Name: Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Aprenda a medir atividades de reparação de DNA em lisados nucleares em tempo real usando beacons moleculares fluorescentes. Este método permite análise cinética quantitativa de glicosilases e AP endonucleases em amostras biológicas diversas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Pittsburgh e pelo National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] para RWS. Suporte para o Mecanismo de UPCI Lentivirus foi fornecido RWS pela Grant Suporte Cancer Center do National Institutes of Health [P30 CA047904]. O suporte também foi fornecida pelo Departamento da Universidade de Pittsburgh de Farmacologia e Biologia Química para DS. Foi também prestado apoio por ESTRO para CV.

<ol><li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li>
<li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li>
<li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li>
<li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O%28+6%29-methylguanine+DNA+methyltransferase%2C+methylpurine+DNA+glycosylase%2C+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities%3A+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li>
<li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li>
<li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li>
<li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li>
<li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+European+journal+of+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li>
<li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li>
<li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+probes%22%5BJournal%5D)">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li>
<li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li>
<li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li>
</ol>

RWS é consultor científico Trevigen, Inc. O resto dos autores declaram que não existem conflitos de interesse.

Existem mais de 600 citações usando &quot;farol molecular&quot; o prazo para detectar e quantificar as inúmeras moléculas e as atividades enzimáticas, incluindo atividade de helicase 6, atividade DNA polimerase 7,8, a atividade DNA ligase 9, a atividade da telomerase 10, a atividade DNA fotoliase 11 e DNA / RNA híbridos 12, entre muitos outros. Além da utilização de balizas molecular para a medição das actividades de ADN de reparação listados acima, nós e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Cloreto de Potássio </td><td> Pescador </td><td> P217-500 </td><td> Grau molecular </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pescador </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> BP229-1 </td><td> Grau molecular </td></tr><tr><td> TDT </td><td> Pescador </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Solução </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Sal </td><td> Sigma </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de Potássio </td><td> Sigma </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μM filtro </td&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer Produtos de diálise </td><td> Perfurar </td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Seringa </td><td> Pescador </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Agulha </td><td> Pescador </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL </td><td> Pescador </td><td> 05-408-129 </td><td> Preto </td></tr><tr><td> 15 mL Falcon Tubos </td><td> Pescador </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBuster Kit de Extração Protéica </td><td> Calbiochem </td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Beacons Molecular </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteína BioRad ensaio corante reconcentrado de agente </td><td> BioRad </td><td> Cat # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitativa, análise em tempo real da base de dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares utilizando lesão específicos beacons molecular

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Nós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células nucleares lisados ​​utilizando base excisão de reparação (BER) balizas molecular. O substrato (farol) é composto de um deoxyoligonucleotide contendo uma lesão de uma única base com um 6-Carboxifluoresceína (6-FAM) porção conjugada com o extremo 5 &#39;e uma porção DABCYL conjugada com a extremidade 3&#39; do oligonucleótido. O RIC farol molecular é de 43 bases de comprimento ea sequência foi concebida para promover a formação de uma estrutura de haste loop-com 13 nucleótidos no loop e 15 pares de bases no 1,2-tronco. Quando dobrada nesta configuração da porção 6-FAM é extinta por DABCYL de uma maneira não fluorescente via Förster Transferência de Energia de Ressonância (FRET) 3,4. A lesão é posicionada de tal modo que a remoção da lesão seguinte base e cisão vertente o oligonucleótido de base restante 5 contendo a porção 6-FAM é libertado a partir da haste. Solte umadescolamento nd do (DABCYL) Quencher resulta em um aumento de fluorescência que é proporcional ao nível de reparo do DNA. Ao coletar várias leituras dos valores de fluorescência, em tempo real avaliação da atividade da RIC é possível. O uso de padrão quantitativo PCR em tempo real instrumentos permite a análise simultânea de várias amostras. O desenho destes balizas BER moleculares, com uma lesão de uma única base, é passível de análises cinéticos, quantificação BER e validação inibidor e é adaptável para a quantificação da actividade de reparação de ADN em tecidos e os lisados ​​de células de tumor ou com proteínas purificadas. A análise da actividade BER em lisados ​​de tumor ou tecido aspira usando estas balizas molecular pode ser aplicável a medições de biomarcadores funcionais. Além disso, a análise da actividade BER com proteínas purificadas usando este ensaio quantitativo fornece uma rápida, o método de alto rendimento para a descoberta e validação de inibidores de BER.

Nós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células lisados ​​nucleares. O ensaio produz taxas de actividade de reparação de ADN passíveis de análise cinética e é adaptável para a quantificação da actividade de reparação de ADN em tecido e lisados ​​tumorais ou com proteínas purificadas.

Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

Descrevemos um método para a medição quantitativa e em tempo real das atividades da DNA glicosilase e da AP endonuclease em lisados nucleares celulares utilizando base ...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir as taxas de reparo de DNA e extratos nucleares celulares em tempo real, utilizando sondas moleculares que fluorescem quando reparadas. As sondas moleculares para reparo por excisão básica são compostas por oligonucleotídeos desoxi em uma estrutura de stem-loop contendo uma lesão de base única, com seis grupos fosfofluoresceína conjugados às extremidades cinco linhas e Dabcil conjugado à extremidade três linhas quando dobradas. A fosfofluoresceína é suprimida de forma não fluorescente pelo Dabcil por meio de transferência de energia de ressonância de Förster.Para avaliar a atividade de reparo do DNA, as sondas são incubadas com extratos nucleares celulares, que contêm enzimas de reparo. A DNA glicosilase é reconhecida e remove a lesão no DNA da sonda. Os sítios ABA resultantes são substratos para a endonuclease AP um ou ape um. Após o reconhecimento, a APE um cliva a estrutura do DNA no sítio ABA, permitindo que o DNA contendo o seis fam se dissocie livremente da estrutura em alfinete.A separação do quenchero resulta em um aumento da fluorescência proporcional ao nível de reparo do DNA, que pode ser avaliado em tempo real utilizando u

quantitative-real-time-analysis-base-excision-repair-activity-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, o estudo de diferentes abordagens de reconhecimento de lesões de DNA por meio de imagens AFM de molécula única é demonstrado com o sistema de reparo por excisão de nucleotídeos como exemplo. Os procedimentos de preparações de amostras de DNA e proteína e detalhes experimentais, bem como analíticos para os experimentos de AFM são descritos.

Microscopia de Força Atômica Investigações do Reconhecimento de Lesão de DNA no Reparo de Excisão de Nucleótidos

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

Estudar a cinética de reparação de danos de DNA requer um sistema para induzir lesões em regiões definidas do sub nucleares. Nós descrevemos um método para criar quebras de dupla-hélice localizadas usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com laser 405 nm e fornecer procedimentos automatizados para quantificar a dinâmica dos fatores de reparação para essas lesões.

Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

O objetivo do presente protocolo é quantificar a reparação de ligações cruzadas de ADN-proteína definidas no plasmídeo. Lesado plasmídeos são transfectados em linhas de células de mamíferos destinatário e peso molecular baixo colhidas em vários pontos de tempo pós-transfecção. Cinética de reparo de DNA são quantificados usando a extensão de vertente específica da primeira demão, seguido por qPCR.

Um ensaio simples, rápido e quantitativo para medida de reparação de ADN-proteína ligações cruzadas em plasmídeos transfectadas em células de mamíferos

Foi desenvolvido um método não-rotulados, não-rádio-isótopos para revisão de DNA polimerase e um ensaio de reparo de DNA usando espectrometria de massa MALDI-TOF de alta resolução e uma estratégia de extensão de nucleotídeo único. O ensaio provou ser muito específico, simples, rápida e fácil de executar para revisão e reparação patches menor que 9-nucleotídeos.

Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

Este artigo introduz passos essenciais de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina. Esses protocolos são comumente usados para estudar processos celulares relacionados ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA.

Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

Apresentado aqui é o endonuclease sgRNA/CAS9 e o protocolo de sequenciamento de próxima geração que pode ser usado para identificar as mutações associadas ao reparo de quebra de fios duplos perto do promotor CD4.

Usando o sequenciamento da próxima geração para identificar mutações associadas ao reparo de uma quebra de fio dupla induzida pelo CAS9 perto do promotor cd4

Os ensaios de captura de loop D (DLC) e extensão de loop D (DLE) utilizam o princípio da ligadura de proximidade juntamente com a PCR quantitativa para quantificar a formação de D-loop, a extensão de D-loop e a formação de produtos no local de uma ruptura induzível de fita dupla em Saccharomyces cerevisiae.

Detecção de Intermediários de Recombinação Homóloga via Ligadura de Proximidade e PCR Quantitativa em Saccharomyces cerevisiae

Aqui, é apresentado um protocolo para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, usando exemplos de enzimas ligase, nuclease e polimerase. O ensaio utiliza oligonucleotídeos marcados e não marcados com fluorescência que podem ser combinados para formar duplexes que imitam danos ao RNA e/ou DNA ou intermediários da via, permitindo a caracterização do comportamento enzimático.

Usando oligonucleotídeos sintéticos modificados para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Apresentamos protocolos para a avaliação da proficiência da via de reparo de quebra de fita dupla em células usando um conjunto de substratos repórteres extracromossômicos baseados em luminescência.

Avaliação da atividade de reparo de quebra de fita dupla de DNA usando ensaios repórter de alto rendimento e quantitativos baseados em luminescência

Aprenda a medir atividades de reparação de DNA em lisados nucleares em tempo real usando beacons moleculares fluorescentes. Este método permite análise cinética quantitativa de glicosilases e AP endonucleases em amostras biológicas diversas.

Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular (Vídeo) | JoVE Journal

Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

Explorar mais vídeos

Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular