Name: Fabricação e uso de microarranjos microambiente (MEArrays) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Aprenda a fabricar e usar microarranjos de microambiente para analisar funções celulares como diferenciação e proliferação. Este método combinatório permite estudar efeitos do microambiente em tipos celulares aderentes.

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<ol><li>Bissell, M. J., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context%2C+tissue+plasticity%2C+and+cancer%3A+are+tumor+stem+cells+also+regulated+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment.</a> Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape%2C+cytoskeletal+tension%2C+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).</li>
<li>LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+progenitor+cell+fate+decsions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).</li>
<li>Kim, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Methods+for+Polymers+in+Cell+and+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering.</a> Annals of biomedical engineering. , (2012).</li>
<li>Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+elastic+properties+of+polyacrylamide+gels%3A+implications+for+quantification+of+cellular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces.</a> Biorheology. 46, 191-205 (2009).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+hydrogel+substrates+with+tunable+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10(2010).</li>
<li>Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+matrix+microarray+for+probing+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation.</a> Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).</li>
<li>Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+regulation+of+human+neural+precursor+cell+differentiation+using+arrays+of+signaling+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 37(2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado permite MEArray análises funcionais da célula e interacções microambiente combinatórias 4. Análise MEArray combina o uso de tecnologias micropatterning básicos, biologia celular, e robôs de microarranjos de impressão e dispositivos de análise que estão disponíveis em instalações multiusuários muitos. MEArray telas são compatíveis com tipos de células mais aderentes, embora formulações meios isentos de soro podem necessitar de ser ajustado em alguns casos, de modo a incluir BSA ou &lt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Lâminas de vidro 25 mm x 75 mm </td><td> VWR </td><td> 48311-600 </td><td></td></tr><tr><td> Lamínulas de vidro (no.1) 24 mm x 50 mm </td><td> VWR </td><td> 48393-241 </td><td></td></tr><tr><td> Prato de coloração (ou frasco Coplan) </td><td> VWR </td><td> 25461-003 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de petri (15 cm) </td><td> BD Falcon </td><td> 351058 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH (1,0 N) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S2567 </td><td></td></tr><tr><td> APES (&gt; 98% de (3-aminopropil) trietoxissilano) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3648 </td><td></td></tr><tr><td> Glutaraldeído </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7651 </td><td> 50% em água </td></tr><tr><td> APS (&gt; Persulfato de amónio 98%) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td> Preparar uma solução de trabalho de 10% com DDQ 2 O </td></tr><tr><td> TEMED (N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilenodiamina) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Acrilamida (40%) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4058 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-acrilamida (2% w / v) </td><td> Fisher biorreagentes </td><td> BP1404-250 </td><td></td></tr><tr><td> 0,45 um filtro de seringa de nylon de 4 mm </td><td> Nalgene </td><td> 176-0045 </td><td></td></tr><tr><td> FITC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F4274 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS (polidimetilsiloxano) </td><td> Dow Corning </td><td> 3097358-1004 </td><td> Sylgard kit Elastômero 184 via Adesivos Ellsworth </td></tr><tr><td> 2-lâminas de câmara </td><td> NUNC </td><td> 177380 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F108 </td><td> BASF </td><td> 30089186 </td><td></td></tr><tr><td> Aquselante arium </td><td> Dow Corning </td><td> DAP 00688 </td><td></td></tr><tr><td> Fluormount-G </td><td> Southern Biotech </td><td> 0100-01 </td><td></td></tr><tr><td> Copos plásticos descartáveis </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Abaixadores de língua </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Luvas de borracha nitrílica </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Caixas de plástico de slides de microscópio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spin-coater </td><td> WS-400B-6NPP/LITE </td><td> Laurell Technologies Corporation </td><td></td></tr><tr><td> Forno </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hotplate Digital </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 384 poços </td><td></td><td></td><td> Uma marca adequada para o robô microarray </td></tr><tr><td> Microarray robô impressão </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fase invertido e microscópio de fluorescência </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Axon microarray scanners </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> Existem várias configurações </td></tr></tbody></table>

fabricação e uso de microarranjos microambiente (mearrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

