Name: Fabricação e Aplicação de Rosa Bengala-quitosana Films em Reparo de Tecidos Laser (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprenda a fabricar filmes adesivos de quitosana ativados por laser com rosa bengala para reparo de nervos periféricos em ratos. Este método minimiza danos teciduais comparado às suturas tradicionais.

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Este trabalho foi apoiado pela Research Grant UWS.

1. Quitosana Preparação adesiva <ol><li> O pó de quitosano é solúvel em solução de ácido acético, para a preparação de uma solução mãe de ácido acético (2% v / v), adicionar 10 ml de ácido acético glacial e 490 ml de água desionizada (DI-H 2 O). </li><li> Para a preparação de uma solução stock de Rose Bengal (RB) (0,01% w / v) em ácido acético, pesar 5 mg de RB em um frasco envolto com folha de alumínio para evitar a fotodegradação. Adicionar 0,5 ml de O 2 DI-H para dissolver o pó em seguida, adicionar 49,5 ml da solução de ácido acético stock (descrito na secção 1.1). </li><li> Para a preparação da solução de quitosano (1,7% w / v), pesar 0,85 g de quitosano em pó (MW médio, o grau de 85% de acetilação) e adicionar 50 ml de solução de ácido acético a RB. O controlo foi preparado por dissolução da quitosana em solução de ácido acético sem RB. </li><li> Adicionar um agitador magnético à mistura de quitosano e agitou-se à temperatura ambiente. Para assegurar a dissolução completa dos componentes, agitar a quitosanaem ácido acético + RB durante duas semanas e o quitosano em ácido acético, durante 5 dias (de controlo). Quando o quitosano é dissolvido, o pH da solução aumenta de 2,6 a ~ ~ 3.9. Note-se que RB é pouco solúvel em pH ácido e que exige um aumento do pH da solução, e um tempo prolongado de agitação para dissolver. </li><li> Centrifugar as soluções a 3270 xg, durante 1 hora e recolher o sobrenadante, utilizando, por exemplo, uma seringa estéril ml 10. Certifique-se de não perturbar a impureza da pelota. Durante esta etapa, a solução é feita a partir de impurezas macroscópicas e matéria insolúvel. </li><li> Injectar a (centrifugada) solução de quitosano sobre uma laje perpex plana usando uma seringa estéril. A espessura do filme seco depende da relação entre a quantidade de solução dispensada e a área da superfície sobre a qual a solução é espalhada. Assegure-se que a solução esteja livre de bolhas de ar e uniformemente distribuído sobre a laje. Para se obter filmes finos, com ~ 13 um de espessura, injectar ~ 1 ml de solução acima de 12 cm 2 de superfícieárea (~ dimensões 3x4 centímetros, Figura 1A). </li><li> Cobrir a placa de perspex com uma tela, feita de folha de alumínio, por exemplo, para evitar a foto-branqueamento da solução. Garantir que a ventilação de ar suficiente é garantida para secar a solução sob a tela. </li><li> Deixar a solução a secar à temperatura ambiente (25 ° C) e pressão (1 atm) até que o filme resultante é insolúvel em água e não incham macroscopicamente. Isto é tipicamente alcançado em 2 semanas. </li><li> Retire cuidadosamente os filmes usando uma espátula fina e plana: esses filmes podem ser facilmente arrancado a laje Perspex sem danificá-los. </li><li> Medir a espessura das películas utilizando um micrómetro. </li><li> Corte o adesivo em tiras retangulares com uma tesoura afiada limpa e coloque-os entre lâminas de vidro estéreis para preservar sua forma plana. Enrole as lâminas em folha de alumínio para a luz de blindagem e armazená-los à temperatura ambiente. Rotular os adesivos com ou sem RB como &quot;subiu adesivo&quot; ou &quot;quitosana ADHESive &quot;, respectivamente. </li><li> A rosa películas adesivas podem ser esterilizados utilizando etanol (90%) ou com radiação gama (0,1 kGy / h durante 24 horas) 4,5. </li></ol> 2. Atenuação Optical Adhesive <ol><li> Fixar o adesivo rosa dentro de um cadinho de quartzo. </li><li> Gravar o seu espectro atenuada na gama de 400-800 nm utilizando um espectrofotómetro de duplo feixe 4. </li><li> Assumindo que a validade da lei de Beer, calcular o comprimento de atenuação do adesivo como se segue: I = I 0 e Ax-onde 0 é a intensidade do feixe incidente, 1 / A atenuação é o comprimento, e x é a espessura da película. </li><li> Repita os passos 2,1-2,3 para o adesivo de quitosano para servir como um controlo. </li></ol> 3 aplicação in vitro:. Colagem de Tecidos Laser em Intestino <ol><li> Intestino de bezerro colheita imediatamente após a eutanásia dos animais e armazenar a -80 ° C. </li><li> Antes de usar, degelo e hidratar a tissue por imersão em O 2 DI-H durante 10 min. </li><li> Bissectar o tecido em secções (2 x 1 cm) usando uma lâmina 10 sob um microscópio de operação (x10). Manter a umidade seções usando DI-H 2 O. </li><li> Traga os tocos incisão juntos (ponta a ponta). Limpe o excesso de água da superfície usando pontas de algodão. </li><li> Coloque uma tira adesiva de rosa (10 x 6 mm) através da incisão na camada serosa com microfórceps garantindo contacto total com o intestino (Figura 2). </li><li> A aderência do tecido do adesivo rosa é activado por um diodo laser bombeado de estado sólido, o qual é acoplado a uma fibra óptica multimodo (diâmetro do núcleo de 200 um) 4. </li><li> Definir o nível de potência do laser de 180 mW e irradiar o adesivo para ~ min 6 com um tamanho de mancha de feixe de cerca de 5 mm, utilizando-se os parâmetros listados na Tabela 1. Ponto irradiam-o adesivo assegurando que cada local é irradiada para ~ 5 segundos antes de mover o feixe para o local adjacente. Tseu