Name: Método de extrusão constante pressão controlada para a Preparação de vesículas lipídicas nanométricas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Aprenda a preparar vesículas lipídicas homogêneas usando extrusão com pressão controlada por nitrogênio. Este método garante tamanhos submicrométricos consistentes para aplicações em bioquímica e nanotecnologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelo Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Collaborative Innovation Award. LAM foi apoiada pela sinalização e regulação celular do Instituto Nacional de Saúde treinamento de subvenção (T32 GM008759) eo NIH Ruth L. Kirschstein Fellow Pré-Doutorado (CA165349-01). Gostaríamos de agradecer ao Prof Michael Stowell (CU Boulder), Prof Douglas Rees e Prof Rob Phillips (Caltech) para os seus valiosos comentários.

1. Preparação de lipossomas <ol><li> Recuperar a 20 mL frasco de vidro com tampa de teflon. </li><li> Limpar todo o material de vidro e seringas com clorofórmio antes de usar para evitar a contaminação. </li><li> Transferir 100 uL de clorofórmio grau de reagente para o frasco de vidro usando uma seringa de vidro de 250 uL estanque ao ar. </li><li> Adicionar 30 ul de metanol de grau reagente para o frasco de vidro mesmo usando uma seringa de vidro de 100 uL estanque ao ar. </li><li> Para preparar um 2 mM 7:1.5:1.5 fosfatidilcolina (POPC): fosfatidiletanolamina (POPE): solução lipídica colesterol, transferir 216 uL de 10 mg / POPC mL, 42 uL de 10 uL mg / mL POPE e 20, de 11 mg / mL As soluções de colesterol em CHCI3 para o frasco de vidro de 20 ml. </li><li> Evapora-se os solventes orgânicos, utilizando-lento fluxo de árgon ou de azoto gasoso até uma película fina de lípidos é observado no fundo do frasco. </li><li> Colocar o frasco de vidro não nivelada num exsicador de vácuo durante pelo menos 30 minutos para remover o solvente residual. </li><li> Transfer 2 mL de tampão, previamente passados ​​através de um filtro de 0,2 micron, para o frasco de vidro para hidratar os lípidos. </li><li> Incubar a mistura a 4 ° C durante a noite e utilizar dentro de 48 horas. </li></ol> 2. Congelar e descongelar-: Para tamanhos de lipossomas 30 - 100 nm Apenas <ol><li> Congelar suspensão de lipossomas em azoto líquido durante 15 segundos. </li><li> Descongelar suspensão de lipossomas utilizando um bloco de aquecimento a 42 ° C de temperatura para ~ 3 minutos. </li><li> Repetir os passos 2.1 e 2.2 para um total de 5 ciclos. </li></ol> 3. Extrusão Siga as instruções corretamente Avestin para montar a extrusora LF-50 Liposofast, usando o contorno instrumento em seu livro-guia. <ol><li> Colocar o suporte de tela grande furo (com furos circulares) na base de suporte do filtro, seguido pelo prato circular sinterizado (sem buracos), um disco de drenagem (25 mm de diâmetro), e uma membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro). </li><li> Coloque o pequeno, pretoO-ring no topo da membrana para fixá-lo para a base de suporte do filtro. </li><li> Fixe a extrusora superior filtro apertando 4 parafusos nos 4 furos correspondentes. </li><li> Montar a unidade de filtro para o extrusor por baixo do tambor da extrusora grande. Adicionar a solução de lipossomas para o tambor do cilindro. Coloque o seguinte no topo do barril de extrusão na ordem: circular grande O-ring, tampão estreito, circular grande O-ring, tampão circular. </li><li> Fixe o regulador de gás ao topo barril da extrusora e fechar todas as válvulas para evitar fugas de ar, incluindo a válvula de alívio de pressão. Coloque um frasco de vidro de 20 mL ou 50 mL Erlenmeyer sob a unidade de filtro extrusora. Uma válvula de segurança está ligado ao regulador e irá libertar se a pressão excede 600 psi. Ligue o gás de azoto e abrir a válvula de gás ligada à extrusora. </li><li> Aumente a pressão de nitrogênio a 25 psi para 400 nm lipossomas, 125 psi para 100 nm, lipossomas e psi 400-500 para 30 nm lipossomas. </li><li> Assista ao susp lipossomasension como se ejecta para dentro do recipiente enquanto está a ser empurrado pelo azoto. Mantenha o fluxo de nitrogênio até deixar de observar qualquer líquido que passa através do filtro de extrusora para dentro do frasco de vidro. </li></ol> 4. Dinâmica de espalhamento de luz Analysis (DLS) <ol><li> Preparar 50 uL de uma solução 20 mM de