On-Chip fenotipagem endotelial Inflamatória

O objetivo deste vídeo é demonstrar uma técnica de laboratório em chip para caracterizar o estado inflamatório das células endoteliais. Para começar, as células endoteliais da aorta humana são cultivadas até a confluência em um substrato de cultura de tecidos e, em seguida, inseridas em um dispositivo de cisalhamento de placas de Conan. As células são tratadas com a citocina pró-inflamatória, TNF alfa, e simultaneamente expostas a condições de estresse de cisalhamento diferencial por quatro horas, controlando com precisão a rotação do cone acima do substrato, o estresse de cisalhamento modula uma resposta inflamatória bem caracterizada à citocina.

Isso inclui a regulação positiva de moléculas de adesão, como VCA e ICAM. O substrato é transferido para um estágio de microscópio onde o dispositivo microfluídico APDMS é selado a vácuo diretamente na monocamada, criando canais de fluxo. As células monocíticas ativadas, THP one, voam sobre o hs pré-condicionado, onde se ligam proporcionalmente ao nível de adesão celular Expressão da molécula.

O estado inflamatório do endotélio é determinado quantificando o número total de células THP one que estão firmemente presas. Olá, meu nome é ela D Diverse, e eu sou Greg Foster. E eu sou Keith Bailey.

Estamos nos laboratórios dos professores, pastor e Simon no Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade da Califórnia em Davis. Hoje vamos descrever o uso de um laboratório em uma abordagem baseada em chip para examinar quantitativamente a disfunção endotelial e a inflamação. Essas ferramentas fornecem uma plataforma para conduzirmos estudos relacionados à superposição do estresse metabólico com fatores hidrodinâmicos e à regulação do fenótipo inflamatório endotelial e suscetibilidade à aterosclerose.

Portanto, nos referimos aos nossos dispositivos como mimético vascular, câmaras microfluídicas ou vmmc. Esses dispositivos nos permitem quantificar os resultados inflamatórios em células endoteliais e monócitos sob condições que mimetizam aqueles em vasos aterogênicos. O VMMC facilita o uso de pequenas quantidades de reagentes ou materiais que podem estar em suprimento limitado.

Eles também podem ser construídos em vários layouts e geometrias personalizáveis, tornando-os muito adequados para uma vasta gama de aplicações. Hoje vamos demonstrar um experimento representativo usando nosso laboratório em uma abordagem de chip. As monocamadas endoteliais humanas serão expostas à ativação de citocinas sob tensões de cisalhamento bem definidas.

Demonstraremos o uso de VMC para quantificar o recrutamento de células monocíticas humanas para a monocamada em tempo real, pois uma leitura funcional da ativação endotelial usando um torno de substratos circulares de três polegadas são moídos a partir de placas de cultura de tecidos de 100 milímetros. Os substratos de três polegadas são lavados com água destilada e, em seguida, esterilizados por imersão em etanol a 70%. Os substratos estéreis são colocados em placas de Petri de 100 milímetros e deixados secar.

Eles são então incubados com colágeno tipo um a uma concentração de 100 microgramas por mililitro por uma hora em temperatura ambiente e lavados com PBS. As células endoteliais da aorta humana ou HA são suspensas a uma concentração de 650.000 células por mililitro. Um mililitro de suspensão celular é colocado em gotículas em um substrato revestido de colágeno seco e espalhado em uma suspensão uniforme.

Os substratos assentados são então colocados em uma incubadora de 37 graus de 5% de CO2 e deixados presos à superfície do substrato. Após uma hora, nove mililitros de E GM dois crescimento, meio são adicionados e as células podem crescer em monocamadas a aproximadamente 90% de fluência de Co, as monocamadas estão prontas para serem usadas em experimentos transparentes subsequentes. As câmaras microfluídicas miméticas vasculares são construídas derramando o molde APDMS sobre uma forma mestra que compreende o canal desejado. Geometria.

A base de silicone é derramada em um barco de plástico, seguido pelo agente de cura de silicone na proporção de 10 para um em peso. O gel PDMS é então bem misturado, Tomando cuidado para não raspar as laterais do barco de caminho, e assim introduzindo lascas de plástico na mistura. Os mestres fotorresistentes são limpos com hexano e preparados para moldar o VMMC.

A mistura PDMS é então derramada sobre a forma mestre e, em seguida, colocada em uma câmara de vácuo. Na câmara. O ar é removido da mistura PDMS e sobe à superfície após 15 minutos.

O molde é removido da câmara e o ar é soprado suavemente sobre a superfície do PDMS para purgar as bolhas de ar restantes do molde. O molde é então coberto e colocado em um forno a 37 graus por uma hora, onde o PMS pode curar. Remova o gel PDMS solidificado do forno e faça incisões circulares ao redor da câmara usando um bisturi pequeno.

