DNA Vector baseado em RNA de interferência para estudar a função Gênica em Câncer

O objetivo geral deste procedimento é determinar a função do gene por meio do uso de interferência de RNA baseada em vetor de DNA. Isso é feito primeiro projetando e gerando construções S-H-R-N-A que visam genes específicos. O segundo passo é produzir lentivírus carregando o de expressão de RNA SH.

Em seguida, linhagens celulares estáveis são geradas infectando células com o lentivírus e as células infectadas com o lentivírus são usadas em vários ensaios in vitro e in vivo para determinar os efeitos do silenciamento do gene de interesse. Em última análise, dependendo dos ensaios utilizados, os resultados podem mostrar mudanças na genicidade tumoral das células como resultado do knockdown do gene através do uso de ensaios de proliferação, migração e invasão in vitro, bem como modelos de formação de xenoenxerto in vivo. Demonstrando o procedimento estará Daniel Stowell, ma Juan, e Daniel é um estudante de pós-graduação no meu laboratório Ma Ma é um técnico.

Chang é pós-doutorando. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de pesquisa do câncer, como se um gene específico tem um papel no desenvolvimento e progressão do câncer e para quais aspectos desses processos ele pode ser importante. Para começar, projete e ordene os oligonucleotídeos com base nos critérios descritos Anil, os dois oligos complementares reversos que contêm a sequência alvo de 20 a 23 nucleotídeos no gene alvo.

Eles formarão eco R um e Hindi três locais nas duas extremidades. Depois de ser ajoelhado, outro oligo contém uma sequência complementar reversa à sequência alvo e suas três extremidades principais. Neils para a extremidade três primos do promotor H um ou U seis com um primer a montante.

Use um PCR para fazer um fragmento que tenha BAM H um e Hindi três locais em cada extremidade. Enquanto isso, digerir o vetor lentivírus e o fragmento de PCR. Em seguida, realizar uma reação de ligação de três fragmentos entre o vetor, o fragmento de PCR e os oligonucleotídeos Anil.

Em uma proporção molar de um para 10 a 10, o vetor resultante produzirá o HRNA de interesse com uma sequência de três hindi na região do loop. Se um vetor induzível for usado, a produção de HRNA dependerá da presença de uma molécula indutora, como a doxiciclina, para o sistema Tet. Agora transforme células e coli DH cinco células alfa altamente eficientes e competentes usando o produto ligado e identifique vetores positivos usando uma triagem de PCR baseada em colônia.

Amplificar um produto que abrange o vetor e o local de ligação do promotor induzível. Prepare o DNA plasmático das colônias positivas com um kit comercial. Em seguida, confirmar a presença da sequência inserida por digestão BAM H one e ECO R one e por electroforese de ADN agarose.

Além disso, sequencie a região que contém o promotor e S-H-R-N-A usando o nucleotídeo LIGA P cinco. Usando um MIDI livre de endotoxinas ou um kit de preparação maxi, prepare o DNA do lentivírus que carrega o de expressão HRNA. Determine a concentração de DNA medindo a absorção de luz em 260 nanômetros e garanta a pureza do DN a verificando se a taxa de absorção de luz de 260 a 280 nanômetros está entre 1,8 e 2,0.

Finalmente, execute o plasmídeo de lentivírus em um aerogel para certificar-se de que está enrolado em S Antes da transfecção, prepare-se para a transfecção primeiro soltando lentamente 0,9 mililitros da solução A em 0,9 mililitros da solução B enquanto borbulha o ar através da solução B com uma pipeta. Em seguida, incube a mistura em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, coloque lentamente 0,6 mililitros da mistura em três placas diferentes de 10 centímetros com células HEK 2 93 T.

Em seguida, devolva as células à incubadora quatro a seis horas depois. Substitua o meio por sete mililitros de meio DMEM completo. Após 24 horas, adicione mais cinco mililitros de meio e, após mais 24 horas, colha o meio que contém o lentivírus.

Gire o meio colhido a 1500 RPM em temperatura ambiente por 10 minutos. Filtrar o sobrenadante com um filtro de 0,45 micrómetros. Gire o fluxo através do meio contendo o lentivírus por ultracentrifugação.

Transvase o sobrenadante para um recipiente de resíduos contendo 5% de alvejante. Ressuspenda o pellet de lentivírus em meio a um mililitro de XPBS frio. Em seguida, divida a solução de lentivírus em alíquotas de 50 a 100 microlitros para armazenamento a 80 graus Celsius negativos.

Finalmente, determine o título do lentivírus usando uma técnica confiável. Normalmente, uma placa de cultura de 10 centímetros produzirá de 50 a 100 milhões de unidades infecciosas antes de prosseguir com a infecção celular. Determine o MOI do título lentiviral usando um kit ou R-T-P-C-R para este procedimento.

Recomenda-se um MOI menor que quatro. Comece semeando as células a serem infectadas em uma placa de seis poços para 30 a 40% de fluência e cultive-as durante a noite. No dia seguinte.

