Name: Microdiálise de etanol durante a operante determinação auto-administração de etanol e etanol por cromatografia gasosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprenda microdialise cerebral em ratos durante auto-administração de etanol para farmacologia comportamental. Este método utiliza cromatografia gasosa com detecção por ionização de chama para análise em tempo real.

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<li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shell+of+the+nucleus+accumbens+has+a+higher+dopamine+response+compared+with+the+core+after+non-contingent+intravenous+ethanol+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration.</a> Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).</li>
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<li>Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Microdialysis+of+Ethanol+in+Rat+Striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).</li>
</ol>

Este artigo foi financiada pela Med Associates, Inc.

Aplicações e limitações Auto-administração de drogas é usado em roedores para dependência de drogas modelo. Muitas drogas de abuso que são modelados deste modo podem ser administradas por via intravenosa, em que o fármaco é distribuído directamente para o compartimento central. Isso permite um acompanhamento de perto da dose durante uma sessão de auto-administração. Uma vez que o etanol é geralmente auto-administrado oralmente, é muito mais difícil de controlar os níveis da droga devido a diferenças individuais na absorção e metabolismo. Utilizando microdiálise para amostra da região do cérebro de interesse, não só são capazes de monitorar o padrão de etanol atingindo a região, mas também são capazes de monitorar simultaneamente alterações de neurotransmissores na mesma região ao longo do tempo durante cada fase de auto-administração. Alterações neuroquímicas e respostas induzidas pela droga no cérebro está associada com abuso e dependência de drogas, assim, a capacidade para medir simultaneamenteneuroquímica certeza e concentrações de drogas durante específicas de auto-administração fases fornece uma ferramenta muito poderosa e única. Uma questão a ter em mente para correlacionar as concentrações de dialisato de analitos com comportamento são as características físicas do encanamento microdiálise. Especificamente, o tempo necessário para o fluido a ser transferido a partir do lúmen da sonda de microdiálise para o tubo de recolha é crítica, e tempos mais curtos são melhores. Em nosso laboratório, nós construir as sondas de modo que o tempo é de cerca de 90 segundos. Usando estas condições, verificou-se que há um aumento da dopamina accumbal no início do consumo de etanol, que diminui ao longo dos períodos de bebida e de pós-bebe com o aumento da concentração de etanol de dialisato. 2,3,8,9 Estas experiências , quando combinado com os dados de estudos farmacológicos, permitiram-nos para analisar os efeitos farmacológicos estritamente de etanol e de auto-administração associados sinais ambientais em changes em concentrações de neurotransmissores. Deve notar-se que esta aplicação particular de combinados comportamental microdiálise técnicas é adequada para os interesses de pesquisa do nosso laboratório. Ele foi concebido para avaliar o padrão temporal de etanol atingir o cérebro, em comparação com o padrão de alterações de neurotransmissores, na mesma região, de modo que podemos relacionar estas medidas síncronos de auto-administração comportamentos. As concentrações de etanol derivados de dialisado não foram corrigidos para a recuperação in vivo da sonda, e são apenas uma fracção da concentração de tecido cerebral de etanol. Se microdiálise quantitativa de etanol é necessário, a fracção de extracção de etanol, que se difunde a partir do espaço extracelular para dentro da sonda deve ser determinado experimentalmente. Veja publicações anteriores de nosso laboratório de métodos e uma discussão mais aprofundada. 10,11,12 Embora este protocolo ilustra o uso de gás de chromatography juntamente com microextração em fase sólida de etanol a partir do espaço livre de amostras de microdiálise, outros métodos para a análise do teor de etanol na amostra de microdiálise poderia ser utilizado. Contudo, métodos alternativos podem sofrer de algumas desvantagens. Por exemplo, menos sensíveis métodos analíticos podem exigir um maior volume de amostra que requer tempos de amostragem superior a 5-7 minutos ilustrado aqui. O tipo de sistema discutido aqui utiliza uma microextração em fase sólida que se concentra o etanol na fase de vapor no tubo de amostragem selado, permitindo a absorção para a fibra colocada no espaço superior do frasco. Isto melhora o limite de detecção em comparação com a amostragem headspace directa, que normalmente permite 50-100 microlitros do vapor a ser injectado. Outra grande vantagem do método é que o espaço superior da amostra injectada para análise é extremamente limpa e livre de sais. A injecção directa da amostra de microdiálise líquido também pode ser utilizado com maior SensITivity, mas isso vai exigir mais instrumento o tempo devido à manutenção regular necessária para limpar os sais injetados. Resolução de problemas e outras notas <ol><li> Antes de sua experiência começa, dar-se muito tempo para verificar que seus microdiálise set-ups estão funcionando corretamente e na solução de problemas quaisquer problemas. Sugerimos que você tem um extra set-up, perfundidos com ACSF, pronto para mudar-se com uma avaria set-up para poupar tempo, como a maioria das sessões operantes tendem a ocorrer em um momento específico a cada dia. </li><li> Certifique-se de que as sondas de microdiálise são inseridos ao longo de um período de cerca de 5 min para minimizar o dano de tecido produzido por corte do tecido, como a sonda penetra no cérebro. </li><li> Ao transferir o rato para a câmara operante é útil ter uma segunda pessoa auxiliar de modo a que a linha de transferência (parte da microdiálise set-up) não se tornando emaranhada, e de modo a que o programa possa ser operante o initiated a tempo. </li><li> Certifique-se de que dá ao autosampler abundância banho de água de tempo para atingir a temperatura adequada. Nosso sistema geralmente requer duas horas para chegar a 50 ° C. Além disso, garantir que as amostras são completamente vaporizado antes de analisar as amostras. Nós normalmente confirmar visualmente que isso tenha ocorrido antes de iniciar a análise da amostra. </li><li> Padrão de boas práticas de química analítica deve ser seguido. Estes incluem, mas não estão limitados a, a validação dos indivíduos, o equipamento e procedimentos. Em breve, nós empregamos as seguintes diretrizes: usuários individuais devem demonstrar a capacidade de gerar reproduzíveis valores de altura de pico para as concentrações padrão e lineares curvas padrão (R2 ≥ 0,99) de vários dias. Para verificar o sistema GC-FID está funcionando corretamente, as normas devem ser sempre ser analisados ​​antes de qualquer amostra de dialisato são injetados. A curva padrão gerada deve ter um R2 ≥ 0,99. </li><li> A maior parte do equipamento que usafoi adquirido através de Varian, Inc., que foi adquirida pela Agilent Technologies em 2010. Neste momento, Instrumentos Bruker científicos obtidos laboratório Varian cromatografia gasosa negócio instrumentos. Para futuras compras, consultar ou empresa. </li><li> O presente protocolo mostra o comportamento operante com ratos, mas o espectador deve estar ciente de que mais perturbações de comportamento é provável de ocorrer com o modelo mais pequeno rato. Outra questão a ter em conta é que a colocação de uma sonda de microdiálise em outras regiões do cérebro do que o córtex pré-frontal medial ou núcleo accumbens pode perturbar o comportamento operante em um grau maior do que o mostrado aqui. É importante examinar de perto inúmeros parâmetros comportamentais para determinar se os danos causados ​​pela colocação da sonda produz alterações graves de comportamento. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Etanol 95% </td><td> AAPER Álcool e Chemical Co., Shelbyville, KY </td><td> E190, 111000190 </td></tr><tr><td> Ultra-Pura Sacarose </td><td> MP Biomedicals, LLC, Solon, OH </td><td> 821721 </td></tr><tr><td> Ultra Alta Pureza Hélio </td><td> Ar Gás </td><td> HE UHP300 </td></tr><tr><td> Ar </td><td> Ar Gás </td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td> Hidrogênio </td><td> Ar Gás </td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td> GC 2 ml frascos </td><td> Agilent </td><td> # 8010-0015 </td></tr><tr><td> Tampas dos frascos GC com PTFE / silicone septos </td><td> Agilent </td><td> # 8010-0084 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes específicos

