Processamento de pós-produção de Fibras electrospun para Engenharia de Tecidos

O objetivo deste procedimento é produzir scaffolds biodegradáveis eletrofiados que possam ser esterilizados e ter espessura suficiente, bem como resistência mecânica apropriada para engenharia tecidual clínica. Isso é realizado primeiramente por meio da eletrofiação de polímeros biodegradáveis em arquiteturas primárias, aleatórias ou alinhadas e orientadas, ou em camadas sequenciais. O segundo passo consiste em aplicar modificações pós-fiação aos scaffolds, unindo várias camadas e esterilizando-as.

Em seguida, as células são introduzidas nos andamios e seu desempenho durante e após o cultivo é avaliado. O passo final é submeter as células a um regime de exercícios para simular o estresse fisiológico que as células encontrarão no organismo, a fim de prepará-las para o transplante. Em última instância, podemos avaliar a resposta das células ao exercício mediante a medição da matriz extracelular que produzem em resposta à tensão dinâmica.

Essa técnica é versátil e flexível, permitindo a fabricação de uma grande variedade de scaffolds com propriedades especificamente modificadas para a aplicação requerida. Por exemplo, os scaffolds podem ser projetados para tratar condições difíceis nas quais reparos teciduais são necessários, como a substituição de perda extensa de pele em pacientes gravemente queimados ou o reparo da mucosa oral danificada após câncer ou trauma. Embora este vídeo mostre a produção duradoura de células como um marcador de estresse dinâmico, você também poderia considerar uma variedade de proteínas da matriz extracelular, bem como avaliar muitos outros aspectos da biologia celular utilizando células submetidas ou não a exercício.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldade em obter scaffolds reprodutíveis, pois o processo de eletrofiação é afetado por muitas variáveis. A demonstração visual do processamento de scaffolds eletrofiados após a eletrofiação é importante. Raramente isso é discutido.

É necessário conhecer o processo para que a técnica seja aplicada com sucesso na clínica. Comece revestindo um coletor com mandril rotativo com folha de alumínio, com o lado brilhante voltado para fora. Em seguida, posicione quatro seringas de cinco mililitros carregadas com cinco mililitros do polímero de interesse.

Aqui, o ácido polilático é usado em uma bomba de seringa. Ajuste a taxa de fluxo para 40 microlitros por minuto por seringa e a distância de trabalho para 17 centímetros entre a ponta da agulha e o mandril. Em seguida, carregue as agulhas das seringas com +17.000 volts e realize a eletrofiação a partir da distância apropriada sobre o mandril revestido com folha de alumínio para obter fibras alinhadas.

Gire o coletor a 1000 RPM para fibras aleatórias. Gire o coletor a 200 RPM. Os scaffolds eletrofiados podem ser armazenados em folha de alumínio dentro de um recipiente selado a quatro graus Celsius na presença de um agente dessecante por pelo menos quatro meses após a eletrofiação do segundo polímero PHBV Lotus.

Novamente aqui. O PLA demonstrou a formação de camadas sobre o PHBV, utilizando então os parâmetros e condições normais para a centrifugação desse polímero. Mais uma vez, esse processo aditivo forma uma estrutura em dupla camada, produzindo um suporte bicamada para gerar um suporte multicamadas por meio do aquecedor.

Coloque quatro folhas de PLGA uma sobre a outra em posição horizontal e aqueça as folhas a 60 graus Celsius por três horas para produzir um suporte multicamadas por meio de moldagem por vapor. Despeje 10 mililitros de metano DILU ou DCM em um recipiente de tamanho apropriado. Em seguida, coloque quatro folhas de PLGA uma sobre a outra e suspenda-as a dois centímetros acima do DCM.

Por fim, feche o recipiente por uma hora à temperatura ambiente para obter a produção asséptica de andaimes por eletrofiação, dissolva polímeros de grau médico esterilizados por incubação em DCM e, em seguida, eletrofie. Aplique a solução polimérica em uma folha estéril envolta ao redor de um mandril esterilizado. Depois, em uma cabine de fluxo laminar estéril, incube o andaim em meio de crescimento sem antibiótico pelo período apropriado para verificar a esterilidade das amostras conforme a desinfecção experimental com etanol.

