Método de extrusão constante pressão controlada para a Preparação de vesículas lipídicas nanométricas

O objetivo geral do experimento a seguir é apresentar um método de preparação robusto para vesículas lipídicas biologicamente relevantes. Isso é conseguido misturando e transferindo fosfolipídios para frascos de vidro e hidratando-os com tampão aquoso para criar uma suspensão SLE multilamela. Como segunda etapa, é realizado um método de congelamento e descongelamento, que posteriormente resulta na produção de Vesículas Ella a partir de vesículas multilamelas.

Em seguida, a suspensão de lipossomas é passada através de uma extrusora usando a pressão ideal determinada para produzir vesículas lipídicas homogêneas de um tamanho desejado. Foram obtidos resultados que mostram tamanhos consistentes de vesículas submicrônicas com base no espalhamento dinâmico de luz e análise de rastreamento de nanopartículas. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como sonicação e sedimentação, é que este método usa um sistema de controle de pressão com taxas de fluxo de nitrogênio determinadas ideais para uma preparação eficiente do tamanho da vesícula lipídica.

Para iniciar este procedimento, recupere um frasco de vidro de 20 mililitros com uma tampa revestida de Teflon, limpe todos os copos e seringas com clorofórmio antes de usar para evitar contaminação. Transfira 100 microlitros de clorofórmio de grau reagente para o frasco de vidro usando uma seringa de vidro hermética de 250 microlitros. Adicione 30 microlitros de metanol de grau reagente ao mesmo frasco de vidro usando uma seringa de vidro hermética de 100 microlitros.

Prepare uma solução lipídica de colesterol de papoula pop C de dois milimolares transferindo 216 microlitros de 10 miligramas por mililitro pop C 42 microlitros de 10 miligramas por mililitro. Pop e 20 microlitros de 11 miligramas por mililitro. As soluções de colesterol para o frasco de vidro de 20 mililitros evaporam os solventes orgânicos usando argônio de fluxo lento ou gás nitrogênio até que uma fina película de lipídios seja observada no fundo do frasco, coloque o frasco de vidro destampado em um dessecador a vácuo por pelo menos 30 minutos.

Para remover o solvente residual, transfira dois mililitros de tampão previamente passados por um filtro de 0,2 mícron para o frasco de vidro para hidratar os lipídios. Incubar a mistura a quatro graus Celsius durante a noite e usar dentro de 48 horas para tamanhos de lipossomas de 30 a 100 nanômetros. Libere a suspensão de lipossomas em nitrogênio líquido por 15 segundos.

Em seguida, descongelar a suspensão de lipossomas utilizando um bloco de aquecimento a 42 graus SIUs durante cerca de três minutos. Repita o processo de congelamento e descongelamento por um total de cinco ciclos. O congelamento e subsequente descongelamento produz Ella Les a partir de vesículas multilamelas e aumenta a eficiência de retenção de lipídios durante a extrusão.

Em seguida, prepare-se para a extrusão seguindo as instruções do Avastin para montar cuidadosamente a lipo tão rápido. A montagem correta da extrusora LF 50 é fundamental para evitar vazamento de nitrogênio, o que afeta as taxas de fluxo desejáveis. Para garantir o sucesso, execute as etapas a seguir com cuidado.

Para produzir uma vedação hermética. Coloque a tela de suporte do orifício grande na base do filtro de suporte, seguida pelo prato central circular, um disco de drenagem e uma membrana de policarbonato. Coloque o pequeno O-ring preto na parte superior da membrana e prenda-o à base do filtro de suporte.

Fixe a extrusora do filtro superior apertando quatro parafusos nos quatro orifícios correspondentes. Monte a unidade extrusora de filtro embaixo do grande barril da extrusora. Adicione a solução lipossomal ao cilindro no topo do cilindro de extrusão.

Coloque um grande O-ring circular, tampa estreita, grande O-ring circular e tampa circular. Conecte o regulador de gás à parte superior do barril da extrusora e feche todas as válvulas para evitar vazamento de ar, incluindo a válvula de alívio de pressão. Coloque um frasco de vidro de 20 ml ou um frasco erlenmeyer de 50 ml sob a unidade de filtro da extrusora.

Uma válvula de segurança é conectada ao regulador e será liberada se a pressão exceder 600 PS. Eu ligo o gás nitrogênio e abro a válvula de gás conectada à extrusora. Aumente a pressão de nitrogênio para 25 PSI para lipossomas de 400 nanômetros para 125 PSI para lipossomas de 100 nanômetros e para 400 a 500 PSI para lipossomas de 30 nanômetros. Observe a suspensão de lipossomas até que ela seja ejetada para o recipiente enquanto é empurrada pelo nitrogênio.

Mantenha o nitrogênio fluindo até que nenhum líquido seja observado. Passando pelo filtro da extrusora para o arquivo de vidro para realizar a análise DLS. Primeiro, prepare 50 microlitros de uma solução de lipossomas de 20 micromolares diluída em solução salina tamponada com fosfato ou PBS.

