Lensfree On-chip microscopia tomográfica Empregando Multi-ângulo de iluminação e Pixel Super-resolução
16 de agosto de 2012
Lensfree óptico tomografia é uma técnica de microscopia tridimensional que oferece uma resolução espacial de menos de 1 uM × menos de 1 uM × menos de 3 M em X, Y e dimensões Z, respectivamente, ao longo de um grande volume de imagiologia de 15-100 milímetros 3, Que pode ser particularmente útil para a integração com lab-on-a-chip plataformas.
O objetivo geral deste procedimento é obter imagens tridimensionais sem lentes no chip de espécimes biológicos em um grande volume de imagens. Isso é feito colocando primeiro a amostra diretamente no chip do sensor e fornecendo iluminação parcialmente coerente. O segundo passo é deslocar lateralmente a fonte de luz de diferentes posições para gravar.
Os subpixels deslocaram as imagens holográficas da amostra. Os próximos subpixels mudaram. As imagens holográficas são registradas em múltiplos de iluminação para imagens tomográficas.
A etapa final é o processamento de dados, onde o conjunto de dados adquirido é reconstruído digitalmente para obter imagens tomográficas tridimensionais da amostra. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a microscopia de luz convencional, é que ela fornece imagens de alto rendimento em uma arquitetura compacta. Isso torna nossa plataforma particularmente útil para integração com plataformas de chips do Líbano.
Neste relatório, é descrita a configuração básica de imagem para uma implementação de bancada para tomografia de amostras estáticas. Um monocromador com uma lâmpada de xenônio foi ajustado para fornecer uma saída com aproximadamente um a 10 nanômetros de largura espectral em torno de um comprimento de onda central de 450 a 650 nanômetros. Essa saída parcialmente coerente é então acoplada a uma fibra óptica multimodo para fornecer luz parcialmente coerente ao sistema.
A fibra óptica é montada em um estágio de rotação motorizado para alterar o ângulo de iluminação. O estágio motorizado com a fonte de luz conectada é montado em um estágio XY linear bidimensional, que é usado para obter deslocamentos simples da fonte de luz em um determinado ângulo para detecção. É usado um conjunto de sensores ACMO com cinco megapixels com um tamanho de pixel de 2,2 mícrons.
O detector é usado para registrar o amplo campo de visão imagens holográficas de amostras. É fundamental que o conjunto de sensores esteja posicionado no mesmo plano axial que o eixo de rotação da fonte de luz para garantir que verifiquemos se o sensor recebe luz suficiente em grandes ângulos de iluminação. Embora a tomografia óptica sem lentes possa obter imagens de uma variedade de objetos, como células e microorganismos, os princípios básicos são demonstrados aqui realizando microscopia tridimensional de uma amostra de sea elgan usando um bisturi ou uma espátula.
Pegue um pequeno pedaço de AGA da placa de Petri contendo a cultura dos órgãos selantes. Um pedaço cúbico de vários milímetros ao longo de cada dimensão conterá centenas de nematóides. Coloque o pequeno pedaço de ágar em um frasco de polipropileno contendo um mililitro de água deionizada.
Suavemente vórtice por 30 segundos a um minuto. Após 10 a 15 minutos, o verme deve rastejar para fora do ágar para a água deionizada. Observe que os vermes são pequenos demais para serem vistos aqui, a fim de imobilizar temporariamente os vermes e um mililitro de cinco a 10 milimolares Lima.
Então solucione e aguarde 10 minutos. Pipete de cinco a 10 microlitros de amostra do fundo do frasco e coloque entre duas lamínulas. Esta amostra contendo um grande número de vermes temporariamente imobilizados pode ser colocada no detector para iniciar a aquisição de dados.
Para fins de demonstração, as etapas de aquisição de imagem para uma tomografia óptica sem lente típica ou experimento LOT são resumidas nesta seção, no entanto, todo o processo foi automatizado usando a interface de visualização de laboratório desenvolvida sob medida. Para iniciar as etapas manuais, ajuste o ângulo inicial do estágio de rotação para 50 graus negativos, onde zero graus corresponde à posição vertical da fonte de luz. Ajuste a posição inicial do estágio XY para zero zero, que é a posição inicial.
Ajuste o tempo de exposição do detector para melhor utilizar sua faixa dinâmica, de modo que a imagem fique o mais brilhante possível sem pixels saturados sem alterar o ângulo do estágio de rotação. Capture nove imagens para cada imagem. Mova o estágio XY para uma nova posição em uma grade quadrada de três por três, de modo que cada imagem se desloque em aproximadamente um quarto de pixel em comparação com a anterior.
