Name: Amostragem Peptidome saliva humana Indígena Usando uma sonda de Ultrafiltração Lollipop-Like: simplificar e melhorar a detecção Peptide de Espectrometria de Massa Clínica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a amostragem de peptidoma salivar usando uma sonda de ultrafiltração LLUF para análise por espectrometria de massa NanoLC-LTQ. Este método simplifica a detecção de peptídeos de baixa abundância em diagnósticos clínicos.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Grants Saúde (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 e R21-I58002-01). Agradecemos C. Niemeyer para a leitura crítica do manuscrito.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Verificou-se que existem muitos fragmentos peptídicos na saliva não digerido humano. Estes fragmentos peptidicos são derivados a partir de várias formas de prolina proteínas ricas, actina, alfa amilase, alfa globina 1, beta-globina, histain 1, queratina 1, mucina 7, receptor de imunoglobulina polimérica, satherin, S100A9. Poderia haver muitos factores que contribuem para a produção de péptidos com sítios de clivagem indeterminadas. Por exemplo, alguns fragmentos peptídicos podem ser naturalmente presente na saliva human...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Membranas polietersulfona </td><td> Pall Corporation </td><td></td><td> 30 kDa MWCO </td></tr><tr><td> Teflon tubo de propileno fluorado etileno </td><td> Upchurch Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Azul dextrano </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nano LC sistema </td><td> Eksigent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coluna armadilha C18 </td><td> Agilent </td><td> 5065-9913 </td><td></td></tr><tr><td> LTQ linear espectrômetro de massa ion trap- </td><td> Thermo Fisher </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sorcerer 2 </td><td> Sage-N ReseaRCH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> -Acetonitrilo a 0,1% de ácido fórmico </td><td> JT Baker </td><td> 9832-03 </td><td> LC / MS grau </td></tr><tr><td> -Água 0,1% de ácido fórmico </td><td> JT Baker </td><td> 9834-03 </td><td> LC / MS grau </td></tr></tbody></table>

amostragem peptidome saliva humana indígena usando uma sonda de ultrafiltração lollipop-like: simplificar e melhorar a detecção peptide de espectrometria de massa clínica

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

Embora humano saliva proteoma e peptidome foram revelados 1-2 foram identificadas a partir majorly tríptica digere de proteínas salivares. Identificação de peptidome indígena da saliva humana, sem digestão prévia com enzimas exógenas torna-se imperativo, pois peptídeos nativas na saliva humana fornecer valores potenciais para diagnosticar a doença, prevendo a progressão da doença e monitorar a eficácia terapêutica. Amostragem adequada é um passo crítico para a melhoria da identificação de peptidome saliva humana indígena. Os métodos tradicionais de amostragem saliva humana envolvendo centrifugação para remover detritos 3-4 pode ser demasiado morosos para ser aplicável para utilização clínica. Além disso, a remoção detritos por centrifugação pode ser incapaz de limpar a maioria dos agentes patogénicos infectados e remover as proteínas de abundância elevados que muitas vezes impedir a identificação de peptidome baixa abundância. Convencionais abordagens proteômicas que prielectroforese em gel palmente utilizar bidimensional (2-DE) géis em conjugação com, em gel de digestão são capazes de identificar proteínas da saliva muitas 5-6. No entanto, esta abordagem não é geralmente suficientemente sensível para detectar péptidos baixa abundância / proteínas. Cromatografia líquida de-espectrometria de massa (LC-MS) proteômica base é uma alternativa que pode identificar proteínas sem separação 2-DE prévio. Embora esta abordagem proporciona uma maior sensibilidade, geralmente necessita de amostra antes do fraccionamento de pré-7 e pré-digestão com tripsina, o que torna difícil para o uso clínico. Para contornar o obstáculo em espectrometria de massa, devido à preparação da amostra, temos desenvolvido uma técnica chamada de ultrafiltração capilar (CUF) sondas de 8-11. Dados do nosso laboratório demonstraram que as sondas CUF são capazes de captar proteínas in vivo a partir de vários microambientes em animais de uma maneira dinâmica e minimamente invasiva 8 -11. N centrifugação é necessária uma vez que uma pressão negativa é criado por simplesmente retirada da seringa durante a recolha da amostra. As sondas CUF combinados com LC-MS foram identificados com sucesso proteínas tríptica-digeridos 8-11. Neste estudo, nós atualizamos a técnica de amostragem de ultrafiltração através da criação de um pirulito, como ultrafiltração sonda (LLUF) que pode facilmente caber na cavidade bucal humana. A análise directa por LC-MS sem digestão com tripsina revelaram que a saliva humana indigenoso contém muitos fragmentos peptídicos derivados de várias proteínas. Coleta de saliva com sondas LLUF evitado centrifugação, mas efetivamente removido muitas proteínas maiores abundância e alta. Nossos resultados de espectrometria de massa mostrou que muitos peptídeos baixa abundância tornou-se detectável após filtrar proteínas maiores com sondas LLUF. Detecção de peptídeos de saliva de baixo custo de abundância foi independente da múltipla passo de separação da amostra com a cromatografia. Para aplicação clínica, as sondas LLUF incorporard com LC-MS pode potencialmente ser usado no futuro para monitorar a progressão da doença a partir de saliva.

