Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

O objetivo geral do experimento a seguir é medir as taxas de reparo de DNA e extratos nucleares celulares em tempo real usando beacons moleculares que fluorescem depois de reparados. As balizas moleculares básicas de reparo por excisão são compostas por desoxi oligonucleotídeos em uma estrutura de alça de haste contendo uma única lesão de base com seis porções de oxifluoresceína de curva conjugadas às cinco extremidades principais e dil moti conjugadas às três extremidades principais quando dobradas. O moty de seis famílias é extinto por dab sil de maneira não fluorescente por meio da transferência de energia de ressonância do silvicultor.

Para avaliar a atividade de reparo do DNA, os beacons são incubados com extratos nucleares celulares, que contêm enzimas de reparo. O glicosilato de DNA é reconhecido e remove a lesão de DNA no farol. Os sítios ABA resultantes são substratos para a endonuclease AP um ou macaco um Após o reconhecimento, o APE um cliva a estrutura do DNA no local ABA, permitindo que o DNA contendo as seis famílias se dissocie livremente do grampo de cabelo.

O descolamento do extintor resulta em um aumento da fluorescência proporcional ao nível de reparo do DNA e pode ser avaliado em tempo real usando uma máquina de PCR quantitativa em tempo real. A capacidade de reparar danos ao DNA é crucial para todas as células e organismos. Entre a multiplicidade de vias de reparo do DNA celular, alvos de reparo por excisão de base, bases danificadas que podem resultar de insultos oxidativos ou químicos elucidando o papel de elementos celulares individuais que podem influenciar o reparo por excisão de base é um dos principais objetivos em nossos estudos de laboratório.

Como tal, medir a atividade de reparo do DNA com precisão e sensibilidade tornou-se um interesse em nosso laboratório. Este ensaio pode fornecer esses dados. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como marcação e análise de 32 PN por eletroforese em gel, é que nossa técnica não usa substratos marcados radioativos, pode medir as taxas de reparo dary em tempo real e tem uma faixa dinâmica muito grande.

Além disso, essa abordagem pode utilizar vários diferentes fluoro fours e/ou lesões de base para determinar a especificidade do substrato. Mostramos que este ensaio é altamente quantitativo e muito sensível em diferentes ambientes. Este ensaio de baliza molecular de reparo por excisão de base é passível de análise cinética.

A alta sensibilidade e especificidade do ensaio permitem a quantificação precisa do reparo por excisão de base e, portanto, é útil para triagens ou validação de inibidores de reparo. Além disso, é adaptável para medir a atividade de reparo dary e lisados de tecidos e células tumorais para medições de biomarcadores funcionais. Ao projetar beacons moleculares que serão usados para este ensaio, considere os seguintes oligonucleotídeos de DNA com 43 bases de comprimento, conforme mostrado aqui.

Trabalhe bem. A sequência de DNA não é única, mas deve permitir a formação de uma estrutura em grampo. Quando um ajoelhado como mostrado aqui, a especificidade é alcançada pela inserção de lesões de base específicas, como uracila ou tetra hidrofurina.

Na posição X seis bases das cinco extremidades principais, o conteúdo do GC deve ser de pelo menos 32% e uma base GB não deve ser colocada nas cinco extremidades principais. Seis carboxifluoresceína ou seis fam devem ser conjugadas com as cinco extremidades principais e as três extremidades primárias devem ser modificadas com dab sil. Este será o substrato para as proteínas de reparo do DNA para garantir a ligação e a atividade das liberações de glicosil.

A posição da lesão foi escolhida para fornecer espaço suficiente da estrutura do grampo e do final do DNA. O comprimento da haste ou duplex em grampo de cabelo deve ser de no mínimo 15 pares de bases. O comprimento de laço recomendado é de 13 bases.

O farol molecular de controle deve ser idêntico ao farol molecular experimental, exceto que não contém uma lesão de DNA. Portanto, não deve ser reconhecido por enzimas de reparo de DNA. Uma vez que as balizas moleculares estejam em mãos, a avaliação de qualidade deve ser realizada para garantir que as balizas não fluorescem até serem aquecidas.