Adquirir mais imagens em cada ângulo pode melhorar a resolução, dependendo do tipo de objeto e da relação sinal-ruído. Depois de coletar nove imagens no ângulo inicial, ajuste a posição do estágio XY de volta para a posição zero zero. Em seguida, aumente o ângulo do estágio de rotação em incrementos de dois graus até atingir 50 graus positivos.
Após cada incremento em cada novo ângulo, repita as etapas descritas. Os incrementos angulares podem ser mais finos ou mais grossos, dependendo da otimização do tempo de aquisição versus resolução da imagem. Após a aquisição dos dados, é adquirido um conjunto de 459 imagens, que contêm nove imagens deslocadas em subpixels para cada um dos 51 ângulos diferentes de iluminação.
Cada conjunto de nove imagens é processado digitalmente usando algoritmos de super-resolução de pixels para obter uma projeção de alta resolução. O superresultado do holograma por pixel de ângulo é então reconstruído digitalmente para obter 51 imagens de projeção. O processamento de dados é mostrado aqui usando um laptop.
A reconstrução levaria menos de um segundo para o campo de visão completo usando unidades de processamento gráfico. Este conjunto de 51 imagens de projeção é então projetado de volta usando o plugin Tom OJA. Para a imagem J, as imagens de projeção são carregadas primeiro na imagem J, após o que o plug-in Tom OJ é invocado.
Uma tabela de pesquisa que fornece o ângulo de visualização para cada imagem de projeção é carregada para o OJ. Usando o método de retroprojeção ponderada, imagens tomográficas tridimensionais do espécime podem ser obtidas. O grande campo de visão da tomografia óptica sem lentes é demonstrado aqui, pois a amostra é colocada diretamente no topo do conjunto de detectores. Imagens holográficas dos objetos podem ser gravadas em um campo de visão de 24 milímetros quadrados, que pode ser aumentado ainda mais usando matrizes de detectores emergentes com áreas ativas maiores.
Embora o tamanho do pixel da matriz de detectores limite a resolução das imagens holográficas gravadas, as técnicas de super-resolução de pixel atenuam esse problema mostrado aqui são hologramas super-resolvidos de pixel, juntamente com as imagens de projeção reconstruídas que oferecem resolução espacial submicrométrica para três ângulos diferentes de iluminação. As imagens de projeção podem ser combinadas usando técnicas de reconstrução de imagem tomográfica para calcular os fundamentos TOM da amostra. Três imagens de fatia no plano XY através da parte anterior do verme são mostradas aqui, onde o tubo faríngeo é visível apenas na fatia através de Z igual a oito mícrons, como esperado desta estrutura aproximadamente cilíndrica com um diâmetro externo aproximado de cinco mícrons.
Além disso, a imagem transversal no plano XZ mostra claramente os limites do verme e do tubo faríngeo interno, demonstrando imagens 3D bem-sucedidas da faringe. Com seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para que os pesquisadores realizem microscopia tridimensional em dezenas de milímetros de volume de imagem. Portanto, a tomografia óptica sem lentes pode ser uma ferramenta útil para aplicações de imagem de alto rendimento em plataformas de chips do Líbano.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo discute a tomografia óptica sem lentes, uma técnica de microscopia tridimensional que permite a obtenção de imagens de alta resolução de espécimes biológicos. O método possibilita a aquisição de imagens em um grande volume, tornando-o adequado para integração com plataformas lab-on-a-chip.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imagem Biológica
- Técnicas de Microscopia
Contexto
- A tomografia óptica sem lentes fornece uma resolução espacial de <1 μm × <1 μm × <3 μm.
- A técnica é capaz de imagens em volumes entre 15-100 mm³.
- É particularmente benéfica para aplicações em tecnologias do tipo laboratório-em-um-chip.
- Este método utiliza iluminação parcialmente coerente para obtenção de imagens.
Objetivo do Estudo
- Obter imagens tridimensionais sem lentes de espécimes biológicos.
- Explorar a integração dessa técnica com plataformas lab-on-a-chip.
- Aprimorar as capacidades de imagem em grandes volumes.
Métodos Utilizados
- Posicionamento da amostra diretamente sobre o chip sensor.
- Utilização de iluminação parcialmente coerente.
- Deslocamento lateral da fonte de luz para registrar imagens holográficas com deslocamento subpixel.
- Registro de múltiplas imagens holográficas para imagem tomográfica.
Resultados Principais
- Imagem bem-sucedida de espécimes biológicos em três dimensões.