Considerando coleta de saliva para uma futura aplicação clínica, um pirulito, como ultrafiltração sonda (LLUF) foi fabricada para caber na cavidade bucal humana. Análise directa da saliva não digerido por espectrometria de massa nanoLC-LTQ demonstraram a capacidade das sondas de LLUF para remover as proteínas grandes e proteínas de abundância elevadas, e fazer de baixa abundantes péptidos mais detectável.

Amostragem Peptidome saliva humana Indígena Usando uma sonda de Ultrafiltração Lollipop-Like: simplificar e melhorar a detecção Peptide de Espectrometria de Massa Clínica

Embora o proteoma e o peptidoma da saliva humana tenham sido revelados 1-2, eles foram identificados majoritariamente a partir de digestões trípticas de proteínas salivares. A identificação ...

Este estudo do peptídeo salivar utiliza uma sonda de ultrafiltração semelhante a um pirulito, seguida por análise direta em espectrometria de massas nano LC LT Q. Primeiro, monte a sonda LLUF utilizando uma membrana de poliéter de telefone celular e um tubo de etileno propileno. Em seguida, colete amostras de saliva de voluntários e processe-as através da sonda LLUF para obter a amostra salivar.Em seguida, prossiga diretamente para a espectrometria de massa nano L-C-L-T-Q e analise os dados de amostras de saliva com e sem tratamento com a sonda LLUF. Em última análise, o peptídeo salivar pode ser obtido analisando os dados do L-C-M-S-S e comparando os peptídeos identificados entre as duas amostras. Essa abordagem, que utiliza uma sonda de ultrafiltração semelhante a um pirulito acoplada à análise direta por espectrometria de massa nano LC-LTQ, oferece vantagens fundamentais em comparação com outros métodos, como a digestão de proteínas salivares em peptídeos.Após análise por espectrometria de massas, o LUF PRO simplifica e purifica a saliva, além de aprimorar a detecção por MS de peptídeos na saliva total para aplicação clínica. Utilize cola epóxi para selar as membranas de celulos

sampling-human-indigenous-saliva-peptidome-using-lollipop-like

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Padrões de Isótopos estáveis ​​e Captura de Anticorpos Anti-Peptide (SISCAPA) casais enriquecimento afinidade de peptídeos com isótopos estáveis ​​de diluição espectrometria de massa (MRM-MS) para fornecer a medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. Aqui nós descrevemos o protocolo usando partículas magnéticas em um formato parcialmente automatizados.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

É apresentado um método para análise de espectrometria de massa de peptídeos endógenos em humano líquido cerebrospinal (CSF). Empregando filtração de corte de peso molecular, pre- fracionamento cromatográfico de, análise de espectrometria de massa e uma subsequente combinação de estratégias de identificação do peptide, foi possível expandir o conhecido peptidome CSF quase dez vezes em comparação a estudos anteriores.