procedimento garante que o feixe laser varre a área de superfície total dos vários tempos adesivas. </li><li> Para avaliar a resistência de ligação do tecido, uma amostra de apertar a um tensiómetro de coluna única calibrado (Instron, MA, EUA), utilizando apertos mecânicos. Mover as pegas a 22 mm / min até que os dois cotos de tecidos separados 4. </li><li> Coloque um adesivo rosa sobre o tecido, tal como descrito no passo 3.5. Não irradiar a amostra e medir a resistência de ligação do tecido, tal como descrito no passo 3.8. Este exemplo serve como um controlo. </li></ol> 4 Na Aplicação Vivo:. Anastomose do nervo tibial <ol><li> Ratos Wistar com sedar o isoflurano / S mistura 2 (4% durante a indução, 2% depois) 5. Injectar subcutaneamente Buprenex (0,03 mg / kg) para fornecer intra-operatória actividade analgésica e possível aliviar a dor ou desconforto. </li><li> O seguinte procedimento cirúrgico deve ser realizado sob um microscópio de operação (x10). Faça uma pele oblíquaincisão de cerca de 3 cm de comprimento, na parte dorso-lateral da coxa direita e expor o nervo tibial com uma abordagem músculo-divisão através dos músculos glúteos 2. </li><li> Parcialmente dissecar e aparar a adventícia do nervo tibial usando retas micro-tesoura e absorver o excesso de água com uma gaze estéril ou pontas de algodão. </li><li> Cortar o nervo tibial com micro-tesoura. </li><li> Posicionar uma tira estéril quitosana (dimensões 5 x 4 mm) abaixo do nervo tibial utilizando micro-fórceps. </li><li> Aproximar os cotos end-to-end com micro-pinças sobre a fita adesiva rosa. </li><li> A tira completamente adere ao nervo formando um colar, o que pode auxiliar na rotação do nervo durante a irradiação com laser da tira. </li><li> Activar a rosa adesivo com o laser, tal como descrito nas etapas 3.6) e 3.7). </li><li> Apare o adesivo redundante subiu de o colar do nervo operado. </li><li> Feche os músculos e pele, com cinco suturas 3-0 5. </li&gt; <li> Procedimentos padrão de recuperação pós-operatória deve ser seguido, incluindo inspeção diária para deiscência ou formação de pus e administração de analgésicos, se necessário. </li></ol> 5. Resultados representativos As películas que se obtêm são brilhantes de cor rosa, fina e tem uma superfície lisa (figura 1). Eles também são flexíveis e podem ser enroladas em tubos de pequeno diâmetro, sem lágrimas causam ou qualquer outro dano aparente (Figura 1B). O adesivo rosa tem dois picos de absorção a 530 e 562 nm, o laser verde é assim fortemente absorvida pelo adesivo e o comprimento de atenuação correspondente a 532 nm é de ~ 12 ^ m (Figura 3). Em contraste, a quitosana sem películas fracamente RB atenua a laser (1 / A ~ 162 mm), provavelmente devido à dispersão. Depreende-se que a trama espectros sem agregação significativa de RB ocorre nos filmes. A rosa ligações adesivas firmementepara o intestino, após irradiação do laser (Figura 2) a realização de uma carga máxima típica de falha de 0,9 ± 0,4 N (n = 30). A força de adesão foi estimada como sendo a carga máxima dividida pela área da superfície de colagem, isto é, de 15 ± 6 kPa (n = 30). O adesivo não irradiado rosa ligado significativamente menor para o tecido (2 ± 2 kPa, n = 30, teste t não emparelhado p &lt;10 6). A anastomose in-vivo do nervo tibial foi atingido com sucesso após a aplicação e colagem do adesivo rosa em conjunto com o laser verde. Uma semana após a cirurgia, o nervo foi operado em continuidade e a força de reparação foi de 17 ± 9 kPa (n = 10). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4158/4158fig1.jpg" /> Figura 1. A) A solução de quitosano-RB é fundido em uma superfície plana Perspex espessura (laje laje ~ 5 mm). Papel gráfico é colocado por baixo da laje para facilitar o passo de dry-cast. O f insolúvel em águailm é obtido de duas semanas depois de fundição. B) O adesivo rosa é flexível e pode ser enrolado num cilindro pequeno. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4158/4158fig2.jpg" /> Figura 2. O adesivo está ligado a rosa de intestino de bezerro após irradiação do laser. Irradiação uniforme é aplicada sobre o tecido durante adesivo RB-ligação; manchas entretanto seleccionados são mostrados nesta figura para ilustrar o efeito de foto-branqueamento do laser sobre o adesivo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4158/4158fig3.jpg" /> Figura 3. O espectro de absorção (em unidades arbitrárias) do adesivo rosa mostra dois picos a 530 e 562 nm. O laser verde (λ = 532 nm) é, assim, fortemente absorvida pelo adesivo durante a exposição à radiação laser. O adesivo de quitosano sem RB absorve mal o feixe de laser. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td><strong&gt; Área (mm 2) </td><td> Potência (W) </td><td> Tempo (s) </td><td> Fluência (J / cm 2) </td><td> I (W / cm 2) </td><td> Max Load / Área (kPa) </td></tr><tr><td> Adesivo + Laser </td><td> 30 </td><td> 60 ± 10 </td><td> 0,18 ± 0,03 </td><td> 365 ± 5 </td><td> ~ 110 </td><td> ~ 0,9 </td><td> 15 ± 1 </td></tr><tr><td> Adesivo </td><td> 30 </td><td> 60 ± 10 </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 2 ± 2 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Legend. n, número da amostra; Área, área de superfície do adesivo rosa (média ± erro máximo); Power, potência do laser (média ± erro máximo); Tempo, tempo de irradiação (média ± erro máximo); Fluence, fluência laser média, eu, TIR estimadaadiance; máx / Area, carga máxima de ruptura do tecido reparado dividida pela área da superfície do adesivo, (média ± EP).