lipossomas. </li><li> Ligue o fonte de alimentação e da fonte de luz. </li><li> Abra o software DynaPro. </li><li> Defina o software para o modelo de algoritmo MS / X para detectar lipossomas de 30 nm e 100 nm e MS800 modelo algoritmo para detectar&gt; 100 nm lipossomas. </li><li> Conecte-se ao hardware. </li><li> Pipete 14 da amostra de lipossomas na cuvete de quartzo e de inserção no suporte de célula. </li><li> Pressione o botão start. </li><li> Pressione parar após ~ 20 - 30 aquisições. </li><li> Analisar os picos médios de diâmetro de lipossomas gravados no histograma. </li></ol> 5. Análise de nanopartículas Tracking (NTA) <ol><li> Prepara-se uma uL 500, 0,1 mM de lipossomassolução. </li><li> Lavar o compartimento da amostra com água e etanol. </li><li> Seque o compartimento de amostra com uma toalha de papel que não solte fiapos. </li><li> Ligar a fonte de energia laser e do computador. </li><li> Entregar 300 uL de solução 0,1 mM de lipossomas para o compartimento da amostra. </li><li> Abra o controle da temperatura e da nanopartícula software Análise Tracking. </li><li> Pressione Capturar botão para ligar o laser. </li><li> Use os ajustamentos horizontais e verticais para mover o estágio e ajustar a focagem do microscópio. </li><li> Ajustar a temperatura desejada (20 ° C) e tempo de gravação (pelo menos 30 segundos). </li><li> Pressione o botão Record para tirar várias molduras das partículas de lipossomas para um período de tempo especificado. Analisar os picos correspondentes aos diâmetros de lipossomas no histograma em que controla o movimento de cada partícula. </li></ol> 6. Os resultados representativos Um esquema que define o método de extrusão é pressentia na Figura 1. Para obter resultados óptimos, a preparação de lipossomas com diâmetros de 30 nm requer uma elevada pressão de ~ 500 psi e diâmetros de 100 nm requer uma pressão de 125 psi para alcançar uma taxa rápida de filtro. Para diâmetros de 400 nm, uma baixa pressão de 25 psi ~ é recomendado para alcançar uma taxa mais lenta de filtro, que permite que as vesículas para alongar e formar lipossomas maiores, homogéneos. Realizamos uma série de experimentos para determinar a pressão ideal para a produção consistentes tamanhos micro-sub vesícula. Nós variou a pressão, bem como o número de extrusão passa através de filtros de policarbonato com poros de dimensão 30, 100, e 400 nm e descobriu pressão adequada para cada tamanho desejado. Por 30 poros nm, a pressão abaixo de 500 psi irá reduzir a taxa de fluxo, causando alongamento e tamanhos de vesículas, assim, de maiores dimensões. Para 100 nm poros, um fluxo constante foi realizada em 125 psi. Para 400 nm poros, de baixa pressão (25 psi) permite que as vesículas para alongar em maior vesícula sizes. Um fluxo de filtração lenta gota a gota, é ideal para criar maior sub-micron vesículas 13. Realizou-DLS para determinar os tamanhos de lipossomas extrudida através de três tamanhos de diâmetros diferentes, ou seja, 30, 100 e 400 nm. DLS é um método estabelecido que recolhe a luz dispersa para determinar o diâmetro da partícula. Nós, os extrudados lipossomas hidratados de 2 mm através de uma membrana de policarbonato 30 nm a 500 psi com 5 passa através do poro do filtro; uma membrana de policarbonato de 100 nm a 125 psi com 5 passa através do poro do filtro e uma membrana de policarbonato de 400 nm a 25 psi com 2 passa através do poro do filtro. Os diâmetros dos lipossomas e medidos por DLS para 30, 100 e 400 nm tamanhos de poros foram de 66 ± 28, 138 ± 18 e 360 ± 25 nm (Figura 2). Uma suspensão de 50 pérolas de poliestireno nm foi utilizado como um padrão de calibração, como mostrado na Figura 2, onde se registado um diâmetro de 47 ± 16 nm. O polydispe por centorsity mostra que não há sobreposição dentro de tamanhos de lipossomas. É típico de observar diâmetros superiores a 30 nm quando se utiliza DLS análise devido ao viés conhecido este instrumento tem para partículas maiores de 12. Intensidades de dispersão da luz de partículas grandes e pequenas são recolhidos simultaneamente a partir de um método de detecção e, portanto, mais difícil de resolver os lipossomas em suspensão 12. Apesar desta limitação instrumental, a curva de calibração descreve uma correlação quase linear. NTA é uma nova tecnologia que mede o tamanho de cada partícula a partir