Preparação da amostra para análise de Endopeptidomic no líquido cefalorraquidiano humano

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Este artigo introduz métodos de preparação de amostras para um método analítico único em tempo real baseado na espectrometria de massa ambiente. Este método nos permite realizar a análise em tempo real das moléculas biológicas in vivo sem nenhum pré-tratamento especial.

Preparação de amostras para espectrometria de ionização de eletrospray de sonda

Este protocolo abrange uma análise detalhada da composição de peptidoglicanos usando cromatografia líquida, espectrometria de massas acoplada com extração avançada de recursos e software de análise bioinformática.

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

Aqui, apresentamos um protocolo de digestão otimizado no filtro com informações detalhadas sobre o seguinte: digestão de proteínas, purificação de peptídeos e análise de aquisição independente de dados. Esta estratégia é aplicada à análise de amostras de urina de secreções prostáticas expressas e permite alta cobertura proteome e perfil livre de rótulos de baixo valor ausente do proteome urinário.

Perfil proteômico de EPS-urina através da Digestão FASP e Análise Independente de Dados

Modificações pós-translacionais (PTMs) alteram estruturas e funções proteicas. Métodos para o enriquecimento simultâneo de vários tipos de PTM podem maximizar a cobertura nas análises. Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia de afinidade metálica ti(IV) automobilizada duplamente, seguida de espectrometria de massa para o enriquecimento simultâneo e análise da proteína N-glicosilação e fosforilação em tecidos pancreáticos.

Uma estratégia de enriquecimento de ponta de spin para análise simultânea de N-glicopeptídeos e Fosfopeptídeos de Tecidos Pancreáticos Humanos

Um protocolo é apresentado para a determinação de biomarcadores de baixa abundância a partir de amostras secas de soro exemplificadas com o biomarcador progastrina-releasing peptide (ProGRP). Esferas magnéticas revestidas com anticorpos são usadas para a limpeza seletiva e enriquecimento de um peptídeo proteotípico ProGRP. O peptídeo capturado é posteriormente analisado por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem.

Microamostragem em Análise de Proteínas de Baixa Abundância Baseada em Espectrometria de Massa

Um protocolo detalhado é fornecido para limpeza e reutilização de tubos de ultracentrífuga de policarbonato para realizar o isolamento de vesículas extracelulares adequado para experimentos proteômicos.

Reutilização de Tubo de Ultracentrífuga de Policarbonato em Análises Proteômicas de Vesículas Extracelulares

Este artigo ilustra uma abordagem inovadora visual (photovoice ou foto-elicitação) para alcançar processo justo em cuidados clínicos para os pacientes que vivem com condições crônicas de saúde, iluminar as lacunas no conhecimento clínico, forjar melhores relações terapêuticas, e identificar centrado no paciente objetivos e possibilidades de cura .

Usando métodos visual e narrativa para atingir Processo Fair em Cuidados Clínicos

Aprenda a amostragem de peptidoma salivar usando uma sonda de ultrafiltração LLUF para análise por espectrometria de massa NanoLC-LTQ. Este método simplifica a detecção de peptídeos de baixa abundância em diagnósticos clínicos.

Amostragem Peptidome saliva humana Indígena Usando uma sonda de Ultrafiltração Lollipop-Like: simplificar e melhorar a detecção Peptide de Espectrometria de Massa Clínica (Vídeo) | JoVE Journal

Amostragem Peptidome saliva humana Indígena Usando uma sonda de Ultrafiltração Lollipop-Like: simplificar e melhorar a detecção Peptide de Espectrometria de Massa Clínica

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