microdiálise de etanol durante a operante determinação auto-administração de etanol e etanol por cromatografia gasosa

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operantes de auto-administração de métodos são usados ​​para estudar os efeitos comportamentais e farmacológicos de muitas drogas de abuso, incluindo etanol. No entanto, o etanol é tipicamente auto-administrados por via oral, por via intravenosa, em vez de como muitas outras drogas de abuso. A farmacocinética dos fármacos administrados por via oral são mais complexas do que as drogas por via intravenosa. Devido a compreensão da relação entre os efeitos farmacológicos e comportamentais de etanol requer um conhecimento da evolução no tempo de etanol chegar ao cérebro, durante e depois de beber, usamos microdiálise in vivo e cromatografia gasosa com detector de ionização de chama para monitorar as concentrações de etanol no cérebro de dialisado ao longo do tempo. Combinados microdiálise-comportamentais experiências envolvem a utilização de várias técnicas. Neste artigo, a cirurgia estereotáxica, a formação e comportamento de microdiálise, que pode ser adaptado para testar uma multiplicidade de auto-administração e neurochemical centrada hipóteses, estão incluídos apenas para ilustrar como eles se relacionam com as fases subseqüentes de coleta e análise de amostras de etanol dialisado. Dialisado análise da concentração de etanol através de cromatografia em fase gasosa com detecção de ionização de chama, o qual é específico para os estudos de etanol, é descrita em detalhe. Os dados produzidos por estes métodos revelam o padrão de etanol chegar ao cérebro, durante o processo de auto-administração e, quando combinadas com a análise das amostras neuroquímica dialisato mesmas, permite tirar conclusões acerca dos efeitos farmacológicos e comportamentais de etanol.

