Fabricação e uso de microarranjos microambiente (MEArrays)

O objetivo geral do experimento a seguir é medir os efeitos de diferentes microambientes sobre as funções celulares de tipos celulares aderentes, expondo-os em paralelo a uma diversa coleção de microambientes Combinator. Isso é alcançado primeiramente pela fabricação de substratos de impressão para suportar a absorção de misturas de proteínas microambientais. Em seguida, são preparadas placas-mestre de proteínas microambientais, que são usadas para imprimir matrizes de ME utilizando um robô de impressão de microarranjos com pinça de ganso ou pinça capilar.

Em seguida, são preparadas placas-mestre de proteínas microambientais. Então, células aderentes são cultivadas na matriz ME com a opção de limitar o número de células. Os resultados obtidos demonstram o impacto dos diferentes microambientes sobre funções celulares, como diferenciação ou proliferação, com base na análise de imunofluorescência.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando desejávamos quantificar os efeitos dos microambientes teciduais nas decisões de destino de células-tronco humanas de memória, mas percebemos que trabalhar in vivo é impossível. Agora que foi desenvolvido, possui diversas aplicações na biologia celular, pesquisa e descoberta de fármacos. O PDMS é utilizado como um substrato que imita tecidos mais rígidos, pois é barato, fácil de preparar e fácil de imprimir.

No entanto, a hidrofobicidade do PDMS pode torná-lo incompatível com algumas linhagens celulares ao se trabalhar com dispositivos de PDMS. Use luvas sem látex, pois o látex pode inibir a polimerização do PDMS. Para iniciar, em um copo plástico descartável, combine a base de elastômero de silicone Cigar 184 com o agente de cura na proporção de 10 para 1 e misture vigorosamente com um depressor lingual de madeira ou plástico.

Em seguida, desgaseifique a mistura em uma câmara de vácuo à temperatura ambiente por 30 minutos. Agora, posicione centralmente uma lâmina de microscópio padrão sobre o porta-lâmina a vácuo acionado de uma centrífuga de revestimento por centrifugação, depois goteje 0,5 mililitros do polímero elastomérico misturado no centro da superfície da lâmina e realize o revestimento por centrifugação a 6.000 RPM por 60 segundos. Cure as lâminas revestidas com PDMS a 70 graus Celsius por quatro horas ou durante a noite.

As lâminas podem ser armazenadas hermeticamente à temperatura ambiente por vários meses. O PA é um hidrogel que pode imitar tecidos mais moles na faixa em que as células de PA só aderirão a pontos onde houver proteínas que suportem a adesão celular. Comece por gravar as lâminas com hidróxido de sódio.

Coloque as lâminas em um bloco de aquecimento a 80 graus Celsius. Adicione uma gota de um mililitro de hidróxido de sódio 0,1 normal em cada lâmina. Certifique-se de cobrir toda a superfície da lâmina, caso contrário a PA falhará.

Deixe o hidróxido de sódio evaporar, deixando um filme branco. Repita este processo se a superfície não estiver completamente coberta. A lâmina pode ser armazenada em temperatura ambiente por vários dias, se necessário.

Em seguida, recubra as lâminas com um PES em uma capela. Coloque as lâminas em um recipiente de 15 mililitros. Adicione 300 microlitros de um PES sobre cada lâmina gravada com hidróxido de sódio.

Deixe o PES A reagir com os lados do hidróxido de sódio exatamente por cinco minutos. Não mais que isso. Lave bem o PES A com água desionizada duas a três vezes em ambos os lados das lâminas.

Caso contrário, oxidará e formará um depósito marrom nas lâminas na próxima etapa. Agora aspire todas as soluções das superfícies das lâminas para cada recipiente. Adicione 25 mililitros de glutaraldeído 0,5% em PBS.

Coloque as lâminas no escuro e aguarde 30 minutos. Após 30 minutos, aspire toda a solução de glutaraldeído da superfície da lâmina. Em seguida, seque as lâminas cuidadosamente usando papel absorvente sem fiapos.

As lâminas podem agora ser armazenadas à temperatura ambiente durante a noite, se necessário. Após preparar e desgaseificar as misturas de PA, coloque-as no gelo para retardar sua polimerização. Pouco antes de preparar as lâminas, adicione persulfato de amônio e TEMED a cada mistura no gelo e misture-as usando uma pipeta por cinco a dez segundos.

Agora, pipete a mistura de PA sobre as superfícies da lâmina. A quantidade de PA varia de acordo com a dureza desejada do gel. Em seguida, coloque lamínulas de vidro sobre o PA sem aplicar qualquer pressão para evitar a formação de bolhas.

Deixe o gel de PA polimerizar por duas horas e, em seguida, remova as lamínulas sob água desionizada. Lave as lâminas com gel de PA com água em frascos coplan grandes durante a noite. No dia seguinte, para remover as acrilamidas não reativas, seque as lâminas até que o gel de PA endureça completamente.