de observações directas de difusão em um meio líquido, independente do índice de refracção das partículas ou densidade. Esta técnica de alta resolução pode ser usado para completar a medição de lipossomas com DLS. A NTA registada diâmetros de 95 ± 48 e 356 ± 51 nm, duas 100 nm e 400 nm soluções de poliestireno foram utilizados para a calibração. Soluções lipídicas de 30 nm e 100 nm foram observados ter uma mais comp<html> diâmetro arável em relação aos DLS como mostrado na Figura 3, produzindo tamanhos médios de 29 ± 14, 95 ± 17 e 359 ± 73 nm. A NTA pode ser uma técnica de caracterização mais geral para quantificar as partículas microscópicas, desde a sua sensibilidade lhe permite medir as partículas de 50 - 1000 nm. A curva de calibração mostra uma correlação linear entre os poros da membrana de policarbonato, versus o diâmetro NTA gravada. <table border="1"><tbody><tr><td> Tamanhos lipossomas </td><td> Limiar de detecção </td><td> Tamanho da Partícula esperado mínima (nm) </td></tr><tr><td> 30 nm </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 nm </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Parâmetros NanoSight. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Gráfico de fluxo do método de extrusão, que descreve como a pressão eo fluxo de azoto controla a homogeneidade de diferentes diâmetros de lipossomas. Após a hidratação lipossoma, vesículas unilamelares de diferentes tamanhos são extrudidas através de diferentes policarbonato poros da membrana de filtro em diferentes pressões. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> Figura 2. Dinâmicos espalhamento de luz (DLS) dados que descrevem os tamanhos de lipossomas quantitativos seguintes extrusão. (A) Os gráficos de barras são mostrados para descrever os diâmetros das três amostras de lipossomas. Um padrão de calibração de 50 nm de poliestireno (PS) pérolas foi utilizado como uma referência. Os diâmetros médios de lipossomas são indicados acima da barra para cada amostra. O eixo x descreve os tamanhos dos poros dos quais as soluções foram extrudida através de. O eixo y descreve o diâmetro gravado por DLS. Embora os 30 nm e 100 nm de registo tamanhosed valores superiores do que os seus tamanhos de poros, enquanto o tamanho maior nm 400 gravado um tamanho ligeiramente menor, a curva de calibração (b) mostra uma correlação quase linear, em que o eixo x expressa os tamanhos dos poros da membrana de policarbonato, eo eixo y descreve o gravado diâmetro lipossoma por DLS. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> Figura 3. Nanopartículas de Rastreamento de Análise (NTA) dados que descrevem os tamanhos de lipossomas após a extrusão. (A) Os gráficos de barras representam o diâmetro de cada amostra de lipossoma. O eixo x descreve os tamanhos dos poros dos quais as soluções foram extrudida através de. O eixo y descreve o diâmetro de tamanho gravado pelo NTA. Os diâmetros médios de lipossomas são rotulados por cima de cada amostra. (B) A curva de calibração NTA mostra uma correlação mais linear do que a curva de calibração DLS entre os tamanhos dos poros da membrana de filtro versus o diâmetro gravada. O eixo x descreve os tamanhos dos poros da membrana de policarbonato. O eixo y descreve o diâmetro gravada lipossoma por NTA. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> Figura 4. Negativas mancha de transmissão de electrões de microscopia (TEM) mostrando imagens cada tamanho de lipossoma (500 uM), seguido por extrusão. Grelhas de carbono Formvar malha foram negativamente descarregada antes da coloração da amostra, onde acetato de uranilo 1% em água foi utilizado para corar as amostras antes da secagem e de imagem em 34.000 ampliação ×. Tamanhos 30, 100, e 400 nm são claramente distintas umas das outras. A ampliação foi definida a 25.000 ×. A barra de escala representa 0,5 micron. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> Figura 5. Uma experiência de tempo-curso foi realizado com três tamanhos de lipossomas. Dispersão dinâmica de luz (DLS) foi medido para cada solução de lipossoma de extrusão imediatamente a seguir. Todas as soluções de lipossomas foram armazenados em 4 °C durante a noite. Seus diâmetros foram registados pelos DLS após uma incubação durante a noite. Pouca ou nenhuma alteração foi observada após um período de incubação de 16 horas.

