DNA Vector baseado em RNA de interferência para estudar a função Gênica em Câncer

O objetivo geral deste procedimento é determinar a função gênica por meio do uso de interferência de RNA baseada em vetor de DNA. Isso é realizado primeiramente projetando e gerando construtos S-H-R-N-A que direcionam genes específicos. O segundo passo é produzir lentivírus carregando o cassete de expressão de SH RNA.

Em seguida, linhagens celulares estáveis são geradas infectando-se as células com o lentivírus, e as células infectadas com o lentivírus são utilizadas em diversos ensaios in vitro e in vivo para determinar os efeitos do silenciamento do gene de interesse. Em última análise, dependendo dos ensaios utilizados, os resultados podem mostrar alterações na genicidade tumoral das células como resultado da redução da expressão gênica, por meio de ensaios in vitro de proliferação, migração e invasão, bem como modelos in vivo de formação de xenografias. O procedimento será demonstrado por Daniel Stowell, ma Juan, e Daniel é aluno de pós-graduação no meu laboratório; Ma Ma é técnica.

Chang é um pesquisador pós-doutorando. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa do câncer, como se um gene específico tem papel no desenvolvimento e na progressão do câncer, e quais aspectos desses processos podem ser importantes. Para começar, projete e solicite os oligonucleotídeos com base nos critérios descritos, escolhendo os dois oligos complementares reversos que contêm a sequência-alvo de 20 a 23 nucleotídeos no gene-alvo.

Eles formarão sítios eco R um e Hindi três nas duas extremidades. Após serem aquecidos, outro oligo contém uma sequência complementar reversa à sequência alvo e à sua extremidade três prima. Liga-se à extremidade três prima do promotor H um ou U seis com um primer upstream.

Utilize uma PCR para produzir um fragmento que tenha os sítios BAM H1 e HindIII em ambas as extremidades. Enquanto isso, realize a digestão do vetor lentiviral e do fragmento de PCR. Em seguida, realize uma reação de ligação com três fragmentos entre o vetor, o fragmento de PCR e os oligonucleotídeos Anil.

Em uma proporção molar de um para 10 a 10, o vetor resultante produzirá o HRNA de interesse com uma sequência Hindi três na região do laço. Se um vetor indutível for utilizado, a produção de HRNA dependerá da presença de uma molécula indutora, como a doxiciclina para o sistema Tet on. Agora, transforme células competentes de E. coli DH cinco alfa altamente eficientes utilizando o produto ligado e identifique os vetores positivos por meio de uma triagem de PCR baseada em colônias.

Amplifique um produto que abranja o vetor e o local de ligação do promotor indutível. Prepare o DNA plasmidial das colônias positivas utilizando um kit comercial. Em seguida, confirme a presença do inserto por digestão com BAM H um e ECO R um e por eletroforese em gel de agarose de DNA.

Além disso, sequencie a região contendo o promotor e o S-H-R-N-A utilizando o nucleotídeo LIGA P cinco. Usando um kit MIDI ou maxi prep livre de endotoxinas, prepare o DNA do lentivírus carregando o cassete de expressão HRNA. Determine a concentração de DNA mediante a medição da absorção de luz em 260 nanômetros e assegure a pureza do DNA verificando se a razão entre as absorções de luz em 260 e 280 nanômetros está entre 1,8 e 2,0.

Por fim, execute o plasmídeo de lentivírus em um gel de agarose para garantir que esteja em forma superenrolada. Antes da transfeção, prepare-se para a transfeção deixando cair lentamente 0,9 mililitros da solução A em 0,9 mililitros da solução B, borbulhando ar através da solução B com uma pipeta. Em seguida, incube a mistura à temperatura ambiente por 30 minutos. Depois, deixe cair lentamente 0,6 mililitros da mistura em três placas diferentes de 10 centímetros contendo células HEK 293T.

Em seguida, retorne as células ao incubador quatro a seis horas depois. Substitua o meio por sete mililitros de meio DMEM completo. Após 24 horas, adicione mais cinco mililitros de meio e, após outras 24 horas, colete o meio contendo o lentivírus.

Centrifugue o meio colhido a 1500 RPM em temperatura ambiente por 10 minutos. Filtre o sobrenadante utilizando um filtro de 0,45 micrômetro. Centrifugue o meio que passou contendo o lentivírus por ultracentrifugação.

Decante o sobrenadante para um recipiente de resíduos contendo 5% de hipoclorito. Re-suspenda o pellet de lentivírus em meio a um mililitro de PBS 1X frio. Em seguida, divida a solução de lentivírus em alíquotas de 50 a 100 microlitros para armazenamento a menos 80 graus Celsius.

Por fim, determine o título do lentivírus utilizando uma técnica confiável. Normalmente, uma placa de cultura de 10 centímetros produzirá de 50 a 100 milhões de unidades infecciosas antes de prosseguir com a infecção celular. Determine a MOI do título do lentivírus utilizando um kit ou R-T-P-C-R para este procedimento.

Recomenda-se uma MOI inferior a quatro. Comece semeando as células a serem infectadas em uma placa de seis poços com 30 a 40% de confluência e cultive-as durante a noite. No dia seguinte.