Um método para determinar o curso de tempo da concentração de etanol no cérebro de ratos durante etanol operante a auto-administração é descrita. Cromatografia em fase gasosa com detecção por ionização de chama é utilizado para quantificar o etanol nas amostras de dialisato, porque não tem a sensibilidade necessária para os pequenos volumes que são gerados.

Microdiálise de etanol durante a operante determinação auto-administração de etanol e etanol por cromatografia gasosa

Métodos de autoadministração operante são comumente utilizados para estudar os efeitos comportamentais e farmacológicos de muitas drogas de abuso, incluindo o etanol.

O objetivo geral deste procedimento é monitorar os níveis de etanol no dialisato cerebral durante uma sessão de autoministração de etanol. Para comparar essa medida com os comportamentos de autoministração simultâneos, realiza-se primeiramente a implantação cirúrgica de uma cânula-guia de microdialisato, cânula e parafuso de fixação, seguida pelo treinamento de ratos para autoministrar etanol por meio operante. O segundo passo consiste em habituar os ratos ao suporte de fixação craniano, de modo que este não interfira na autoministração de etanol durante a microdialisato.Em seguida, realiza-se a microdiálise durante uma sessão de autoministração de etanol, na qual uma porção do dialisato é preparada para análise de etanol. A seguir, as amostras de dialisato são analisadas quanto à concentração de etanol utilizando um cromatógrafo a gás com detecção por ionização de chama. Por fim, os resultados obtidos mostram a cinética de chegada do etanol à região cerebral de interesse durante uma sessão de autoministração de etanol.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a punção da cauda ou da veia safena, é que este procedimento é minimamente invasivo no momento da coleta da amostra e permite a medição de fármacos ao longo do tempo na região cerebral de interesse enquanto o animal realiza uma tarefa comportamental. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades, pois ela exige uma série de habilidades especializadas, muitas das quais só podem ser adquiridas mediante prática ou experiência repetida. Também demonstrará o procedimento Jeffrey Dilley, um assistente de pesquisa de graduação em nosso laboratório.Todos os procedimentos com animais mostrados são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade do Texas e seguem todas as orientações para o cuidado e uso de animais de laboratório. A Universidade do Texas em Austin é uma instalação credenciada pela ALAC que utiliza ratos Long Evans bem manuseados, os quais foram cirurgicamente implantados com uma cânula de 21 gauge acima da região cerebral de interesse, para esses experimentos comportamentais de microdiálise. Todos os animais devem receber pelo menos uma semana de cuidados pós-cirúrgicos e recuperação, e devem estar saudáveis antes de iniciar os procedimentos a seguir.Coloque a rata em uma câmara operante da Med Associates, equipada com uma alavanca retrátil Lichter e um tubo dosador, e treine-a a pressionar a alavanca para obter acesso a uma solução de sacarose a 10%. Após o rato ser treinado para responder pela solução de sacarose, inicie-o em um cronograma de treinamento apropriado, durante o qual o etanol é gradualmente adicionado à solução ao longo de múltiplas sessões de ingestão na noite anterior à penúltima sessão operante. Após anestesiar o animal e verificar o nível de sedação, prenda a mola do cânula ao parafuso do cânula no suporte craniano do rato para habituá-lo ao aparelho, que consiste em uma alavanca de contrapeso, braço, cânula rotativa, mola e suporte de anéis.Deixe a rata passar a noite na sala de condicionamento operante, dentro de sua gaiola com acesso livre a alimento e água, e então realize a sessão de treinamento do dia seguinte com o cânula e equipamentos associados posicionados no dia anterior ao experimento de microdiálise. Após anestesiar a rata com isoflurano, verifique a sedação realizando um aperto no dedo do pé e insira uma sonda de microdiálise perfundida com fluido céfalo-raquidiano artificial. Fixe adequadamente a sonda e, em seguida, ajuste a taxa de fluxo da sonda para 0,2 microlitros por minuto.Coloque a rata em sua gaiola de origem na sala operante para passar a noite com todo o equipamento de diálise no lugar e forneça à vontade alimento e água. No dia seguinte à inserção da sonda, pelo menos duas horas antes do início do experimento, aumente a vazão da sonda até sua taxa de funcionamento. Utilizando uma seringa Hamilton, verifique se a vazão da sonda é constante e está pelo menos em 90% da taxa de fluxo definida.Se for avaliar neurotransmissores nas amostras de diálise, colete amostras durante todas as fases do experimento. Comece coletando amostras de diálise enquanto o animal estiver em sua gaiola de origem. Armazene as amostras de maneira apropriada para análises posteriores.Transfira cuidadosamente