<ol><li>O'Neill, A. C., Winograd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anastomosis+using+a+photochemical+tissue+bonding+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">Microvascular anastomosis using a photochemical tissue bonding technique.</a> Lasers Surg. Med. 39, 716-722 (2007).</li>
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<li>García, P., Jorge, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+the+mechanical+behavior+of+a+cyanoacrylate+and+a+bioadhesive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Comparative study of the mechanical behavior of a cyanoacrylate and a bioadhesive.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 15, 109-115 (2004).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A rosa fabricação adesivo é baseado num processo de seca-molde simples, embora a dissolução do RB em pH ácido requer agitação prolongada de solução de quitosano. É importante deixar a solução secar-se até se tornar uma película insolúvel em água. Isto acontece quando o teor em água de peso é de ~ 10%, em que o filme seco 6. Filmes insolúveis são geralmente obtidas duas semanas após a seca-casting em condições padrão de temperatura e pressão (~ 25 ° C e ~ 1 atm). O mecanismo de ligação do tecido não é claro, n...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Rosa Bengala </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 632-69-9 </td><td></td></tr><tr><td> A quitosana (média MW) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 10318AJ </td><td></td></tr><tr><td> Ácido acético glacial </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 08050051 </td><td> 2% v / v em água Dl </td></tr><tr><td> Agitador magnético </td><td> Heidolph </td><td> MR Hei-Mix S </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-12R </td><td></td></tr><tr><td> Espectrofotômetro </td><td> Varian </td><td> Cary 4000 UV-Visível </td><td></td></tr><tr><td> Laser </td><td> CNI Laser </td><td> MGL-532 </td><td></td></tr><tr><td> Micrômetro </td><td> Mitutoyo </td><td> Série 227 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio cirúrgico </td><td> Zeiss </td><td> OPMI </td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação e aplicação de rosa bengala-quitosana films em reparo de tecidos laser