Substitua o meio por um mililitro de meio fresco contendo poli-cérebro ou protamina. Em seguida, adicione entre um e dois milhões de UI de um lentivírus contendo um marcador fluorescente ou um marcador antibiótico.

Agite lentamente a placa por 10 segundos para misturar e incube por seis horas. Após seis horas, substitua o meio por meio normal e completo e propague as células por dois dias. O meio não deve conter antibióticos ou indutores, independentemente do lentivírus utilizado após dois dias.

Adicione o antibiótico apropriado se o lentivírus contiver um marcador antibiótico. Da mesma forma, adicione o indutor à metade das culturas se o lentivírus for induzível. Após cultivar as células por mais dois ou três dias com antibióticos e indutores, realize uma análise sanguínea western para testar a redução do gene-alvo antes dos olhos de xenotransplante com tripsina.

As células provenientes de placas de cultivo celular grandes devem ser suspensas novamente no meio original contendo 50% de matrigel. É essencial manter as células cancerígenas suspensas em 50% de matrigel e a seringa em gelo. Caso contrário, há o risco de o matrigel solidificar e a infecção terá que AB sobre isso.

Prepare o local cirúrgico limpando-o cuidadosamente com etanol 70% e realize a anestesia com excelente ventilação e um filtro captador de isoflurano acoplado à câmara de indução. Anestesie camundongos nuos tímicos usando isoflurano 2% misturado com oxigênio 1,5% por três a cinco minutos antes da inoculação celular. Em seguida, mantenha a anestesia com isoflurano 2% misturado com oxigênio por meio de um cone nasal.

Posicione o camundongo sobre uma placa aquecida regulada em 30 graus Celsius. Carregue as células em seringas com agulhas de calibre 25 e meio para injeções subcutâneas, ou agulhas de calibre 28 a 30 para injeções ortotópicas. Cinco minutos após a indução da anestesia em um ou dois locais, injete de um a dez milhões de células em bolus de 200 microlitros.

O número de células depende da malignidade ou agressividade das células cancerígenas. Para vetores constitutivamente ativos, utilize dois grupos de camundongos injetados com células expressando ou o gene alvo S-H-R-N-A ou um S-H-R-N-A aleatório no vetor. Utilize os mesmos dois grupos e divida-os em subgrupos que recebem ou não o indutor na água.

Substitua a água nos recipientes duas vezes por semana. Monitore o volume dos tumores semanalmente ou quinzenalmente com um C. Certifique-se de que o volume tumoral não exceda o limite institucional ou do A CUC e eutanase qualquer animal que apresente ulceração extensa, necrose, infecção evidente, sangramento incontrolável ou doença em estágio terminal. Para monitorar o crescimento tumoral e metástase por meio de um marcador bioluminescente, desinfete a área de trabalho e anestesie os camundongos em uma câmara de imagem com anestesia gasosa.

Primeiro, realize uma exposição de dois a cinco minutos e verifique a intensidade do sinal, ajustando conforme necessário. Se o tamanho do tumor exceder 1000 milímetros cúbicos ou o limite institucional de tamanho, eutanazie o animal após o sacrifício, documente o tamanho do tumor e os retenha para análises adicionais. Este protocolo foi utilizado para estudar os efeitos do silenciamento de why Y1 na formação de tumores xenograft por células de adenocarcinoma de mama humano que expressam luciferase implantadas em camundongos nus atímicos.

A sequência alvo S-H-R-N-A do YY humano e um controle S-H-R-N-A aleatorizado, que não apresentava semelhança significativa com qualquer transcripto humano conhecido, foram ambos testados. Como resultado, dois vetores lentivirais foram construídos e utilizados para produzir dois lentivírus. Ambos foram usados para infectar duas populações celulares diferentes, obtendo-se populações celulares policlonais.

Após a seleção com puromicina. A análise sanguínea por Western confirmou a indução de DS do silenciamento de YY1 nessas linhagens celulares infectadas. Em seguida, a população celular policlonal do clone três, que foi infectada com YY1 induzível shRNA e o shRNA controle.

LENTIVÍRUS foram utilizados para testar os efeitos da exaustão de YY um na invasão. Observamos que a exaustão de YY um reduziu a invasividade das células. A análise sanguínea ocidental confirmou que os documentos induziram o silenciamento de YY um em células com o indutor YY um S-H-R-N-A, enquanto células contendo controle.

S-H-R-N-A não apresentou esse efeito. Essas células foram então utilizadas em um estudo com modelo de camundongo alogênico comparado aos grupos controle indu, YY um S-H-R-N-A. Camundongos implantados com S-H-R-N-A e suplementados com água contendo dos apresentaram formação tumoral significativamente reduzida quando visualizada por bioluminescência e quando os pesos tumorais foram medidos, conforme esperado. A silenciamento de YY um nesses tumores alogênicos foi prontamente confirmado por western blot.

Estudos Não se esqueça de que trabalhar com lentivírus pode ser extremamente perigoso de acordo com as considerações de segurança da NIHB para pesquisas com vetores lentivirais; procedimentos de contenção nível B aprimorado dois são obrigatórios em todos os ambientes laboratoriais.