As interações entre as células e seu microambiente circundante tem consequências funcionais para o comportamento celular. No nível de célula única, microambientes distintos podem impor diferenciação, migração, proliferação e fenótipos, e sobre o nível do tecido processa o microambiente complexo como a morfogénese e tumorigénese 1. Não só o celular e molecular conteúdo de microambientes impacto que as células dentro, mas assim como a elasticidade 2 e 3 geometria do tecido. Definido como a soma total de célula-célula,-ECM, e solúveis em interacções dos factores, para além das características físicas, o microambiente é complexa. Os fenótipos de células dentro de um tecido são parcialmente devido ao seu conteúdo genómico e em parte devido às interacções com o microbiota combinatórias. Um grande desafio é unir combinações específicas de componentes microambientais com comportamentos distintos. ent &quot;&gt; Aqui, nós apresentamos o microambiente microarray plataforma (MEArray) para a célula baseada em triagem funcional de interacções com microambientes combinatórias 4. O método permite um controlo simultâneo da composição molecular e o módulo de elasticidade, e combina a utilização de microarray amplamente disponíveis tecnologias e micropatterning. telas MEArray requerem tão pouco quanto 10.000 células por matriz, o que facilita estudos funcionais de tipos de células raras, tais como as células progenitoras adultas. Uma limitação da tecnologia é que microambientes tecidos inteiros não pode ser completamente recapitulado em MEArrays. No entanto, a comparação das respostas no mesmo tipo de célula a numerosas microambientes relacionados, por exemplo, combinações de pares de proteínas de ECM que caracterizam um dado tecido, irá fornecer informações sobre a forma como os componentes do microambiente eliciar tecido-específicos fenótipos funcionais. MEArrays podem ser impressos usando uma grande variedade de recombinante grofactores wth, citoquinas, e proteínas purificadas de ECM, e suas combinações. A plataforma é limitado apenas pela disponibilidade de reagentes específicos. MEArrays são passíveis de tempo caduco análise, mas na maioria das vezes são usados ​​para análises de ponto final de funções celulares que são mensuráveis ​​com sondas fluorescentes. Por exemplo, a síntese do DNA, a apoptose, a aquisição de estados diferenciados, ou a produção de produtos de genes específicos são normalmente medidos. Resumidamente, o fluxo de base de um experimento MEArray é preparar as lâminas revestidas com substratos de impressão e para preparar a placa mestre de proteínas que estão a ser impressa. Em seguida, as matrizes são impressas com um robô microarray, as células são deixadas a ligar, crescer em cultura, e, em seguida, são quimicamente fixados ao atingir o ponto de extremidade experimental. Ensaios fluorescentes ou colorimétricas, fotografados com microscópios tradicionais ou scanners microarray, são utilizados para revelar relevantes fenótipos celulares e moleculares (Figura 1).

Um método de triagem combinatória funcional para obtenção de conhecimentos sobre os impactos da composição molecular de microambientes sobre as funções celulares é descrito. O método tira partido de microarray existentes baseados em tecnologias para gerar matrizes de microambientes definidos combinatórias que suportam a adesão de células e análise funcional.

Fabricação e uso de microarranjos microambiente (MEArrays)

As interações entre as células e o seu microambiente circundante têm consequências funcionais para o comportamento celular. Ao nível da célula individual, ...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir os efeitos de diferentes microambientes sobre as funções celulares de tipos celulares aderentes, expondo-os em paralelo a uma diversa coleção de microambientes Combinator. Isso é alcançado primeiramente pela fabricação de substratos de impressão para suportar a absorção de misturas de proteínas microambientais. Em seguida, são preparadas placas-mestre de proteínas microambientais, que são usadas para imprimir matrizes de ME utilizando um robô de impressão de microarranjos com pinça de ganso ou pinça capilar.Em seguida, são preparadas placas-mestre de proteínas microambientais. Então, células aderentes são cultivadas na matriz ME com a opção de limitar o número de células. Os resultados obtidos demonstram o impacto dos diferentes microambientes sobre funções celulares, como diferenciação ou proliferação, com base na análise de imunofluorescência.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando desejávamos quantificar os efeitos dos microambientes teciduais nas decisões de destino de células-tronco humanas de memória, mas percebemos que trabalhar in vivo é impossível. Agora que foi desenvolvido, possui diversas aplicações na biolo

fabrication-and-use-of-microenvironment-microarrays-mearrays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um procedimento simples de realizar experimentos de microarray personalizado microRNA é descrito. As etapas incluem isolar RNA, rotulagem RNA e DNA de referência, hibridação as amostras para microarrays, a digitalização da microarrays, quantificar e analisar os sinais de hibridização.