- Demonstração de capacidades de alta resolução espacial.
- Integração eficaz com plataformas tipo laboratório-em-um-chip.
- Validação do método por meio de diversos testes de imagem.
Conclusões
- A tomografia óptica sem lentes é uma técnica promissora para imagem biológica.
- O método oferece vantagens significativas em resolução espacial e volume de imagem.
- Aplicações futuras podem se expandir para várias áreas de pesquisa biológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia tomográfica em chip sem lentes permite imagem 3D de alto rendimento e livre de marcadores de espécimes biológicos em grandes volumes, sem óptica volumosa, favorecendo a integração com plataformas microfluídicas e laboratório-em-um-chip. Essa abordagem reduz o tamanho e o custo do instrumento, mantendo resolução submicrométrica, e atende gargalos na fase de descoberta relacionados ao rendimento de amostras e compatibilidade de ensaios. A tecnologia aumenta a confiança preditiva na validação inicial de alvos ao fornecer dados estruturais quantitativos com resolução de profundidade para triagem fenotípica e redução de riscos mecanicistas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização tridimensional de fenótipos celulares e organelas subcelulares.
- Valor Operacional: Permite a imagem sem marcação de espécimes vivos, reduzindo artefatos de preparação e preservando a biologia nativa para estudos de interação com alvos.
- Valor Preditivo: Gera dados volumétricos quantitativos para esclarecer o mecanismo de ação e reduzir os riscos associados às vias-alvo na fase inicial de descoberta.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Oferece imagens tridimensionais com resolução submicrométrica em grandes campos de visão, permitindo triagem fenotípica de alto conteúdo de microrganismos e populações celulares.
- Valor Operacional: Elimina a necessidade de lentes e óptica complexa, padronizando fluxos de trabalho de imagem para desenvolvimento de ensaios reprodutíveis e escaláveis.
- Prontidão para Ensaios: Facilita a preparação de sistemas biológicos validados para avaliação de compostos em etapas subsequentes por meio de aquisição automatizada de dados de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta e a validação pré-clínica ao fornecer imagens tridimensionais consistentes em sistemas modelo, como C. elegans e embriões de peixe-zebra.
- Redução de Riscos Mecanicista: Permite o acompanhamento longitudinal de alterações estruturais em sistemas relevantes para doenças, apoiando o alinhamento de biomarcadores e decisões de avanço com ajuste de risco.
- Fidelidade do Modelo Pré-clínico: Preserva a arquitetura e a dinâmica tecidual nativas, melhorando a transposição dos achados de contextos in vitro para in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a biologia inicial até a identificação de compostos líderes, apoiando a verificação de hipóteses, padronização de ensaios e análises quantitativas, sem exigir processamento extensivo de amostras ou marcação.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses e esclarecer vias por meio da visualização tridimensional de fenótipos estruturais em sistemas biológicos não perturbados.
- Triagem: Fornece imagens prontas para ensaios e reproduzíveis, com resultados quantitativos para comparar condições de controle e tratamento em grandes populações de amostras.
- Análises: Gera reconstruções tomográficas resolvidas por profundidade e imagens de projeção que facilitam a comparação estatística de características morfológicas.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade pré-clínica ao imagens organismos modelo relevantes para doenças com resolução e cobertura de volume consistentes.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma de imagem reutilizável, compatível com diversos tipos de amostras e formatos microfluídicos, reduzindo investimentos tecnológicos redundantes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva por meio de imagem 3D de alta resolução sem marcação que reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e escalabilidade por meio de um design sem lentes, aquisição automatizada e compatibilidade com matrizes de sensores de grande formato.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao permitir a detecção precoce de anomalias fenotípicas, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados e ineficiências de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados quantitativos de imagem multiparamétrica para comparação objetiva de candidatos terapêuticos.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em imagem computacional, holografia e algoritmos de reconstrução tomográfica.
- Depende de matrizes de sensores CMOS/CMOS de alta resolução e estágios de iluminação motorizados para a captura de dados em múltiplos ângulos.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de iluminação, configurações de exposição e procedimentos de deslocamento subpixel para garantir reprodutibilidade.
- A adaptação entre sistemas modelo pode exigir otimização das técnicas de preparação e imobilização de amostras para manter a viabilidade durante a aquisição de imagens.
- As limitações práticas incluem sensibilidade ao índice de refração da amostra e propriedades de espalhamento, o que pode afetar a relação sinal-ruído em espécimes densos ou altamente absorventes.