É crucial fazer isso gradualmente para evitar o contato com o material fotorresistente, pois isso danificará o molde mestre. Extirpe a câmara microfluídica das portas de entrada e saída do perfurador do molde para cada canal usando uma agulha de trava de isca de calibre 19. Além disso, faça furos para os tubos de vácuo longe dos canais.

A preparação para o VMMC está concluída. Pipete a citocina pró-inflamatória TNF alfa em seis mililitros de meio L 15 para atingir uma concentração final de 0,5 nanogramas por mililitro. O meio L 15 é utilizado aqui como fluido de cisalhamento devido à sua capacidade de tamponamento de pH na ausência de 5% de CO2.

O meio é então puxado para uma seringa estéril de 10 mililitros, que é usada para carregar o dispositivo de cisalhamento. A monocamada Confluent é então transferida para o dispositivo de cisalhamento de células, que foi esterilizado com etanol nivelado e a altura do espaço do cone foi ajustada. O substrato é removido da placa de Petri e colocado no bloco de medição de vidro centralizado e cuidadosamente inserido no fundo da câmara de alojamento, de modo que o cone fique diretamente acima das células.

O substrato é fixado apertando uniformemente os parafusos de aço inoxidável ao redor do bloco de medição. O meio de cisalhamento é então carregado na câmara, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. Em seguida, um computador é utilizado para inserir o programa de tensão de cisalhamento desejado e o micro motor separado é ligado.

Aqui utilizamos um cisalhamento oscilatório de zero mais ou menos cinco dines por centímetro quadrado. Após quatro horas, o programa de tosquia é interrompido. O bloco de medição é removido e o substrato é cuidadosamente colocado de volta na placa de Petri.

As células estão agora prontas para o ensaio de adesão de monócitos. Imediatamente após o cisalhamento, as monocamadas de HA são transportadas para a estação de microscópio para montagem do VMMC. O VMMC é conectado à mangueira de vácuo e submerso em água DI para remover quaisquer bolhas de ar presas nos canais.

Com a válvula de vácuo inicialmente desligada, a câmara é cuidadosamente pressionada na parte superior da monocamada e a válvula de vácuo é ligada. É fundamental garantir que nenhuma bolha de ar fique presa nos canais da câmara. Agora, 80 microlitros de HBSS com cálcio e magnésio são pipetados em um reservatório feito a partir do corte da ponta de uma isca de calibre 19 O fluido da agulha de bloqueio é empurrado para fora da ponta pressionando firmemente a parte superior do reservatório, que é então inserido na porta de entrada do VMMC.

Todo o conjunto é colocado na platina do microscópio e a câmera do microscópio e o monitor de vídeo são ligados. Uma seringa de vidro de 10 mililitros é carregada na bomba da seringa. Em seguida, o tubo da seringa é conectado à porta de saída do VMMC.

A taxa de fluxo é definida para induzir um estresse absoluto de um dente por centímetro quadrado dentro do canal e, em seguida, executar no modo de recarga de modo que a seringa puxe o fluido do reservatório através do canal. As células P um estimuladas com SDF um são suspensas a uma concentração de 2 milhões de células por mililitro. Dentro de dois minutos após a ativação do fluxo, 50 microlitros de suspensão celular são adicionados ao reservatório.

Novamente, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar após o fluxo em pleno desenvolvimento. O vídeo é capturado a três quadros por segundo e os dados são enumerados usando o software Image J. Aderente. As células THP um são definidas como movendo não mais do que metade do diâmetro da célula em 10 segundos.

Aqui demonstramos dados que descrevem a adesão de THP um a monocamadas de ha estimuladas com TNF alfa e condicionadas sob uma tensão de cisalhamento de parede alta constante de 15 dines por centímetro quadrado ou uma tensão de cisalhamento oscilatória de zero mais ou menos cinco dines por centímetro quadrado ha monocamadas condicionadas com tensão de cisalhamento oscilatória exibiram recrutamento de uma célula TP três vezes maior em comparação com monocamadas que experimentaram uma alta tensão de cisalhamento. Hoje, demonstramos o uso de técnicas in vitro personalizáveis que podem ser combinadas para fornecer informações importantes sobre os eventos inflamatórios precoces subjacentes à aterosclerose. Especificamente, quantificamos os resultados associados à disfunção endotelial e células expostas a estímulos inflamatórios sob condições hidrodinâmicas bem definidas.

O uso do VMM CS nos permite examinar mecanismos específicos subjacentes às interações de adesão endotelial e leucocitária. Esses dispositivos também têm a vantagem de serem flexíveis e baratos e facilitam o uso de materiais que podem ser limitados em oferta, como componentes derivados de soro de seres humanos. Nossos estudos aplicando esses dispositivos incluíram investigações de inflamação induzida por citocinas, lipídios e raiva em células endoteliais.

Também desenvolvemos ensaios no chip examinando os mecanismos de adesão em vários tipos de leucócitos, bem como no sangue total. Em última análise, prevemos que essa tecnologia levará a abordagens ex vivo para avaliar o risco de doença cardiovascular mediada por inflamação de um indivíduo.