E para determinar a temperatura ideal de fusão, todas as etapas durante o procedimento de extração devem ser realizadas no gelo ou a quatro graus Celsius. Para garantir a estabilidade da proteína, prepare-se para o experimento pré-resfriamento. Dois copos de um litro por amostra de câmaras de diálise tampão de diálise, microcentrífuga, tubos, seringas e agulhas.

Rotule os tubos cônicos de 15 mililitros e coloque-os no gelo. Aspire o meio de crescimento das células e lave-as duas vezes com 7,5 mililitros de PBS frio Após a segunda lavagem. Adicione cinco mililitros de PBS frio a cada prato e use um elevador de células para raspar as células do prato.

Transfira as células para um tubo cônico resfriado de 15 mililitros e, em seguida, centrifugue a 500 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e estime o volume da célula compactada comparando-o com volumes conhecidos de líquido em tubos semelhantes. Centrifugue os tubos por mais um minuto e, em seguida, remova o PBS restante com uma pipeta resus.

Suspenda o pellet celular em 150 microlitros de reagente de extração de destruidor de armas nucleares, um para cada 50 microlitros de volume de célula compactado. Em seguida, transfira as células ressuspensas para um tubo pré-resfriado de 1,5 mililitro e vore por 15 segundos em alta velocidade. Após o vórtice, incubar o tubo no gelo durante cinco minutos, depois vórtice durante mais 15 segundos e centrifugar a 13 000 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, remova e descarte o sobrenadante, que contém a fração citoplasmática. Resus suspende o pellet em uma mistura de um microlitro de resus suspenso 100 x coquetel inibidor de protease, um microlitro de 100 milimolares DTT e 75 microlitros de extração de destruidor de armas nucleares. Reagente dois por 50 microlitros de volume de célula compactada.

Células do vórtice por 15 segundos em alta velocidade. Incubar no gelo por cinco minutos e novamente vórtice por 15 segundos em centrifugação de alta velocidade a 13.000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, usa seringa para transferir o sobrenadante, que contém as proteínas nucleares, para um de diálise de lâmina com um corte de 7.000 pesos moleculares.

Em seguida, adicione 500 microlitros de um molar DTT a 500 mililitros de tampão de diálise pré-resfriado e dialise o lisado por 90 minutos a quatro graus Celsius com agitação suave. Após 90 minutos, transfira o de diálise para um segundo béquer contendo 0,5 litros de tampão de diálise pré-resfriado com TDT e dialise. O lisado por 90 minutos a quatro graus Celsius com agitação suave após a diálise, o extrato pode ter cristalizado devido às altas concentrações de proteína.

Em seguida, insira uma nova seringa em uma porta diferente daquela usada para injetar o e colete a solução de proteína nuclear dialisada do de diálise. Tente incluir cristais de aparência turva ao remover a solução de proteína nuclear dialisada. Alicote a amostra para tubos de microcentrífuga de 20 microlitros cada, congele rapidamente em gelo seco e armazene-a a menos 80 graus Celsius até que seja necessário.

Determine a concentração de proteína e execute o controle de qualidade conforme descrito no documento anexo. Para realizar o ensaio de balizamento molecular, descongele e dilua os lisados celulares a dois microgramas por microlitro de proteína com tampão de reação de reparo de cisão básico contendo um milimolar de DTT, dilua os balizas moleculares a 200 micromolares com tampão de reação de reparo de excisão básico. Como a máquina de PCR quantitativa em tempo real normalmente não é usada como fluorímetro, altere o método de execução na máquina de PCR quantitativo em tempo real para coletar dados a cada 20 segundos a 37 graus Celsius por pelo menos 180 ciclos.

Em seguida, a cada 20 segundos por 15 ciclos na fluorescência máxima do farol molecular para obter dados para normalização. Defina o volume de reação para 25 microlitros. Em seguida, configure o projeto da placa no instrumento usando o software de biossistema aplicado com a curva padrão selecionada como o tipo de experimento, complete o layout da placa.

Um exemplo é mostrado nesta tabela, que também pode ser encontrada no documento que acompanha. Não adicione nada ao poço selecionado como a curva padrão. Coloque o tampão básico de reação de reparo de excisão DTT lisado de células a uma concentração de dois microgramas por microlitro e todas as balizas moleculares usadas no experimento no gelo.