<ol><li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes%3A+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li>
<li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li>
<li>Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin-mediated+bending+of+the+target+membrane+is+a+critical+step+in+Ca%282%2B%29-regulated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion.</a> Cell. 138, 709-721 (2009).</li>
<li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).</li>
<li>Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li>
<li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+polymorphism%3A+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li>
<li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+method+for+the+size+separation+of+homogeneous+fluorescein-encapsulating+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes.</a> J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).</li>
<li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).</li>
<li>Chonn, A., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+liposomal+drug-delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in liposomal drug-delivery systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).</li>
<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).</li>
<li>Matsuoka, K., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+liposomes+to+study+COPII-+and+COPI-coated+vesicle+formation+and+membrane+protein+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting.</a> Methods. 20, 417-428 (2001).</li>
<li>Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. , (2011).</li>
<li>Hunter, D. G., Frisken, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Usando o Avestin Liposofast Extrusor LF-50, foi demonstrado como pequeno porte, lipossomas sintéticos são preparados através de um sistema de pressão controlada. É importante notar que as vesículas multilamelares formam-se espontaneamente após a hidratação de lipossomas, que pode levar à produção de nanopartículas menores. Estas pequenas vesículas multilamelares inevitavelmente fluir através do maior tamanho dos poros da membrana de policarbonato, causando heterogeneidade em soluções de vesículas unilamelares produzidos...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Clorofórmio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02432-25ML </td><td> Os estabilizadores 95% </td></tr><tr><td> Metanol de grau elevado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179.337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Extrusora LF-50 Liposofast </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfolipídios </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Os poros de policarbonato </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td> 25 mm de diâmetro </td></tr><tr><td> Escorra discos PE </td><td> Avestin, Inc. </td><td> 230600 </td><td> 25 mm de diâmetro </td></tr></tbody></table>

