fase corresponde à velocidade do verme.

No espaço real, a forte correlação entre a fase e a velocidade do mundo real pode ser observada no último painel. Utilizando a velocidade de fase derivada do modo próprio, podemos revelar alguns detalhes sutis do comportamento de elegância marinha que passariam despercebidos ao olho humano. Por exemplo, a distribuição conjunta da velocidade de fase e da fase indica claramente que os vermes saem e entram no estado de movimento para frente preferencialmente em fases específicas do movimento.

Aqui demonstramos um sistema de rastreamento de fácil uso que registra imagens detalhadas do comportamento de silícios enquanto rastejam sobre a superfície e placas ACA. A quantidade de informações contidas nessas imagens é vasta e altamente dimensional, e por isso também criamos um método para reduzir a dimensionalidade dos dados em quatro medidas fundamentais. Essas medidas são fáceis de interpretar em relação ao comportamento do verme.

Este trabalho é desenvolvido para medir o comportamento de vermes com pequenas modificações, e o sistema também pode ser utilizado para medir a atividade neuronal usando regiões geneticamente codificadas e revestidas. O sistema como um todo possui um design flexível e pode ser usado com outros sistemas de rastejamento, como Doof law, LOEs.