Coloque os suportes em uma solução de etanol e água destilada por 15 minutos. Para esterilização com ácido peracético. Mergulhe os suportes em uma solução de ácido peracético e PBS por três horas.

À temperatura ambiente para esterilização por gama, irradie os suportes com uma dose de três quilograys utilizando primeiro uma fonte de césio, corte os suportes em retângulos de cinco milímetros por 20 milímetros. Em seguida, use um micrômetro para medir a espessura do suporte. Depois, coloque os retângulos em um instrumento Bose Electro Force 3,100.

Calcule o módulo de Young e a elasticidade a partir da carga versus deslocamento como uma curva tensão-deformação plotada pelo instrumento. Comece rotulando as células com um corante fluorescente antes de semear as células. Em seguida, incube as células humanas de fibroblastos dérmicos até a confluência em tripsina e EDTA por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, centrifugue as células destacadas por 10 minutos a 150 vezes G em temperatura ambiente e re-suspenda o pellet em cinco mililitros de DMEM. Após a contagem, ajuste a concentração celular para semeadura e semeie as células sobre os scaffolds. Agora, realize a imagem da superfície dos scaffolds marcados com um microscópio fluorescente para investigar a penetração das células mais profundamente nos scaffolds; um microscópio confocal multiphoton pode ser utilizado.

Isso pode alcançar uma penetração de cerca de 200 mícrons na maioria dos scaffolds, com ou sem células. Em seguida, após o cultivo dos scaffolds semeados, fixe as amostras em um mililitro de formaldeído em PBS por 20 minutos a 37 graus Celsius. Após a fixação, lave as amostras três vezes com um mililitro de PBS e, em seguida, incube cada uma das amostras em 200 microlitros de anticorpos primários contra elastina por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Lave as amostras mais três vezes em um mililitro de PBS e, em seguida, incube as amostras em uma solução de anticorpo secundário em PBS contendo DPI por 30 minutos. Por fim, após lavar as amostras pela última vez em PBS, visualize as amostras no microscópio de fluorescência usando excitação de 365 nanômetros e emissão de 460 nanômetros para o DPI e excitação de 480 nanômetros e emissão de 533 nanômetros para o anticorpo secundário. Primeiro, autóclave o aparelho de regulação de fluxo e o balão; depois, em uma sala limpa, desembale o aparelho em uma cabine de fluxo laminar em uma posição adequada para eletrofiação.

Em seguida, conecte uma seringa de 50 mililitros cheia com PBS ao tubo lateral de uma torneira de três vias e encha o balão com o PBS até que fique túrgido. Agora, eletrofie o polímero desejado sobre o balão. Utilizando as condições normais de fiação e uma distância de trabalho de 10 centímetros, as fibras úmidas são aderentes o suficiente para grudar na superfície do balão sem se descolar posteriormente.

Uma vez que o suporte tenha secado, coloque o balão em um recipiente estéril e, em seguida, transporte o recipiente para uma cabine de fluxo laminar adequada para cultura celular. Cultivar células em um suporte sobre um balão distendido para submeter as células a um condicionamento biomecânico é a parte mais delicada deste procedimento. É essencial banhar repetidamente o balão com a solução celular, a fim de fixar o maior número possível de células ao suporte.

Verificamos que isso leva cerca de 20 minutos. Na capela, remova o balão do recipiente e coloque-o sobre uma superfície estéril, como a placa de Petri utilizada aqui, e pipete a suspensão celular sobre o balão revestido a cada 20 segundos durante 20 minutos, tentando distribuir as células uniformemente sobre a superfície do balão. Em seguida, coloque o balão de volta no recipiente de cultura e adicione o meio pré-aquecido apropriado ao tipo celular.

Por fim, conecte o aparelho de insuflação a uma bomba de seringa e insufle e desinsufle o balão conforme necessário para obter uma distensão biaxial. Uma bomba de seringa controlada por computador pode ser utilizada para alcançar um regime de distensão mais complexo. A eletrofiação pode ser empregada para criar scaffolds com arquiteturas aleatórias e ordenadas.