método de extrusão constante pressão controlada para a preparação de vesículas lipídicas nanométricas

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Os lipossomas são vesículas preparadas artificialmente constituídos por fosfolípidos naturais e sintéticos que são amplamente utilizados como uma membrana celular imitando plataforma para estudar proteína-proteína e proteína-lípido interacções 3, o monitor de entrega de drogas 4,5, e de encapsulamento 4. Fosfolípidos naturalmente criar bicamadas lipídicas curvos, distinguindo-se a partir de uma micela. 6 Os lipossomas são tradicionalmente classificados por tamanho e número de bicamadas, ou seja, grandes vesículas unilamelares (LUV), pequenas vesículas unilamelares (SUVs) e vesículas multilamelares (MLV) 7. Em particular, a preparação de lipossomas homogéneos de vários tamanhos é importante para o estudo de curvatura da membrana que desempenha um papel vital na sinalização celular, endo e exocitose, a fusão da membrana, e tráfico proteína 8. Vários grupos analisar como as proteínas são usadas para modular processos que envolvem a curvatura da membrana e, assim, preparar lipossomas de diâmetros &lt;100 - 400nm para estudar seu comportamento em funções celulares 3. Outros concentram-se em lipossoma-droga de encapsulação, estudando os lipossomas como veículos para transportar e distribuir uma droga de interesse 9. Encapsulação do fármaco pode ser conseguida como relatado durante a formação do lipossoma 9. O nosso passo de extrusão não deve afectar o fármaco encapsulado por duas razões, ou seja, o encapsulamento da droga (1) deve ser alcançado antes de este passo e (2) lipossomas devem manter a sua estabilidade natural biofísica, de forma segura realização da droga no núcleo aquoso. Estes objetivos da pesquisa sugerem ainda a necessidade de um método otimizado para projetar estáveis ​​vesículas mícron sub-lipídicos. No entanto, as actuais tecnologias de preparação de lipossomas (sonicação 10, congelamento-descongelamento e-10, sedimentação) não permitem a preparação de lipossomas com a superfície altamente curvo (isto é, &lt;diâmetro de 100 nm) com elevada consistência e eficácia 10,5, o que limita a biofísica estudos de um EMERGIcampo ng de detecção de curvatura da membrana. Aqui, nós apresentamos um método de preparação sólida para uma variedade de lipossomas biologicamente relevantes. Extrusão manual, utilizando gás-apertados seringas e membranas de policarbonato 10,5 é uma prática comum, mas heterogeneidade é frequentemente observado quando se utiliza tamanhos de poro inferior a 100 nm devido à devido à variabilidade de pressão manual aplicada. Foram utilizados um aparelho de extrusão de pressão constante controlada para preparar lipossomas sintéticos cujos diâmetros variam entre 30 e 400 nm. Dispersão dinâmica de luz (DLS) 10, 11 e microscopia de electrões análise de nanopartículas de seguimento (NTA) 12 foram utilizados para quantificar os tamanhos de lipossomas, tal como descrito no nosso protocolo, com poliestireno comercial (PS) pérolas utilizadas como um padrão de calibração. Uma correlação linear perto foi observada entre os tamanhos dos poros e trabalhadores dos lipossomas determinados experimentalmente, indicando alta fidelidade da nossa preparação pressão controlada lipossoma conhecihod. Além disso, mostrámos que este método de preparação de vesículas de lípidos é geralmente aplicável, independente de vários tamanhos de lipossomas. Por fim, também têm demonstrado em um estudo curso de tempo que estes lipossomas preparados foram estáveis ​​durante até 16 horas. Um representante de tamanho nano protocolo de preparação de lipossomas é demonstrado abaixo.

Este protocolo descreve um método de extrusão para a preparação de vesículas lipídicas de sub-micron tamanhos com um elevado grau de homogeneidade. Este método utiliza um sistema de pressão controlada, com taxas de azoto controlados de fluxo para a preparação de lipossomas. A preparação de lípidos<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Extrusão de lipossomas, e caracterização do tamanho será aqui contidas.

Método de extrusão constante pressão controlada para a Preparação de vesículas lipídicas nanométricas

Os lipossomas são vesículas preparadas artificialmente, compostas por fosfolipídios naturais e sintéticos, que são amplamente utilizadas como uma plataforma de mimetização da membrana celular...