a rata para a câmara operante e inicie o programa operante que controla a câmara. Continue coletando amostras enquanto a rata aguarda a extensão da alavanca para dentro da câmara, coletando duas amostras antes da alavanca se estender. Comece a coletar uma fração de cada amostra de dialisado para análise de etanol pipetando uma alíquota apropriada do dialisado em um frasco de vidro de dois mililitros e selando o frasco com uma septa hermética, pipete e selando rapidamente as amostras de etanol.Como o etanol é volátil e o volume da amostra é pequeno, uma preparação inconsistente ou lenta da amostra levará a resultados imprecisos. Armazene o restante para análise de neurotransmissores. O período de ingestão de 20 minutos começa após o programa de computador da Med Associates estender a alavanca na câmara e a ratazana pressioná-la para obter acesso a uma garrafa com solução para ingestão.Continue a coletar amostras durante todo o período de ingestão da bebida; após esse período, o programa de computador retira a garrafa da câmara. Mantenha o animal na câmara por um período adicional de 20 minutos após a ingestão, ao final do experimento de microdiálise. Após anestesiar a rata, remova a sonda.Se o animal não for eutanasiado de forma humanitária imediatamente, substitua o obturador para garantir a visualização do trajeto da sonda. Colete o cérebro dentro de três dias após o experimento. Analise as amostras juntamente com padrões externos de etanol utilizando um cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama, um amostrador automático de fase de cabeça aquecido a 50 graus Celsius e uma coluna capilar com hélio como fase móvel.Para registrar e analisar os cromatogramas, utilize um software de estação de trabalho cromatográfica para preparar o sistema para análise de etanol. Use um banho de água com recirculação para aquecer a placa do amostrador automático e abra os cilindros de ar e hidrogênio. Em seguida, inicie o programa de inicialização.Quando estiver pronto, inicie uma queima de 20 minutos, a qual descontamina a fibra. Prepare padrões utilizando um balão volumétrico de 100 mililitros para diluir 238 microlitros de etanol 95% com água até um volume final de 100 mililitros. Utilize uma diluição seriada um para um para criar os padrões.Pipete os padrões em vials de vidro e feche-os exatamente como foram preparadas as amostras. Certifique-se de incluir um branco de água junto com seus padrões. Coloque os padrões e as amostras na bandeja do amostrador automático e aqueça-os até que toda a alíquota líquida tenha sido vaporizada.Para executar os padrões e as amostras, crie uma lista de amostras indicando qual amostra está em cada posição do amostrador automático e observando que cada amostra deve ser perfurada. Depois de direcionar os arquivos de dados para uma pasta selecionada, escolha um método apropriado para as amostras e inicie a execução. Após o sistema ter processado as amostras, verifique se o programa integrou corretamente cada pico.Trace o gráfico da altura do pico em função de cada padrão externo conhecido. Concentração de etanol. Utilize a função linear fornecida pelos pontos para interpolar a concentração de etanol em cada amostra de dialisato.Esta figura mostra cromatogramas de exemplo para três concentrações de padrões de etanol e um de uma amostra de dialisado de rato coletada ao final da sessão de automedicação de etanol. Os picos de etanol devem ser relativamente simétricos, apresentar tempos de retenção consistentes e uma relação sinal-ruído superior a 10. O não cumprimento desses critérios indica que o sistema necessita de manutenção, cromatografia de qualidade e padrões corretos, que produzem uma curva padrão linear utilizada para calcular a concentração de etanol nas amostras de dialisado coletadas de animais que se automedicam com etanol ao longo da sessão de automedicação.As concentrações de etanol no dialisato derivado não são corrigidas pela recuperação do sonda in vivo e representam apenas uma fração da concentração tecidual de etanol no cérebro. Se for necessária microdiálise quantitativa de etanol, a fração de extração do etanol que difunde do espaço extracelular para dentro da sonda é determinada experimentalmente. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente quatro a cinco horas, se for executada corretamente.Isso variará com base na duração da sessão comportamental. A conclusão bem-sucedida da fase de microdiálise do experimento depende grandemente da qualidade das fases preparatórias. Ao tentar realizar este procedimento, é importante garantir que seus ratos sejam bem manipulados e que tenham sido habituados a quaisquer estímulos potencialmente perturbadores que possam ocorrer durante o experimento de diálise, de modo que o comportamento de automedicação do animal não seja afetado.

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Neuroscience

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