Amostragem Peptidome saliva humana Indígena Usando uma sonda de Ultrafiltração Lollipop-Like: simplificar e melhorar a detecção Peptide de Espectrometria de Massa Clínica

Este estudo dos peptídeos da saliva utiliza uma sonda de ultrafiltração semelhante a um pirulito, seguida por análise direta em espectrometria de massas nano LC LT Q. Primeiro, monte a sonda LLUF utilizando uma membrana de poliéter de telefone celular e um tubo de etileno propileno. Em seguida, colete amostras de saliva de voluntários e processe-as através da sonda LLUF para obter a amostra de saliva.

Em seguida, prossiga diretamente para a espectrometria de massas nano L-C-L-T-Q e analise os dados de amostras de saliva com e sem tratamento com a sonda LLUF. Em última análise, o peptídeo salivar pode ser obtido mediante a análise dos dados de L-C-M-S-S e a comparação dos peptídeos identificados entre as duas amostras. Essa abordagem, que utiliza uma sonda de ultrafiltração semelhante a um pirulito acoplada a uma análise direta por espectrometria de massas nano LC-LTQ, oferece vantagens fundamentais em comparação com outros métodos, como a digestão de proteínas salivares em peptídeos.

Após análise por espectrometria de massas, o LUF PRO simplifica e purifica a saliva, além de realçar a detecção por espectrometria de massas de peptídeos na saliva total para aplicação clínica. Utilize cola epóxi para selar as membranas de celulose poliéter nos bordos das paletas triangulares de polipropileno. Em seguida, conecte um tubo de politetrafluoroetileno (Teflon FEP) à saída cilíndrica de um triângulo.

Esterilize as sondas com álcool 70% durante a noite usando uma espátula de polipropileno para avaliar a vedação adequada; imerga as sondas LLUF em uma solução de dextrano azul a 50 miligramas por mililitro por duas horas. Confirme a ausência de dextrano azul nas amostras coletadas.

Recrute voluntários saudáveis com idade entre 20 e 40 anos. Após uma lavagem bucal com água, peça ao sujeito que cuspa amostras de saliva integral em um recipiente resfriado com gelo. Reúna todas as amostras e armazene em gelo.

Imediatamente após a coleta, dirija-se a uma sala com temperatura de quatro graus Celsius com 200 microlitros de saliva para a amostragem com as sondas LLUF. Agora, mergulhe a membrana de poliéter de telefone celular na saliva humana em uma placa de cultura. Crie pressão negativa puxando uma seringa para simular um processo de ultrafiltração para a amostragem da saliva.

Em seguida, determine as concentrações proteicas. Prepare um micrograma por microlitro das amostras proteicas de saliva para análise por espectrometria de massas com cromatografia líquida em nanoescala. Para a análise das amostras, utilizamos uma cromatografia líquida em nanoescala Exigent acoplada online a um espectrômetro de massas Finnegan LTQ. Primeiro, carregue cinco microlitros das amostras de saliva não digeridas na coluna de retenção do sistema de cromatografia líquida em nanoescala por meio do amostrador automático.

Após uma etapa de lavagem, troque a válvula e aplique um gradiente linear de zero a 50% do tampão B na coluna de retenção e na coluna de separação C 18. Usando o modo dependente de dados do Excalibur, colete espectros ms ms dos quatro íons MS mais intensos acima de uma intensidade de um vezes 10 à quarta. Para cada amostra, realize corridas duplicadas de três preparações separadas diferentes.

Em seguida, importe o arquivo de dados para o sistema Sequester Sorcerer Two e selecione a opção de busca contra uma base de dados de proteínas humanas apropriada do NCBI, utilizando especificidade não enzimática. Após a busca com o Sequester, os resultados são automaticamente filtrados, validados e exibidos no Peptide Prophet e no Protein Prophet com base nos resultados do Sequester. O Peptide Prophet estima uma pontuação de probabilidade P abrangente de que a atribuição de um peptídeo esteja correta ou incorreta, além de identificar informações adicionais sobre cada sequência de peptídeo.

O lucro proteico calcula uma pontuação de probabilidade de zero a um para cada proteína com base em peptídeos atribuídos aos espectros Ms.Ms. Esta seção determina a capacidade das sondas LLUF de remover bactérias orais para cultura de detecção bacteriana, coletando amostras de saliva antes e depois da coleta com a sonda LLUF em placas de ágar para teste de bactérias aeróbias. Utilize placas de ágar LB sem antibiótico a 37 graus Celsius por um dia e, para bactérias anaeróbias, utilize pacote de gás para cultura.

A amostra em caldo bru foi incubada em placas com agitador sob condições anaeróbicas a 37 graus Celsius por um dia. A fabricação de dispositivos de ultrafiltração semelhantes a pirulitos facilita a coleta de saliva em um ambiente oral imitado. Neste sistema, uma membrana de celulose com carga negativa e corte de peso molecular em 30 kilodaltons é colada em uma paleta de polipropileno e posicionada em frente à sonda LLUF para filtrar as proteínas maiores presentes na saliva.

Para imitar o ambiente oral humano, uma esponja é umedecida com saliva usando uma seringa. A saliva é filtrada e coletada por meio do tubo conectado. A comparação dos cromatogramas de CL de saliva antes e após a coleta com LLUF levou à identificação de peptídeos indígenas da saliva por espectrometria de massas nano CL-CL-T-Q.

Como esses cromatogramas diferenciais são obtidos sem digestão química ou enzimática, eles simplificam a preparação da amostra para fins clínicos. Nesta amostra. Após a elucidação por LLUF das diferentes composições proteicas, foram identificados 131 peptídeos na saliva não digerida.

Esses peptídeos são fragmentos derivados de várias proteínas ricas em prolina. Actin alfa amilase alfa uma globina beta globina, his sustain uma queratina, uma mucina sete receptor polimérico de imunoglobina serina e S 100. A 9 26 peptídeos únicos identificados na saliva após filtração com sondas LLUF são fragmentos derivados principalmente de várias proteínas ricas em prolina.

Este peptídeo derivado da alfa amilase foi detectado exclusivamente em uma amostra de saliva sem coleta com sondas LLUF, ilustrando a capacidade das sondas LLUF em remover proteínas grandes. Mais intrigantemente, após a remoção das proteínas maiores, vários peptídeos de sequência foram detectáveis na saliva coletada com as sondas LLUF, notavelmente peptídeos com terminações ricas em prolina foram identificados nas amostras após filtração ultrafiltrante com sondas LLUF. Agora você deve ter uma boa compreensão de como usar o PRO A-L-L-L-L-U-F na saliva para a massa.

Uma análise melhor é muito importante para coletar e manipular saliva em condições consistentes. Uma vez dominada, acredito que esta técnica possa ser realizada adequadamente em até três horas. Esta abordagem com uma sonda de ultrafiltração semelhante a um pirulito, acoplada à análise direta por espectrometria de massa nano LC-MS/MS, facilita aplicações clínicas para biomarcadores no diagnóstico de doenças humanas.