A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA

Uma descrição da formação de um polímero de microarray utilizando uma técnica de fotopolimerização on-chip. A caracterização de superfície de alto rendimento utilizando a microscopia de força atómica, as medições do ângulo de contacto da água, raios-X e espectroscopia de fotoelectrões de tempo de voo de espectrometria de massa de iões secundários e um ensaio de ligação celular é também descrito.

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

Este vídeo demonstra uma técnica que aplica a tecnologia de microarray de peptídeos para traçar o perfil da especificidade dos anticorpos que reconhecem modificações pós-traducionais (PTMs) em peptídeos de histonas. Uma lâmina de microarray contendo peptídeos de histonas conjugados com fluoróforo imobilizado com combinações conhecidas de PTM é tratada com anticorpos específicos de PTM alvo. Esse processo ajuda a identificar a especificidade do anticorpo para o alvo e sua potencial reatividade...

Uma tecnologia de microarray de peptídeos para perfis de especificidade de anticorpos

Um microarray amplificação combina assimétrica PCR amplificação e hibridização microarray em uma única câmara, que simplifica significativamente o fluxo de trabalho microarray para o usuário final. Simplificar o fluxo de trabalho microarray é um primeiro passo necessário para a criação de diagnósticos à base de microarray que podem ser rotineiramente usados ​​em ambientes com recursos mais baixos.

Demonstrando um multi-resistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Ampliação Microarray

Descritos são protocolos para quantificar interações mecânicas entre células aderentes e substratos microestruturados. Essas interações estão intimamente ligadas a comportamentos celulares essenciais, incluindo migração, proliferação, diferenciação e apoptose. Os protocolos apresentam um software de análise de imagem de código aberto chamado MechProfiler, que permite a determinação das forças envolvidas para cada micropost.

Fácil e precisa Mecano-profiling em micropost Arrays

diferenciação celular é regulada por uma série de fatores do microambiente, incluindo ambas as propriedades da composição da matriz e material de substrato. Descrevemos aqui uma técnica utilizando microarrays de células em conjunto com microscopia de força de tracção para avaliar tanto a diferenciação de células e as interacções célula-substrato biomecânicas como uma função do contexto microambiental.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

O desenvolvimento de comunidades microbianas depende de uma combinação de fatores, incluindo arquitetura ambiental, abundância de membros, traços e interações. Este protocolo descreve um ambiente sintético e microfabricado para o rastreamento simultâneo de milhares de comunidades contidas em poços de femtoliter, onde fatores-chave como tamanho de nicho e confinamento podem ser aproximados.

Montagem e Acompanhamento do Desenvolvimento da Comunidade Microbiana dentro de uma Plataforma Array Microwell

Este artigo descreve a metodologia detalhada para preparar uma matriz multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulação de alta produtividade de física e química sugestões imitando na vivo o microambiente celular e para Identifica o ambiente celular ideal para as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) com perfis de célula única.

Fabricação de uma matriz de microambiente celular Artificial multiplexado

O objetivo do método apresentado aqui é mostrar como Microarrays microambiente (MEMA) pode ser fabricado e usado para interrogar o impacto de milhares de microambientes combinatórios simples sobre o fenótipo de células cultivadas.

Usando Microarrays para interrogar o impacto microambiental em phenotypes celulares no cancro

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Aprenda a fabricar e usar microarranjos de microambiente para analisar funções celulares como diferenciação e proliferação. Este método combinatório permite estudar efeitos do microambiente em tipos celulares aderentes.

Fabricação e uso de microarranjos microambiente (MEArrays)

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