Câncer de modelagem Colite Associada com Azoximetano (OMA) e sulfato de sódio Dextran (DSS)

No dia zero, Myer injetou azoximetano ou um OM na semana seguinte. A água de beber é substituída por uma solução contendo sulfato de dextrana ou DSS. Na terceira semana, os camundongos recebem água pelas duas semanas seguintes.

Esse ciclo de água com DSS é repetido mais duas vezes. Após o segundo ciclo de DSS, os camundongos podem ser avaliados quanto a tumores por meio de endoscopia refletida.

Após a semana 10, os camundongos são sacrificados e os cólons são coletados. Os cólons são lavados e abertos longitudinalmente. Os cólons são avaliados quanto ao tamanho e número de tumores.

Uma seção longitudinal do cólon em terços pode ser embutida e submetida à análise histológica. Utilizando microscopia de luz, os tumores podem ser contados e classificados. Demonstramos um protocolo no qual a administração do agente genotóxico a OM é seguida por três ciclos do agente pró-inflamatório.

O DSS gera rapidamente e de forma consistente tumores no cólon em camundongos, com semelhanças morfológicas e moleculares aos observados em câncer associado à colite humana. No dia zero, identifique individualmente os camundongos com marcas na cauda ou clips nas orelhas, registre o peso inicial de cada camundongo em uma tabela e, em seguida, injete cada camundongo com uma solução de 10 miligramas por quilograma de OM. Tenha cautela ao manipular OM, pois é um agente genotóxico. No dia sete, forneça aos camundongos uma solução de DSS a 2,5% como água de beber durante a semana seguinte. Para preparar essa solução, adicione o pó de DSS à água destilada e misture até dissolver.

A solução está pronta após ser filtrada por um filtro de acetato de celulose de 0,2 mícron. Para fornecer um suprimento contínuo de solução de DSS por sete dias, substitua o DSS a cada dois ou três dias.

Após este período, troque as gaiolas de volta para água por duas semanas. Pese os camundongos duas a três vezes por semana e observe a presença de sangramento retal e diarreia. Camundongos com tumores grandes podem desenvolver temporariamente prolapso retal, embora isso geralmente não reduza a porcentagem de sobrevida.

A perda de peso em relação ao valor inicial é utilizada como medida indireta da gravidade da colite. Pode-se esperar uma perda de peso de até 10%, juntamente com diarreia e sangramento retal por dois a três dias, na semana seguinte a um ciclo completo de endoscopia com DSS. Um segundo ou terceiro ciclo de DSS pode ser realizado para confirmar o crescimento tumoral in vivo antes do sacrifício.

Como o modelo A-O-M-D-S-S é bastante confiável na produção de tumores, esta etapa geralmente não é necessária. Apenas alguns camundongos devem ser avaliados usando este método, pois ele pode comprometer os tumores nos camundongos. Sua área de trabalho deve incluir um béquer com solução salina tamponada com fosfato estéril ou PBS, bem como um béquer vazio.

Para descartar o PBS usado, aspire oito a 10 mililitros de PBS em uma seringa e conecte ao endoscópio por uso. Ao lavar conteúdos intraluminais, anestesie cada camundongo com sedação inalatória ou injetável e fixe o camundongo em uma placa plana com fita adesiva na cauda e no tórax; as patas dos pés do camundongo podem ser pinçadas. Para garantir sedação adequada, use o polegar e o indicador para pinçar o abdômen inferior do camundongo, expondo o ânus, e avance o endoscópio murino no reto do camundongo.

Usando PBS suavemente para inflar e irrigar, a fim de melhorar a visualização intraluminal e remover conteúdos fecais. Continue avançando o endoscópio lentamente enquanto observa o monitor. Na presença de tumores macroscópicos no dia 70, cada camundongo tratado com A-O-M-D-S-S deve apresentar múltiplos tumores de cólon e estar pronto para avaliação.

Esse estado pode ser adiado por semanas a meses se forem desejados tumores maiores. Prepare uma seringa cheia de PBS acoplada a uma agulha de gavagem. Uma seringa carregada com formalina a 10%, tesoura cirúrgica básica, tesoura com pontas arredondadas.

Uma seringa pequena carregada com solução de Ian Blue a 1%, pinça fina. Além disso, prepare uma bandeja fria, um barquinho contendo PBSA gelado, uma lâmina nova para seccionamento e uma bacia de fixação preenchida com formalina a 10%. Eutanasiar cada camundongo com isoflurano e dislocação cervical ou outro método aprovado institucionalmente. Peso final e outras medidas podem ser realizados.

Neste momento, posicione o camundongo com o lado ventral exposto sobre uma tábua de corte. Pulverize o abdômen com etanol 70% para manter os pelos afastados da área de dissecação. Use uma pinça para segurar a linha média do abdômen e faça uma pequena incisão na pele para expor o peritônio.

Use tração suave para separar a pele do peritônio e expor toda a cavidade abdominal. Faça uma incisão no peritônio e estenda essa incisão ao longo da margem costal bilateralmente. Use uma tesoura fechada para afastar o intestino delgado e o cólon para o lado.