Em seguida, ligue a fonte de alimentação e a fonte da lâmpada. Prossiga para abrir o software dynapro. Defina o software para o modelo de algoritmo para detectar lipossomas no tamanho desejado.

Depois de conectar ao hardware pipetar 14 microlitros de amostra de lipossomas no quartzo vete e inserir no suporte da célula, pressione start após aproximadamente 20 a 30 aquisições, pressione stop. Analise os picos médios de diâmetro dos lipossomas registrados no histograma. A análise de rastreamento de nanopartículas começa com a preparação de uma solução de lipossomas de 500 microlitros 0,1 micromolar solubilizada em PBS, enxágue o compartimento da amostra com água e etanol.

Em seguida, seque o compartimento de amostra com uma toalha de papel sem fiapos. Ligue a fonte de alimentação do laser e o computador fornecerá 300 microlitros de solução de lipossomas 0,1 molar ao compartimento de amostras. Abra o controle de temperatura e o software de análise de rastreamento de nanopartículas.

Pressione o botão de captura para ligar o laser. Use os ajustes horizontais e verticais para mover a platina e ajustar o foco do microscópio. Defina a temperatura desejada e o tempo de gravação.

Pressione o botão de gravação para tirar vários quadros das partículas de lipossomas por um período de tempo especificado. Analise os picos correspondentes aos tamanhos dos lipossomas de diâmetro no histograma, pois ele rastreia o movimento de cada partícula. DLS é um método estabelecido que coleta luz espalhada para determinar o diâmetro da partícula e foi realizado para determinar os tamanhos dos lipossomas.

Os lipossomas hidratados foram extrudados através de membranas de policarbonato em vários tamanhos e pressões, conforme descrito no protocolo escrito. Os diâmetros dos lipossomas medidos por DLS para o tamanho dos poros de 30 nanômetros foram de 66 mais ou menos 28 nanômetros. Para o tamanho dos poros de 100 nanômetros era de 138 mais ou menos 80 nanômetros, e para o tamanho dos poros de 400 nanômetros era de 360 mais ou menos 25 nanômetros.

Uma suspensão de grânulos de Irene polidos de 50 nanômetros foi usada como padrão de calibração, onde registrou um diâmetro de 47 mais ou menos 16 nanômetros. A porcentagem de dispersão poli mostra que não há sobreposição dentro dos tamanhos dos lipossomas. É típico observar diâmetros superiores a 30 nanômetros ao usar a análise DLS devido ao conhecido viés que este instrumento tem em relação a partículas maiores.

Apesar dessa limitação instrumental, a curva de calibração descreve uma correlação linear. A análise de rastreamento de nanopartículas é uma nova tecnologia que mede o tamanho de cada partícula a partir de observações diretas de difusão em um meio líquido, independente do índice de refração ou densidade da partícula. Esta técnica de alta resolução pode ser usada para complementar a medição de lipossomas com DLS, os diâmetros registrados pela NTA de 95 mais ou menos 48 nanômetros e 356 mais ou menos 51 nanômetros para duas soluções de poliestireno de 100 nanômetros e 400 nanômetros foram usadas para calibração.

As soluções lipídicas têm um diâmetro mais comparável em relação ao DLS, produzindo tamanhos médios de 29 mais ou menos 14 nanômetros para tamanho de poro de 30 nanômetros, 95 mais ou menos 17 nanômetros para tamanho de poro de 100 nanômetros e 359 mais ou menos 73 nanômetros para tamanho de poro de 400 nanômetros. A NTA pode ser uma técnica de caracterização mais geral para quantificar partículas microscópicas, uma vez que sua sensibilidade permite a medição de partículas de 50 a 1000 nanômetros. A curva de calibração mostra uma correlação linear entre a pausa da membrana de policarbonato versus a transmissão de coloração negativa do diâmetro NTA registrada As imagens de microscopia eletrônica mostram cada tamanho de lipossomo seguindo os tamanhos de extrusão 3, 100 e 400 nanômetros claramente distintos um do outro.

A ampliação foi ajustada para 25.000 vezes com a barra de escala representando 0,5 mícrons. Um experimento de curso de tempo foi conduzido com três tamanhos de lipossomas. O DLS foi medido para cada solução de lipossomas imediatamente após a extrusão.

Todas as soluções de lipossomas foram armazenadas a quatro graus Celsius durante a noite. Seus diâmetros foram registrados novamente pelo DLS após uma incubação noturna. Pouca ou nenhuma alteração foi observada após um período de incubação de 60 horas Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que várias passagens pelo filtro de extrusão melhorarão a homogeneidade da solução Vesco.

Além disso, lembre-se de usar frascos e seringas de vidro para a preparação da amostra para evitar a contaminação por lixiviação por tubos de polipropileno do clorofórmio.