Em seguida, adicione o DTT ao tampão básico da reação de reparo por excisão até uma concentração final de uma pipeta milimolar. 15 microlitros de tampão básico de reação de reparo por excisão com DTT em cada poço de uma placa óptica Q-R-T-P-C-R compatível em gelo. Em seguida, seguindo o layout da placa, pipete as balizas para os poços apropriados.

Cada combinação de lisado e balizador molecular ou controle deve ser testada em triplicata. Finalmente, pipete cinco microlitros por poço do lisado nuclear diluído nos poços apropriados. É importante lembrar de manter todos os reagentes de farol molecular frios e pipetar os lisados para a placa como última etapa.

Lembre-se, os lisados contêm proteínas ativas e começarão a reparar os faróis moleculares assim que forem pipetados na mistura de reação. Portanto, é muito importante manter todos os reagentes frios para minimizar a quantidade de reparo do farol que ocorre antes de começar a fazer as medições. Depois de tudo adicionado, sele a placa com filme adesivo óptico e misture batendo suavemente na placa.

Em seguida, execute uma centrifugação rápida de dez segundos com uma centrífuga para reunir soluções no fundo dos tubos ou placa após a centrifugação, insira a placa na máquina de PCR quantitativo em tempo real e inicie o ensaio após a conclusão, exporte os dados brutos de preferência em formato Excel e siga as instruções no documento que acompanha para analisar os dados uma vez que os cálculos necessários tenham sido feitos. Plote os dados de fluorescência normalizados como porcentagem de fam livre em relação ao tempo em segundos em um gráfico de dispersão com erros correspondentes para avaliar a atividade de reparo do DNA e a qualidade dos extratos nucleares das células LN 4 28 e uma linha celular de superexpressão MPG designada como LN 4 28 MPG. O ensaio descrito neste vídeo foi realizado usando um farol molecular contendo o APE um substrato tetra furina como controle positivo.

Conforme mostrado nesta figura, ambas as linhagens celulares têm atividade robusta de APE um, conforme indicado pela inclinação acentuada, atividade de glicosato de DNA específica para remoção do substrato MPG. A hipo-hipoxantina indicada como HX foi medida em lisados nucleares de ambas as linhagens celulares. Cada lisado foi analisado usando um farol molecular básico de controle de reparo por excisão ou um farol molecular HX de reparo por excisão de base para o farol de controle LN 4 28 é mostrado em verde e LN 4 28 MPG mostrado em roxo para o hipo farol.

LN 4 28 é mostrado em azul e LN 4 28 MPG é mostrado em laranja. Os resultados são relatados como A, as unidades médias de fluorescência, e B, a fluorescência normalizada. Um aumento dependente do tempo na fluorescência indicativo de reparo HX ocorreu em cada célula.

Lisado incubado com o farol molecular HX conforme esperado. A linhagem celular LN 4 28 MPG indicada pelo traço laranja teve uma taxa de reparo muito maior, conforme indicado pelo acúmulo mais rápido de fluorescência do que a linhagem celular parental LN 4 28, que possui proteína MPG mínima. Assim, a taxa de reparo de lesões específicas de DNA por proteínas de reparo específicas pode ser medida a partir de extratos celulares em tempo real com níveis mínimos de clivagem de DNA não específica.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar seus beacons moleculares e medir as taxas de reparo de DNA em tempo real usando proteínas purificadas ou lisados celulares. Com relação à análise, é essencial avaliar a faixa dinâmica e os valores de fundo pela inclusão de reações de controle, como com ou sem as balizas de controle positivas e negativas. Considerando a variabilidade de poço para poço, é útil normalizar os dados nos poços individuais para os valores de entrada.

Esses são determinados pelo passo mais fino na temperatura de fusão. Isso e a inclusão de outros corantes, como uma matriz de rocha, serão responsáveis pela variabilidade inerente aos erros de pipetagem ou diferenças em detectores. Essa técnica nos permitiu elucidar a influência dos componentes de reparo por excisão de base individual na atividade e capacidade geral de reparo.

É sensível o suficiente para desmascarar pequenas alterações que não seriam detectáveis com métodos convencionais.