Substitua o meio por um mililitro de meio fresco contendo policérebro ou protamina. Em seguida, adicione entre um e 2 milhões de iu. Um lentivírus contendo um marcador fluorescente ou antibiótico.

Agite lentamente o prato por 10 segundos para misturá-lo e incubá-lo por seis horas. Após seis horas, substitua o meio por meio normal e completo e propague as células por dois dias. O meio não deve conter antibióticos ou indutores, independentemente do lentivírus usado após dois dias.

Adicione o antibiótico apropriado se o lentivírus contiver um marcador de antibiótico. Da mesma forma, adicione indutor à metade das culturas se o lentivírus for induzível. Depois de cultivar as células por mais dois ou três dias com antibióticos e indutores, faça uma análise de sangue ocidental para testar o knockdown do gene alvo antes dos olhos de tripsina de xenoenxerto.

As células de grandes placas de cultura de células e ressuspendê-las em meio original contendo 50% de matrigel. É essencial manter as células cancerígenas ressuspensas e em 50% matrigel e a seringa no gelo. Caso contrário, existe o risco de o matrigel solidificar e a infecção ter que AB sobre isso.

Preparar o local cirúrgico limpando-o bem com etanol 70% e realizar a anestesia com excelente ventilação e filtro isof fluorina acoplado à câmara de indução. Anestesiar um camundongo tímico nu usando 2% de flúor misturado com 1,5% de oxigênio três a cinco minutos antes da inoculação celular. Em seguida, mantenha a anestesia com 2% de flúor misturado com oxigênio através de um cone nasal.

Posicione o mouse em uma almofada de aquecimento ajustada para 30 graus Celsius. Carregue as células em seringas com agulhas de calibre 25 e meio para injeções subcutâneas ou agulhas de calibre 28 a 30 para injeções ortotópicas. Cinco minutos após a indução da anestesia em um ou dois locais, injete de um a 10 milhões de células em bolus de 200 microlitros.

O número de células depende da malignidade ou agressividade das células cancerígenas. Para vetores constitutivamente ativos, utilize dois grupos de camundongos injetados com as células que expressam o gene alvo S-H-R-N-A ou um forte S-H-R-N-A embaralhado em vetores. Use os mesmos dois grupos e divida-os em subgrupos que são ou não induzidos em sua água.

Substitua os documentos que contêm água duas vezes por semana. Monitore o volume dos tumores semanalmente ou quinzenalmente com um C. Certifique-se de que o volume do tumor não exceda o limite institucional ou A CUC e sacrifique qualquer animal que apresente ulceração extensa, infecção óbvia de necrose, sangramento descontrolado ou doença em estágio terminal. Para monitorar o crescimento do tumor e a metástase por meio de um marcador bioluminescente, desinfete a área de trabalho e anestesiar os camundongos em uma câmara de imagem com anestesia gasosa.

Primeiro, faça uma exposição de dois a cinco minutos e verifique a intensidade do sinal e, em seguida, ajuste de acordo. Se o tamanho do tumor exceder 1000 milímetros cúbicos ou limite de tamanho institucional, sacrificar o animal após o sacrifício, documentar o tamanho do tumor e retê-lo para análise posterior. Este protocolo foi usado para estudar os efeitos de por que Y um knockdown na formação de tumor de xenoenxerto de células de adenocarcinoma de mama humano expressando luciferase implantadas em camundongos nus atímicos.

A sequência-alvo S-H-R-N-A de YY humano um e um controle embaralhado S-H-R-N-A, que não tinha semelhança significativa com nenhum transcrito humano conhecido, foram testadas. Como resultado, dois vetores lentivirais foram construídos e usados para produzir dois lentivírus. Ambos foram usados para infectar duas populações de células diferentes e populações de células policlonais foram obtidas.

Após a seleção de pur micina. A análise de sangue ocidental confirmou que o SD induziu YY um knockdown nessas linhagens celulares infectadas. Em seguida, a população de células policlonais do clone três que foi infectado com YY induzível um S-H-R-N-A e o controle. S-H-R-N-A.

LENTIVÍRUS foram usados para testar os efeitos da depleção de YY um na invasão. Observamos que a depleção YY uma reduziu a invasividade das células. A análise de sangue ocidental confirmou que os documentos induziram o silenciamento YY um em células com o indu YY um S-H-R-N-A, enquanto as células contendo controle.

S-H-R-N-A não mostrou esse efeito. Essas células foram então usadas em um estudo de modelo de camundongo xenoenxerto em comparação com os grupos de controle indu, YY um camundongo implantado com S-H-R-N-A fornecido com o dos, contendo água, mostrou uma formação tumoral significativamente reduzida quando visualizado por bioluminescência e quando os pesos tumorais foram medidos conforme o esperado. O silenciamento YY one nesses tumores de xenoenxerto foi prontamente confirmado por western blot.

Estudos: Não se esqueça de que trabalhar com lentivírus pode ser extremamente perigoso, de acordo com as considerações de segurança do NIHB para pesquisas com vetores lentivirais, nível de segurança B aprimorado, dois procedimentos de contenção são necessários para todos os ambientes laboratoriais.