Microdiálise de etanol durante a operante determinação auto-administração de etanol e etanol por cromatografia gasosa

O objetivo geral deste procedimento é monitorar os níveis de etanol no dialisato cerebral durante uma sessão de autoadministração de etanol. Para comparar essa medida com os comportamentos de autoadministração síncrona, isso é feito primeiro implantando cirurgicamente um guia de microdiálise, cânula e parafuso de amarração e, em seguida, treinando ratos para autoadministrar etanol operantemente. O segundo passo é habituar os ratos à corda do estágio principal para que ela não impeça a autoadministração de etanol durante a microdiálise.

Em seguida, a microdiálise é realizada durante uma sessão de autoadministração de etanol, durante a qual uma porção de dialato é preparada para análise de etanol. Em seguida, as amostras de dialato são analisadas quanto à concentração de etanol usando um cromatógrafo gasoso com detecção de ionização de chama. Em última análise, os resultados obtidos mostram o curso temporal do etanol atingindo a região cerebral de interesse durante uma sessão de autoadministração de etanol.

A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como punção da cauda ou da veia safena, é que esse procedimento é minimamente perturbador no momento da coleta da amostra e permite a medição do medicamento ao longo do tempo na região do cérebro de interesse enquanto o animal está realizando uma tarefa comportamental. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque ele requer uma série de habilidades especializadas, muitas das quais só podem ser adquiridas por meio de prática ou experiência repetidas. Também demonstrando o procedimento estará Jeffrey Dilley, assistente de pesquisa de graduação em nosso laboratório.

Todos os procedimentos com animais mostrados são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas e seguem todos os guias para o cuidado e uso dos regulamentos de Animais de Laboratório. A Universidade do Texas em Austin é uma instalação credenciada pelo ALAC: ratos Evans longos bem manuseados que foram implantados cirurgicamente com uma cânula de calibre 21 acima da região cerebral de interesse são usados para esses experimentos de microdiálise comportamental. Todos os animais devem receber pelo menos uma semana de cuidados pós-cirúrgicos e recuperação e estar saudáveis antes de iniciar os procedimentos seguintes.

Coloque o rato em uma câmara operante de associados médicos, equipada com uma alavanca retrátil e um tubo basculante e treine-o para pressionar a alavanca para acesso a uma solução de sacarose a 10%. Depois que o rato for treinado para responder à solução de sacarose, inicie-o em um cronograma de treinamento apropriado, durante o qual o etanol é gradualmente adicionado à solução em várias sessões de consumo na noite anterior à penúltima sessão operante. Depois de anestesiar o animal e verificar o nível de sedação, prenda a mola de amarração ao parafuso de amarração no estágio da cabeça do rato para habituá-lo ao aparelho que consiste em uma alavanca de contrapeso, braço, corda giratória, mola e suporte de anéis.

Permita que o rato passe a noite na sala operante em sua gaiola doméstica com ad lido, comida e água e, em seguida, complete a sessão de treinamento do dia seguinte com a corda e o equipamento que o acompanha no dia anterior ao experimento de microdiálise. Depois de anestesiar o rato com isof de flúor, verifique a sedação realizando uma pinça no dedo do pé e insira uma sonda de microdiálise perfundida com líquido cefalorraquidiano artificial. Prenda a sonda adequadamente e, em seguida, ajuste a taxa de fluxo da sonda para 0.2 microlitros por minuto.

Coloque o rato em sua gaiola doméstica na sala operante para passar a noite com todo o equipamento de diálise no lugar e adicione lib, comida e água. No dia seguinte à inserção da sonda, pelo menos duas horas antes do início do experimento, aumente a taxa de fluxo de trabalho da sonda. Usando uma seringa Hamilton, verifique se a taxa de fluxo da sonda é consistente e é de pelo menos 90% da taxa de fluxo definida.

Se estiver avaliando neurotransmissores nas amostras de diálise, colete amostras durante todas as fases do experimento. Comece coletando amostras de diálise enquanto o animal está em sua gaiola doméstica. Armazene as amostras de maneira apropriada para análise posterior.