O objetivo geral do experimento a seguir é apresentar um método de preparação robusto para vesículas lipídicas de relevância biológica. Isso é alcançado pela mistura e transferência de fosfolipídios para frascos de vidro e sua hidratação com tampão aquoso para criar uma suspensão de vesículas multilamelares (SLE). Como segundo passo, realiza-se um método de congelamento e descongelamento, que subsequentemente resulta na produção de vesículas Ella a partir de vesículas multilamelares.Em seguida, a suspensão de lipossomos é passada por um extrusor utilizando a pressão ideal determinada para produzir vesículas lipídicas homogêneas de um tamanho desejado. Foram obtidos resultados que demonstram tamanhos consistentes de vesículas submicrométricas com base na dispersão dinâmica da luz e na análise de rastreamento de nanopartículas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como sonicação e sedimentação, é que este método utiliza um sistema de controle de pressão com taxas de fluxo de nitrogênio ideais determinadas para o preparo eficiente do tamanho das vesículas lipídicas.Para iniciar este procedimento, obtenha um frasco de vidro de 20 mililitros com tampa revestida de teflon, limpe todo o material de vidro e as seringas com clorofórmio antes do uso para evitar contaminação. Transfira 100 microlitros de clorofórmio grau reagente para o frasco de vidro utilizando uma seringa de vidro hermética de 250 microlitros. Adicione 30 microlitros de metanol grau reagente ao mesmo frasco de vidro utilizando uma seringa de vidro hermética de 100 microlitros.Prepare uma solução lipídica de colesterol pop C a dois milimolares transferindo 216 microlitros de pop C a 10 miligramas por mililitro, 42 microlitros de pop E a 10 miligramas por mililitro e 20 microlitros de colesterol a 11 miligramas por mililitro para um frasco de vidro de 20 mililitros. Evapore os solventes orgânicos utilizando um fluxo lento de argônio ou gás nitrogênio até que uma película fina de lipídios seja observada no fundo do frasco. Coloque o frasco de vidro sem tampa em um dessecador a vácuo por pelo menos 30 minutos.Para remover o solvente residual, transfira dois mililitros de tampão previamente passado por um filtro de 0,2 mícrons para o frasco de vidro para hidratar os lipídios. Incube a mistura a quatro graus Celsius durante a noite e utilize dentro de 48 horas para lipossomos com tamanhos entre 30 e 100 nanômetros. Congele a suspensão de lipossomos em nitrogênio líquido por 15 segundos.Em seguida, descongele a suspensão de lipossomos utilizando um bloco de aquecimento a 42 graus SIUs por aproximadamente três minutos. Repita o processo de congelamento e descongelamento por um total de cinco ciclos. O congelamento e subsequente descongelamento produz Ela Les a partir de vesículas multilamelares e aumenta a eficiência de aprisionamento lipídico durante a extrusão.Em seguida, prepare-se para a extrusão seguindo as instruções do Avastin para montar cuidadosamente o lipo tão rápido. A montagem correta do extrusor LF 50 é fundamental para evitar vazamentos de nitrogênio, o que afeta as taxas de fluxo desejadas. Para garantir o sucesso, realize os seguintes passos com cuidado.Para produzir um selo hermético, coloque a tela de suporte de orifício grande na base do filtro de suporte, seguida pelo disco circular central, um disco drenante e uma membrana de policarbonato. Coloque a pequena junta preta (O-ring) sobre a membrana e fixe-a à base do filtro de suporte.Prenda o extrusor de filtro superior apertando quatro parafusos nos quatro orifícios correspondentes. Monte a unidade de extrusão de filtro abaixo do cilindro grande do extrusor. Adicione a solução de lipossomos ao cilindro superior do barril de extrusão.Coloque uma junta toróica grande, tampa estreita, outra junta toróica grande e a tampa circular. Conecte o regulador de gás à parte superior do cilindro do extrusor e feche todas as válvulas para evitar vazamento de ar, incluindo a válvula de alívio de pressão. Posicione um frasco de vidro de 20 mililitros ou um erlenmeyer de 50 mililitros sob a unidade de filtro do extrusor.Uma válvula de segurança está conectada ao regulador e será acionada se a pressão exceder 600 PSI. Ligue o gás nitrogênio e abra a válvula de gás conectada ao extrusor. Aumente a pressão de nitrogênio para 25 PSI para lipossomos de 400 nanômetros, até 125 PSI para lipossomos de 100 nanômetros, e para 400 a 500 PSI para lipossomos de 30 nanômetros. Observe a suspensão de lipossomos até que ela seja expelida para o recipiente, sendo empurrada pelo nitrogênio.Mantenha o fluxo de nitrogênio até que nenhum líquido seja observado. Passando pelo filtro do extrusor até o frasco de vidro para realizar a análise de DLS. Primeiro, prepare 50 microlitros de uma solução