Fabrication and Application of Rose Bengal-chitosan Films in Laser Tissue Repair

Colagem de tecidos fotoquímica (PTB) é uma técnica de sutura para a reparação de tecidos, o que é conseguido através da aplicação de uma solução de rose bengal (RB) entre duas extremidades de tecido 1,2. Estes são depois irradiadas por um laser que é selectivamente absorvido pelo RB. As reações fotoquímicas resultantes supostamente crosslink as fibras de colágeno no tecido com 3 mínima produção de calor. Neste relatório, RB, foi incorporada em filmes finos de quitosano para o fabrico de um adesivo de tecido novo que é activado por laser. Películas adesivas, com base em quitosano e contendo ~ 0,1% em peso de LD, são fabricados e ligados ao intestino de vitelo e os nervos tibiais de ratos por um laser de estado sólido (λ = 532 nm, de fluência ~ 110 J / cm 2, tamanho do ponto ~ 0,5 cm) . Um tensiómetro de coluna única, em interface com um computador pessoal, é utilizado para testar a resistência de ligação. Os RB-quitosano ligações adesivas com firmeza para o intestino com uma força de 15 ± 6 kPa, (n = 30). A força de adesão diminui para 2 &amp;plusmn; 2 kPa (n = 30) em que o laser não é aplicada ao adesivo. A anastomose de nervos tibial pode ser igualmente concluída sem a utilização de suturas. A novel quitosana adesivo ter sido fabricado que os títulos fotoquimicamente ao tecido e não requer sutura.

Suturas são normalmente necessários para reparar o tecido durante procedimentos cirúrgicos. No entanto, a sua aplicação pode ser problemática uma vez que são invasivos e pode danificar o tecido. Os métodos de fabricação e aplicação de um adesivo de tecido romance são aqui relatados. Esta película adesiva é activada por laser e não requer o uso de suturas.

Fabricação e Aplicação de Rosa Bengala-quitosana Films em Reparo de Tecidos Laser

A colagem tecidual fotoquímica (PTB) é uma técnica sem sutura para reparação tecidual, a qual é realizada aplicando-se uma solução de bengala rosa (RB) entre dois...

O objetivo geral deste procedimento é fabricar um adesivo de quitosana ativado por laser e demonstrar como aplicá-lo no reparo de nervos periféricos. Isso é realizado primeiramente solubilizando quitosana e pó de verde de brilhante em solução de ácido acético. O segundo passo do procedimento é realizar a secagem por moldagem da solução para obter um filme fino.O terceiro passo é expor o nervo do rato e dissecá-lo. O passo final é posicionar o filme ao redor do nervo dissecado e irradiá-lo com um laser verde para ligar o filme ao tecido. Por fim, a força com que o filme rose se liga ao tecido é medida usando um tensiômetro calibrado.O adesivo a laser é biocompatível e tem a vantagem de se ligar diretamente ao tecido. Isso o torna muito útil para reparar tecidos profundos e de difícil acesso, onde suturas seriam complicadas. Também teria a vantagem de reparar tecidos onde o fechamento estanque é importante, como a dura-máter ou o intestino.É importante demonstrar visualmente a técnica alto e adesiva porque várias etapas estão envolvidas na preparação do adesivo e também porque o procedimento cirúrgico exige cuidados especiais quando o adesivo é aplicado no tecido. A maior parte da de

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