Transfira cuidadosamente o rato para a câmara operante e inicie o programa operante que controla a câmara. Continue coletando amostras enquanto o rato espera que a alavanca se estenda para dentro da câmara duas amostras antes que a alavanca se estenda. Comece a coletar uma parte de cada amostra de dialisato para análise de etanol pipetando uma alíquota apropriada de dialisato em um frasco de vidro de dois mililitros e selando o frasco com um septo hermético, pipeta e sele as amostras de etanol rapidamente.

Como o etanol é volátil e o volume da amostra é pequeno, a preparação inconsistente ou lenta da amostra levará a resultados imprecisos. Armazene o restante para análise de neurotransmissores. O período de bebida de 20 minutos começa depois que o programa de computador da Med Associates estende a alavanca para dentro da câmara e o rato a pressiona para obter acesso a uma garrafa de solução para beber.

Continue a coletar amostras durante todo o período de bebida após o período de bebida, o programa de computador retrai a garrafa da câmara. Mantenha o animal na câmara por mais 20 minutos após a ingestão no final do experimento de microdiálise. Depois de anestesiar o rato, remova a sonda.

Se o animal não for imediatamente sacrificado humanamente, substitua o observador para garantir a visualização do trato da sonda. Colete o cérebro dentro de três dias após o experimento. Analise as amostras junto com os padrões externos de etanol usando um cromatógrafo gasoso com um detector de ionização de chama, um amostrador automático headspace, aquecido a 50 graus Celsius, e uma coluna capilar com hélio como fase móvel.

Para registrar e analisar os cromatogramas, use o software da estação de trabalho de cromatografia para preparar o sistema para a análise do etanol. Use um banho-maria de recirculação para aquecer a placa amostradora de automóveis e abrir os tanques de ar e hidrogênio. Em seguida, inicie o programa de inicialização.

Quando estiver pronto, inicie uma queima de 20 minutos, que descontamina a fibra. Faça padrões usando um balão volumétrico de 100 mililitros para diluir 238 microlitros de etanol a 95% com água até um volume final de 100 mililitros. Use uma diluição serial de um para um para criar padrões.

Pipetar os padrões para frascos de vidro e fechá-los exatamente como as amostras foram preparadas. Certifique-se de passar um branco de água junto com seus padrões. Coloque os padrões e samples na bandeja do amostrador automático e aqueça-os até que toda a alíquota líquida tenha sido vaporizada.

Para executar os padrões e amostras, crie uma lista de amostras observando qual amostra está em qual slot do amostrador automático e observando que cada amostra deve ser perfurada. Depois de rotear os arquivos de dados para uma pasta selecionada, selecione um método de escolha para as amostras e inicie a execução. Depois que o sistema tiver executado as amostras, verifique se o programa integrou corretamente cada pico.

Plot, a altura do pico em função de cada padrão externo conhecido. Concentração de etanol. Utilizar a função linear dada pelos pontos para interpolar a concentração de etanol de cada amostra de dialisato.

Esta figura mostra exemplos de cromatogramas para três concentrações de padrões de etanol e um para uma amostra de dialisato de rato coletada no final da sessão de autoadministração de etanol. Os picos de etanol devem ser relativamente simétricos, ter tempos de retenção consistentes e uma relação sinal-ruído superior a 10. O não cumprimento desses critérios significa que o sistema requer manutenção, cromatografia de qualidade e padrões corretos produzem uma curva padrão linear que é usada para calcular a concentração de etanol de amostras de dialisato coletadas de animais autoadministrados com etanol ao longo de sua autoadministração.

As concentrações derivadas de etanol de dialisato não são corrigidas para recuperação in vivo da sonda e são apenas uma fração da concentração de etanol cerebral no tecido. Se for necessária microdiálise quantitativa de etanol, a fração de extração de etanol que se difunde do espaço extracelular para a sonda é determinada experimentalmente. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente quatro a cinco horas se for executada corretamente.

Isso varia de acordo com a duração da sessão comportamental. A conclusão bem-sucedida da fase de microdiálise do experimento depende muito da qualidade das fases preparatórias. Ao tentar este procedimento, é importante ter certeza de que seus ratos estão bem manuseados e que você os habituou a quaisquer estímulos possivelmente perturbadores que possam ocorrer durante o experimento de diálise, para que o comportamento de autoadministração do animal não seja afetado.