de lipossoma a 20 micromolar diluída em solução salina tamponada com fosfato ou PBS.Em seguida, ligue a fonte de energia e a fonte da lâmpada. Prossiga abrindo o software dynapro. Configure o software para o modelo de algoritmo que detecte lipossomos no tamanho desejado.Após conectar-se ao equipamento, pipete 14 microlitros da amostra de lipossoma no vial de quartzo e insira-o no suporte da cubeta; pressione iniciar. Após aproximadamente 20 a 30 aquisições, pressione parar. Analise os picos do diâmetro médio dos lipossomos registrados no histograma. A análise de rastreamento de nanopartículas começa com a preparação de uma solução de lipossomos de 500 microlitros a 0,1 micromolar solubilizada em PBS; enxágue o compartimento da amostra com água e etanol.Em seguida, seque o compartimento da amostra com um papel toalha livre de fiapos. Ligue a fonte de alimentação do laser e o computador, e adicione 300 microlitros de solução de lipossoma 0,1 molar ao compartimento da amostra. Abra o controle de temperatura e o software de análise de rastreamento de nanopartículas.Pressione o botão de captura para ligar o laser. Utilize os ajustes horizontais e verticais para mover a platina e ajustar o foco do microscópio. Defina a temperatura desejada e o tempo de gravação.Pressione o botão de gravação para capturar múltiplos quadros de imagem das partículas de lipossoma por um período de tempo especificado. Analise os picos correspondentes aos tamanhos de diâmetro dos lipossomas no histograma conforme ele rastreia o movimento de cada partícula. A DLS é um método estabelecido que coleta luz dispersa para determinar o diâmetro das partículas e foi realizada para determinar os tamanhos dos lipossomas.Os lipossomos hidratados foram extrudidos através de membranas de policarbonato em diversos tamanhos e pressões, conforme descrito no protocolo escrito. Os diâmetros dos lipossomos medidos por DLS para tamanho de poro de 30 nanômetros foram de 66 ± 28 nanômetros. Para tamanho de poro de 100 nanômetros, foram de 138 ± 80 nanômetros, e para tamanho de poro de 400 nanômetros, foram de 360 ± 25 nanômetros.Uma suspensão de microesferas de Irene politidas de 50 nanômetros foi utilizada como padrão de calibração, registrando um diâmetro de 47 ± 16 nanômetros. A porcentagem de polidispersidade indica que não há sobreposição entre os tamanhos dos lipossomos. É comum observar diâmetros superiores a 30 nanômetros ao utilizar análise de DLS, devido ao viés conhecido desse instrumento em relação a partículas maiores.Apesar dessa limitação instrumental, a curva de calibração descreve uma correlação linear. A análise de rastreamento de nanopartículas é uma tecnologia nova que mede o tamanho de cada partícula a partir de observações diretas da difusão em um meio líquido, independentemente do índice de refração ou da densidade da partícula. Essa técnica de alta resolução pode ser usada para complementar a medição de lipossomos com DLS; os diâmetros registrados por NTA de 95 mais ou menos 48 nanômetros e 356 mais ou menos 51 nanômetros para duas soluções de poliestireno de 100 nanômetros e 400 nanômetros foram utilizados para calibração.As soluções lipídicas apresentam diâmetro mais comparável ao DLS, produzindo tamanhos médios de 29 ± 14 nanômetros para tamanho de poro de 30 nanômetros, 95 ± 17 nanômetros para tamanho de poro de 100 nanômetros e 359 ± 73 nanômetros para tamanho de poro de 400 nanômetros. A ANP pode ser uma técnica de caracterização mais geral para quantificar partículas microscópicas, já que sua sensibilidade permite a medição de partículas entre 50 e 1000 nanômetros. A curva de calibração mostra uma correlação linear entre a pausa da membrana de policarbonato versus o diâmetro registrado pela ANP. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão com contraste negativo mostram cada tamanho de lipossomo após extrusão — tamanhos de 3, 100 e 400 nanômetros — claramente distintos entre si.A ampliação foi ajustada para 25.000 vezes, com a barra de escala representando 0,5 mícrons. Um experimento de curso temporal foi realizado com três tamanhos de lipossomos. A DLS foi medida para cada solução de lipossomos imediatamente após a extrusão.Todas as soluções de lipossomos foram armazenadas a quatro graus Celsius durante a noite. Seus diâmetros foram registrados novamente por DLS após uma incubação noturna. Pouca ou nenhuma alteração foi observada após um período de incubação de 60 horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que múltiplas passagens através do filtro de extrusão melhorarão a homogeneidade da solução Vesco.Além disso, lembre-se de usar frascos e seringas de vidro para o preparo da amostra, a fim de evitar contaminação por lixiviação proveniente de tubos de polipropileno pelo clorofórmio.

