Um In vitro Modelo de Co-infecção para Estudar Plasmodium falciparum-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Nós desenvolvemos uma

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um modelo in vitro para estudar os efeitos de eritrócitos infectados por plasmodium fpar na replicação do HIV em macrófagos primários derivados de monócitos humanos. Isso é feito primeiro isolando plasmódio, falsos glóbulos vermelhos infectados com pare usando o sistema veac e, em seguida, expondo macrófagos derivados de monócitos humanos às células infectadas. Em seguida, os macrófagos derivados de monócitos expostos aos glóbulos vermelhos são infectados com HIV totalmente replicativo ou codificação de luciferase de replicação única, HIV.

Finalmente, os sobrenadantes da cultura são colhidos nos dias 3, 6, 9 e 12 pós-infecção para o vírus totalmente replicativo para o vírus codificador da luciferase. As células infectadas são mentiras após 72 horas de infecção. Em última análise, a replicação viral pode ser monitorada quantificando a quantidade de HIV uma proteína do capsídeo P 24 em sobrenadantes por Eliza e a transcrição viral pode ser monitorada pela quantificação da luciferase dos lisados celulares.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da malária e das coinfecções pelo HIV. Por exemplo, como a infecção pelo parasita plasmodium influencia a replicação do HIV? Embora este método tenha sido desenvolvido para estudar as interações entre plasmódio e HIV em macrófagos, ele também pode ser aplicado a outros tipos de células.

Por exemplo, células dendríticas, monócitos ou células T CD quatro demonstrando o procedimento serão Guadalupe Andreani. Um pós-doutorando no laboratório Comece colhendo glóbulos vermelhos da placa de cultura, lave as células recuperadas em 10 mililitros de meio de macrófago derivado de monócitos e, em seguida, ressuspenda o pellet em 12 mililitros de meio de cultura de macrófagos derivados de monócitos. Agora, lentamente, adicione a suspensão celular a uma coluna Milton ECS e deixe a suspensão fluir depois de lavar a coluna uma vez com meio fresco, remova-a do ímã e lave 12 mililitros de cultura de macrófagos derivados de monócitos.

Meio através da coluna, iludindo os glóbulos vermelhos infectados em um tubo estéril para expor macrófagos derivados de monócitos a glóbulos vermelhos infectados ou não infectados. Adicione o volume apropriado de suspensão de glóbulos vermelhos a cada poço de uma placa de 24 poços previamente preparada contendo macrófagos derivados de monócitos. Incube as coculturas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono após quatro horas, remova o meio que contém os glóbulos vermelhos e, em seguida, adicione suavemente 600 microlitros de PBS livre de endotoxinas a cada um, aspirando três vezes o PBS imediatamente após cada lavagem.

Agora, a 200 microlitros de gelo, água fria e estéril para cada poço para os glóbulos vermelhos aspirando a água após 20 segundos. Em seguida, a 600 microlitros de macrófagos derivados de monócitos em cada poço e incubar as culturas por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Avaliar o efeito do plasmodium falso parem na replicação do HIV um em macrófagos derivados de monócitos a 300 microlitros de meio macrófago derivado de monócitos contendo P 24 de NL quatro três vírus BO IV um nos poços apropriados semelhante ao protocolo descrito nesta figura.

Após incubar as coculturas por duas horas, lavar as células três vezes com 600 microlitros de PBS livre de endotoxinas. Em seguida, a 600 microlitros, um macrófago derivado de monócitos frescos é médio para cada poço e continua a incubar as coculturas nos dias 3, 6, 9 e 12 Após a infecção viral inicial, colha 200 microlitros de cada snat substituindo a suspensão celular recuperada por 200 microlitros de macrófagos derivados de monócitos frescos. Média. Depois disso, armazene os sobrenadantes colhidos a menos 20 graus Celsius para análise posterior por Eliza.

Com o objetivo de determinar o impacto dos parasitas no HIV, a expressão gênica de um gene em macrófagos derivados de monócitos a 300 microlitros de meio macrófago derivado de monócitos contendo P 24 do vírus revestido com luciferase ENC de interesse para os poços correspondentes, semelhante aos protocolos aqui ilustrados. Depois de incubar e lavar as culturas de código, conforme mostrado para o vírus revestido com não luciferase ENC, remova o meio 72 horas após a infecção e adicione 200 microlitros do ensaio de luciferase. O tampão de lise de acerto agora coloca as células à temperatura ambiente com agitação suave e, em seguida, armazena as coculturas a menos 20 graus Celsius.

Após descongelar a placa, transfira 40 microlitros de lisado de cada poço para o poço correspondente em uma placa luminométrica de 96 poços. Em seguida, adicione 100 microlitros do substrato de luciferase do kit de ensaio de luciferase a cada um. Bem, finalmente, meça a atividade da luciferase do vaga-lume em um luminômetro.

De acordo com as instruções do fabricante neste experimento, macrófagos derivados de monócitos foram expostos a glóbulos vermelhos infectados ou não infectados e, em seguida, infectados com NL quatro três blen. Como acabamos de demonstrar, a produção da proteína viral P 24 foi então monitorada por ELIZA para HIV um P 24 em sobrenadantes livres de células em diferentes momentos após a infecção viral inicial. Observe a diminuição significativa na liberação de partículas virais no dia 12, medida pela proteína do capsídeo P 24 do HIV no supernat de macrófagos derivados de monócitos pré-tratados com parasitas.

Neste experimento, macrófagos derivados de monócitos foram expostos a glóbulos vermelhos infectados e não infectados e, em seguida, infectados com o vírus codificado pela luciferase, como a expressão da luciferase demonstrada foi avaliada em lisado celular 72 horas após o vírus inicial na infecção. A infecção de macrófagos derivados de monócitos com esses vírus abrigando VSs exógenos. As glicoproteínas VG ou HIV um levaram a uma produção significativamente menor de luciferase em células expostas a p falso spar. Vale ressaltar que os vírus pseudotipados VSVG produziram atividade de luciferase muito maior do que seus equivalentes JRFL devido à maior eficiência de infecção das partículas pseudotipadas VSPG.

Esta técnica permitirá que pesquisadores no campo da malária, co-infecções por HIV explorem as interações entre esses dois patógenos em um modelo in vitro que é adaptável ao estudo de vários tipos de células imunes.