Rato Ilhéu de Langerhans isolamento usando uma combinação de colagenase purificada e Protease Neutra
7 de setembro de 2012
Uma descrição detalhada de isolamento de ilhotas do rato está descrito por meio da técnica de canulação na pancreático ductal in situ e a perfusão de uma combinação de colagenase purificados e protease neutra.
O objetivo geral deste procedimento é isolar com sucesso os ilhós do pâncreas de um camundongo. Isso é feito isolando primeiro o pâncreas do tecido circundante. Em seguida, o ducto biliar é canulado para que o pâncreas possa ser inflado com a mistura de colagenase protease.
Uma vez inflado, o pâncreas é removido e os ilhós são cuidadosamente dissociados. Por fim, os ilhós isolados são filtrados e revestidos para uso futuro. Em última análise, este método de isolamento de ilhós com colagenase purificada e protease neutra é usado para obter o rendimento máximo do ilhó e a morfologia ideal do ilhó.
A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes de isolamento de ilhós é que eliminamos a variabilidade de lote para lote usando enzimas purificadas. Além disso, alteramos ou fizemos melhorias em alguns protocolos para melhorar a morfologia dos ilhós. Após a eutanásia, cubra o tronco com etanol 70% antes de abrir completamente a cavidade abdominal do ânus ao diafragma.
Em seguida, coloque o mouse na plataforma de um microscópio de dissecação. Retire o ceco e o cólon ascendente e coloque-os fora da cavidade do corpo para a esquerda, deslocando os lobos do fígado contra o diafragma. Se eles não permanecerem lá por conta própria, aumente a abertura da cavidade corporal.
Segure o duodeno com uma pinça curva e localize a veia porta da artéria hepática e o feixe do ducto biliar que leva ao fígado. Com outro par de pinças curvas. Insira uma sutura sob a veia da artéria e o feixe de ductos e aperte-o o mais próximo possível do fígado.
Usando dois pares de pinças curvas, segure cuidadosamente o duodeno e encontre o ducto biliar preso Na papila, use uma pinça da pinça para cutucar o pâncreas e o tecido conjuntivo logo abaixo do ducto biliar e perto da papila funcionando. Rapidamente, coloque a pinça através do orifício e insira uma sutura. Frouxamente. Amarre a sutura ao redor do ducto biliar para criar um pequeno círculo usando uma pinça de 90 graus.
Puxe o intestino delgado até que o ducto biliar esteja tau. Faça um corte horizontal na papila com uma tesoura super fina sem desalojar o ducto biliar da papila enquanto segura o intestino. Insira uma cânula no ducto biliar e, em seguida, puxe suavemente a sutura firmemente ao redor da cânula.
Em seguida, encha uma seringa de três mililitros com 2,0 mililitros de mistura de colagenase protease. Injete esta mistura na cânula em um ritmo lento e constante. Após a conclusão da insuflação do pâncreas, remova a cânula do ducto biliar.
Começando no cólon descendente, corte o tecido conjuntivo enquanto puxa os intestinos para cima até que o ducto biliar seja alcançado. Em seguida, separe o pâncreas do baço e dos tecidos circundantes. Por fim, corte as suturas e remova o pâncreas.
Depois de removido, coloque o pâncreas em um tubo de 50 mililitros contendo cinco mililitros de HBSS no gelo. Depois que todas as amostras forem coletadas, coloque os tubos de 50 mililitros contendo tecido do pâncreas em um banho-maria a 37 graus Celsius. Por 15 minutos, agite suavemente o tubo e verifique se há dissociação do tecido.
Certifique-se de que o tecido se desfaça facilmente segurando o tubo pela tampa. Gire 12 vezes para dissociar ainda mais o tecido. Adicione no máximo 30 mililitros de HBSS e centrífuga.
Aspirar o sobrenadante com cuidado e deixar uma pequena quantidade de sobrenadante no fundo para não perturbar a paleta de células. Usando uma seringa de 30 mililitros presa a uma agulha de calibre 14, adicione no máximo 10 mililitros de HBSS e aspire a suspensão para cima e para baixo duas vezes. Filtre a mistura de células através de um filtro T de plástico em um tubo de 50 mililitros.
Enxágüe com mais 10 mililitros, HBSS e centrifugue. Transvasar o sobrenadante e inverter os tubos para escorrer sobre uma toalha de papel absorvente durante um minuto. Ressuspenda cada tubo em 10 mililitros.
Frio 1100. Sua sobreposição opaca, o seu opaco Com 10 mililitros, HBSS e centrífuga. Remova todos os 20 mililitros de sobrenadante usando uma pipeta de 25 mililitros de diâmetro grande e passe o sobrenadante por um filtro invertido de 70 mícrons.