Isso exporá os linfonodos mesentéricos, que podem ser coletados opcionalmente. Para avaliação, desloque inferiormente o trato geniturinário para expor o cólon descendente e o reto, e ressecar a bexiga e os órgãos reprodutivos conforme necessário para melhor exposição da pelve, tomando cuidado para não perturbar os tecidos adjacentes.

Corte os ramos púbicos inferior e superior para expor a junção ânoro-retal. Corte a pele ao redor da junção ânoro-retal para soltar o cólon, exercendo leve tração para cima. Com pinça mesentérica, as aderências do cólon podem ser ressecadas ou delicadamente separadas.

É importante manter parte da pele na junção ânoro-retal, pois esta área é frequentemente afetada pela displasia. Seccione o intestino grosso do intestino delgado logo acima do ceco. Separe o ceco do cólon adjacente utilizando uma agulha de gavagem de 18 calibres acoplada a uma seringa de cinco mililitros.

Lave o cólon com PBS gelado de modo que o fluido saia na direção fisiológica, utilizando tesoura de bordas arredondadas. Abra o cólon ao longo de seu mesentério. Estenda o cólon aberto sobre a bandeja fria.

Certifique-se de que a bandeja tenha descongelado suficientemente para não congelar o tecido. Aplique algumas gotas de Azul de Ian a 1% com o dedo para melhor visualizar os tumores. Avalie o número e o tamanho dos tumores com uma régua ou tire fotografias para análise digital.

Pode-se remover neste momento pequenas secções do tumor em tecido normal adjacente para análises futuras por métodos de proteína de RNA ou imuno-histoquímicos, deixando uma parte do cólon para avaliação histológica. Aplique 10% formal na porção restante do cólon sobre a bandeja fria por meio de seringa ou dedo, permitindo que o tecido fixe por pelo menos 30 segundos. Dessa forma, facilita-se a transferência para a cuba de fixação.

Certifique-se de remover completamente o formina antes de pintar um novo cólon aberto na mesma bandeja. Transfira o cólon para uma bacia contendo 10% de formina e fixe-o pelas bordas. Após três horas de fixação, descarte o formina e substitua por etanol 70%.

Os cólons podem ser conservados em etanol 70% indefinidamente. Use calor baixo para preparar uma solução de ágar 2% e reserve uma lâmina limpa sobre uma placa de vidro. Corte o cólon fixado em três partes e devolva as peças não utilizadas à cuba de etanol.

Reduza as seções a um tamanho uniforme utilizando duas lâminas. Incorpore seções e camadas do cólon em ágar sobre a lâmina limpa. Repita este processo para o próximo cólon.

Seccione o corte transversal, remova o excesso de ágar e coloque o cólon embutido em um cassete para processamento e coloração com hematina e eosina. A figura um descreve o protocolo para indução de câncer associado à colite. A figura dois mostra o peso dos camundongos em relação à linha de base durante a administração de OM e DSS.

Observe que na semana seguinte a cada ciclo de DSS, os camundongos perdem de 5 a 10% do peso corporal. A perda de peso neste experimento é um marcador indireto da gravidade da colite. A figura três mostra uma visão dos tumores no cólon distal por endoscopia murina no dia 50 do tratamento com A-O-M-D-S-S.

Observe as múltiplas massas polipoides obstruindo a luz do cólon distal nos painéis B e C, em comparação com o cólon normal. No painel A, a figura quatro mostra um cólon de camundongo aberto longitudinalmente, ilustrando a aparência macroscópica dos tumores. Observe a maior carga tumoral no cólon distal e a textura característica pregueada do cólon proximal, com pouco crescimento tumoral.

A Figura cinco demonstra tumores destacados pela aplicação do corante lc e azul. Observe como o corante enfatiza a textura normal do cólon, bem como as bordas de cada tumor individual. Essa coloração pode ser útil na medição precisa das áreas tumorais por meio de régua ou medição digital.

A figura seis mostra a distribuição representativa do número médio de tumores por camundongo tratado com OM e DSS. Observe que a maioria dos tumores está localizada no cólon distal e possui tamanho inferior a dois milímetros. A figura sete mostra cortes longitudinais do cólon emblocados em parafina e lâminas coradas com hematoxilina e eosina.

Observe que a presença residual de S e a coloração azul não interferem na coloração com hematoxilina e eosina. Um tumor grande está circulado na imagem do lâmina. As denominações distal, média e proximal resultam do corte do cólon inteiro em terços entre o ceco e o ânus.

A Figura oito mostra a histologia representativa de um tumor resultante da administração de OM e DSS no cólon distal. As microfotografias apresentadas foram coradas com H e E-B-R-D-U e beta-catenina e demonstram alterações displásicas semelhantes às adenocarcinomas humanos do cólon. Neste vídeo, demonstramos um protocolo para tumorigênese colônica induzida por inflamação em camundongos, utilizando uma única injeção de OM seguida por três ciclos de sete dias de DSS.

Em um período de 10 semanas, este modelo induz tumores com alterações histológicas e moleculares semelhantes às que ocorrem no câncer associado à colite em humanos, fornecendo um modelo altamente valioso para o estudo da oncogênese e da quimioprevenção nesta doença.