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Vesículas unilamelares grandes (LUVs) bioquimicamente definidas são um sistema modelo conveniente para analisar as interações da família BCL-2, com implicações diretas na melhor compreensão da via mitocondrial da apoptose. Apresenta-se um método para produção de LUVs, juntamente com combinações padrão de proteínas da família BCL-2 e controles para examinar a permeabilização de LUVs.

Examinando BCL-2 Função Família com grandes vesículas unilamelares

Descrevemos um protocolo para preparação de bicamadas lipídicas suportadas e sua caracterização usando microscopia de força atômica e espectroscopia de força.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Lipossomas contendo amphiphiles de cadeia única, particularmente os ácidos gordos, apresentam propriedades distintas, em comparação com aqueles que contém diacylphospholipids devido às propriedades químicas únicas de cadeia única amphiphiles. Aqui descrevemos técnicas para a preparação, purificação e utilização de lipossomas composto em parte ou toda a estes amphiphiles.

Preparação, purificação e utilização de lipossomas contendo ácido graxo

Com suporte sólido, isento de proteína, dobro fosfolipídeo BICAMADA membranas (DLBM) podem ser transformadas em redes de nanotubo de lipídios complexos e dinâmicos e podem servir como modelos 2D de baixo para cima do retículo endoplasmático.

Formação espontânea e rearranjo das redes de nanotubo lipídica Artificial como um modelo de baixo para cima para o retículo endoplasmático

Este estudo descreve a hidratação clássica utilizando o método de filme lipídico fino para preparo de nanolipoalguns seguido de caracterização de nanopartículas. Uma proteína 47 kDa-hidrófilo e globular, Tarin, é encapsulada com sucesso como uma estratégia para melhorar a estabilidade, evitar o afastamento rápido, e promover a liberação controlada. O método pode ser adaptado ao encapsulamento de moléculas hidrofóbicas.

Preparação e caracterização de Nanolipossomas para a aprisionamento de proteínas globulares hidrofílicas bioativas

O objetivo do protocolo é medir de forma confiável as propriedades mecânicas da membrana de vesículas gigantes por aspiração micropipette.

Obtenção de vesículas híbridas unilamellares gigantes por eletroformação e medição de suas propriedades mecânicas pela aspiração micropipette

Este artigo descreve os protocolos de preparação de amostras, redução de dados e análise de dados em estudos de eco de giro de nêutrons (NSE) de membranas lipídicas. A rotulagem criteriosa de deutério de lipídios permite o acesso a diferentes dinâmicas de membrana em comprimento mesoscópico e escalas de tempo, sobre as quais ocorrem processos biológicos vitais.

Espectroscopia de Eco de Rotação de Nêutrons como uma sonda única para dinâmicas de membrana lipídica e interações membrana-proteína

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

Aqui, um sistema de bicamada lipídica suportado por nanobar é desenvolvido para fornecer uma membrana sintética com uma curvatura definida que permite a caracterização de proteínas com capacidade de detecção de curvatura in vitro.

Um Sistema de Bicamada Lipídica Suportado por Nanobar para o Estudo de Proteínas de Detecção de Curvatura de Membrana in vitro

Um protocolo experimental é apresentado para montar, estimular eletricamente e analisar bicamadas de interface de gotículas dopadas com gramicidina A. As relações estrutura-função lipídio-proteína são quantificadas medindo mudanças na área da membrana, fluxo iônico e condutância de canal único, e relacionando essas respostas a mudanças semelhantes à plasticidade na condução iônica em um modelo de membrana inspirado em sinapses elétricas.

Caracterização da Estrutura e Função da Membrana Lipídio-Proteína usando Bicamadas de Interface de Gotículas

Aprenda a preparar vesículas lipídicas homogêneas usando extrusão com pressão controlada por nitrogênio. Este método garante tamanhos submicrométricos consistentes para aplicações em bioquímica e nanotecnologia.

Método de extrusão constante pressão controlada para a Preparação de vesículas lipídicas nanométricas

Explorar mais vídeos