As lâminas podem então ser armazenadas a quatro graus Celsius por um mês em uma caixa de lâminas selada. Para começar, uma câmara de plástico é colocada ao redor do arranjo impresso a partir de uma lâmina com duas câmaras. Remova as câmaras e corte-as ao meio com uma lâmina de barbear.

Use uma ponteira de pipeta de um mililitro para aplicar um filete fino de silicone para aquário na borda de uma câmara e pressione-a contra a superfície de um arranjo Emmy. Evite tocar o silicone em qualquer parte dos elementos do arranjo. Garantir uma boa fixação das câmaras culturais ao arranjo Emmy é crucial, pois falhas na adesão das câmaras permitem o vazamento do meio, o que pode resultar em morte celular generalizada.

Para lâminas revestidas com PDMS, bloqueie as lâminas incubando-as em solução aquosa de F 108 a 1% por 15 minutos sob vácuo para ambos os tipos de gel. Enxágue os arranjos três vezes com meio de cultura celular contendo antibióticos, sendo cinco minutos por lavagem. Isso remove monômeros não reativos, que podem ser tóxicos para as células no caso dos géis de PA. Após a terceira lavagem, permita uma incubação adicional de 30 minutos no meio para reidratar o gel.

Agora coloque quatro a cinco matrizes em uma placa de Petri estéril de 15 centímetros. À placa, adicione metade do volume final do meio com as células de interesse na concentração necessária para sua aplicação. As matrizes ME devem ser colocadas em uma incubadora apropriada para a manutenção do tipo celular utilizado.

Verifique a fixação uniforme das células aos elementos impressos sob microscópio a cada 15 a 20 minutos durante a observação. Agite suavemente os arranjos de ME para distinguir células aderidas e flutuantes. O tempo de adesão varia, mas geralmente é concluído dentro de duas horas em um arranjo de ME codificado com PA.

Após atingir a saturação da ligação ou o limite de tempo, aspire as células não ligadas e complete o recipiente até o volume final em matrizes ME com revestimento de PDMS. A remoção de todo o meio matará as células. Portanto, para todas as trocas de meio nestas lâminas, substitua sucessivamente metade do volume do meio e, em seguida, complete o recipiente até o volume final.

O cultivo pode prosseguir por muitos dias com trocas normais de meio. Fixadores comuns, como paraformaldeído, aldeído e acetona metanólica, são compatíveis com os sistemas de matriz Emmy. Não se esqueça de que, mesmo ao colorir, as matrizes ME revestidas com PDMS devem permanecer úmidas.

Portanto, prossiga com a técnica de substituição de volume pela metade para preparar lâminas dos arranjos de ME corados. Use uma lâmina de barbear para remover as câmaras e montar lamínulas utilizando flora. A proteína G foi depositada em um arranjo de ME codificado em PDMS impresso utilizando pinos de silício com ponta quadrada em um pino de penas.

A deposição de várias proteínas por robô de impressão de microarranjos foi verificada por imunofluorescência utilizando anticorpos. As diluições das soluções proteicas na placa mestre refletiam a quantidade que foi depositada sobre a superfície dos substratos, onde as células aderiram às estruturas impressas de maneira nitidamente padronizada. Da mesma forma, o mesmo padrão evidente de adesão celular ocorre quando um arranjo Emmy é impresso em escala de 40.000 passos.

Os dois proteínas de microambiente do gel PA induziram perfis de expressão de queratina dependentes da concentração em uma linhagem celular de progenitoras epiteliais mamárias humanas multpotentes. A razão logarítmica dos sinais de queratina oito para os sinais de queratina 14 ilustra a variação e a reprodutibilidade do sinal. Após 24 horas de cultivo, as células não ligadas são removidas por lavagem em uma análise de 12 matrizes me.

Foram utilizadas análises estatísticas padrão para determinar se as diferentes diluições de colágeno tipo um e de p-caderina humana recombinante alteravam a expressão de queratina. Inicialmente, não houve variação em relação à média entre as células nas características logo após a adesão. No entanto, após 24 horas, altas concentrações de colágeno tipo um induziram significativamente maior expressão de queratina oito.

Enquanto altas concentrações de PCA aqui induziram um forte sinal de queratina 14. Esse achado é consistente com relatos anteriores sobre células progenitoras de memória bipotentes. Devido à natureza dinâmica e recíproca dessas interações entre células e seu microambiente, essas células podem alterar a composição dos microambientes impressos.

Portanto, para compreender os impactos agudos dos microambientes impressos, o tempo de exposição não deve exceder 48 horas após este procedimento. Qualquer processo celular que possa ser mensurado, por fluorescência ou outro método, pode ser avaliado como uma função do microambiente, a fim de responder perguntas adicionais, como: como diferentes microambientes alteram as respostas a fármacos em linhagens de câncer? Isso é determinado por alterações na apoptose e na proliferação.

Ou como os microambientes alteram a diferenciação dos progenitores.