Filtre os ilhós diretamente em uma placa de Petri e enxágue pipetando 10 mililitros de meio de ilhós através da cultura do filtro. Os ilhós em uma incubadora de cultura de tecidos até que estejam prontos para experimentação. O rendimento, a morfologia e a qualidade dos ilhós são os parâmetros gerais usados para julgar o sucesso do isolamento dos ilhós.
A morfologia típica do ilhó é mostrada aqui. Os ilhós têm uma forma redonda a oblonga com tamanho relativamente uniforme. Aqui. Ilhós isolados foram analisados quanto à secreção de insulina estimulada por glicose.
A estimulação com insulina foi semelhante entre os ilhós preparados pela Sigma Tipo 11 em comparação com o ci zyme TM, MABP indicando uma alta qualidade de preparação dos ilhós. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como canular um ducto biliar de camundongo. Trabalhe com colagenase enzimática e proteases neutras para isolar suas pálpebras para qualquer ensaio.
Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento detalhado para isolar ilhotas do pâncreas de um rato usando a canulação ductal pancreática in situ e uma mistura de colagenase-protease. O método visa melhorar o rendimento e a morfologia das ilhotas, minimizando a variabilidade.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Endocrinologia
Fundo
- As células das ilhotas são cruciais para a produção de insulina.
- Métodos tradicionais de isolamento podem levar à variabilidade nos resultados.
- O uso de enzimas purificadas pode melhorar a qualidade das ilhotas isoladas.
- Protocolos aprimorados podem levar a uma melhor morfologia das ilhotas.
Propósito do Estudo
- Isolar ilhotas do pâncreas do rato de forma eficaz.
- Reduzir a variabilidade entre lotes nas preparações enzimáticas.
- Otimizar a morfologia das ilhotas para aplicações de pesquisa.
Métodos Usados
- Isolamento do pâncreas do rato dos tecidos circundantes.
- Canulação do ducto biliar para infusão de enzimas.
- Inflação do pâncreas com uma mistura de colagenase-protease.
- Filtração e colocação das ilhotas isoladas para experimentação.
Principais Resultados
- Dissociação e isolamento bem-sucedidos das ilhotas.
- Melhoria da morfologia das ilhotas observada após o isolamento.
- Preparações de ilhotas de alta qualidade indicadas por testes de secreção de insulina.
- O método demonstrou variabilidade reduzida em comparação com técnicas tradicionais.
Conclusões
- O método descrito é eficaz para isolar ilhotas de alta qualidade.
- O uso de enzimas purificadas melhora a confiabilidade dos resultados.
- Esta técnica pode ser benéfica para vários ensaios envolvendo ilhotas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Isolation of primary pancreatic islets enables physiologically relevant assessment of beta cell function, which is critical for diabetes target validation and mechanistic de-risking. Variability in enzyme lot performance compromises reproducibility across discovery campaigns, impacting lead identification and predictive confidence. This protocol addresses lot-to-lot inconsistency through purified collagenase and neutral protease, supporting scalable, standardized islet preparation for preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of intracellular signaling pathways and secretory responses in primary islets, improving target hypothesis validation.
- Operational Value: Reduces biological noise from enzymatic variability, increasing confidence in target engagement readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides consistent islet yield and morphology for reliable glucose-stimulated insulin secretion assays.
- Operational Value: Standardized enzyme composition supports assay reproducibility across laboratories and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant beta cell biology for preclinical efficacy and toxicity studies.
- Operational Value: Facilitates cross-strain comparability when enzyme ratios are adjusted for species-specific tissue characteristics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, where primary islet function informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation using physiologically relevant human-like islet responses.
- Screening: Enables standardized, quantitative assessment of compound effects on insulin secretion.
- Analytics: Generates measurable dependent variables such as insulin secretion levels and islet yield for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-phase target modulation to preclinical outcomes through preserved islet morphology and function.
- Enterprise Reuse: Purified enzyme lots allow protocol reuse across projects, reducing re-optimization burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in beta cell responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of islet isolation across sites and studies.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in diabetes programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable islet-derived functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and pancreatic duct cannulation.
- Dependent on access to purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) with characterized activity.
- Necessitates standardization of enzyme ratios (e.g., 35:10 collagenase:protease) for consistent performance.
- Adaptation may be needed for non-C57BL/6 strains or rat models based on tissue density and enzyme accessibility.
- Practical limitation: Manual dissection and inflation steps constrain throughput without automation.