Isso é repetível e as fibras são uniformes. Por exemplo, fibras perpendiculares podem ser criadas por eletrofiação de um conjunto de fibras alinhadas sobre folha de alumínio, girando a folha em 90 graus, e então imediatamente eletrofiando um segundo conjunto de fibras alinhadas sobre as primeiras. Muitos tipos de polímeros podem ser eletrofiados com características que podem variar consideravelmente, conforme mostrado aqui para P-L-A-P-H-B-V-P-C-L e PLGA; observe que P-L-A-P-C-L e PLGA são todos scaffolds uniformes microfibrilares.

O PHBV é fiado como um colar de pérolas com nanofibras conectando microesferas de cinco a 20 mícrons de tamanho. Aqui, os andaimes foram inicialmente fiados usando PHBV e, em seguida, as seringas foram preenchidas com PLA e fiadas sobre os andaimes de PHBV. Essas imagens mostram camadas individuais representativas de PHBV e PLA.

Esta imagem ilustra como pode ser uma seção transversal de um bicamada A-P-H-B-V-P-L-A com um colar de par denso em nanofibras, uma camada de PHBV e uma camada de PLA mais aberta em microfibras. Os três tipos de estruturação facilitam a adesão e a proliferação celulares. Se forem necessárias estruturações mais espessas, pode-se empregar aquecimento e vapor para fundir camadas de estruturações, conforme demonstrado nas próximas imagens. Camadas de estruturações fundidas não apresentam deslaminação, e pode ser muito difícil identificar a junção entre as camadas.

Esta imagem mostra uma seção de uma estrutura de PLA vaporizada e dobrada, onde estruturas fibrosas iniciais de aproximadamente 150 mícrons foram posicionadas juntas. Em seguida, vapor de DCM foi utilizado para produzir estruturas muito mais espessas, de até 500 mícrons. Esta imagem mostra a mesma seção do bicamada vaporizada em uma ampliação aproximadamente duas vezes maior que a anterior. Nesta imagem, observe como a estrutura é composta por camadas de fibras muito mais espessas dispersas com camadas de fibras mais finas, criadas pelo aquecimento, dobrando camadas de fibras finas e grossas juntas para produzir estruturas com propriedades mecânicas complexas.

Mais uma vez, esta imagem mostra o mesmo suporte de aquecimento em quatro vezes. A ampliação anterior por membranas de camada pode ser realizada com diferentes tipos celulares, sendo cada um cultivado em uma membrana separada sem mistura, conforme demonstrado nestas imagens de fibroblastos dérmicos humanos corados com dois corantes fluorescentes diferentes para rastreamento celular. A primeira imagem é de fibroblastos sobre eletrofiado de PLA.

As células foram fixadas e coradas com os fibroblastos corados com dappy semeados sobre o eletrofiado PHBV. Neste experimento, os fibroblastos foram previamente corados com o corante vital cell tracker green. Observe que as células são encontradas no lado de PLA da bicamada.

Esta imagem é de uma seção representativa de uma bicamada com fibroblastos corados em vermelho na superfície inferior de PHBV e fibroblastos corados em verde na superfície superior de PLA. Nesta imagem, os fibroblastos foram previamente corados com rastreador celular vermelho enquanto cresciam na superfície de A-P-H-B-V. Assim, o uso de corantes fluorescentes vitais fornece uma metodologia conveniente para observar a distribuição de células em uma matriz enquanto as células ainda estão em crescimento.

O método de esterilização afeta o andróide e o cultivo celular subsequente. Este gráfico de linhas ilustra os efeitos do ácido paracético, da irradiação gama e do etanol na resistência à tração e no módulo de Young de um andróide de PLG.

Cada um dos métodos de esterilização altera a resistência à tração máxima e a elasticidade das estruturas. O cultivo de células nessas estruturas reduz ainda mais sua tensão máxima à tração, mas aumenta a elasticidade. Este gráfico de barras ilustra o efeito que o método de esterilização tem sobre o diâmetro da fibra de uma estrutura individual.

A irradiação gama não tem efeito significativo no diâmetro da fibra, enquanto o ácido paracético e o etanol reduzem o diâmetro da fibra em aproximadamente 50%. Assim, a melhor maneira de obter scaffolds estéreis é produzi-los em condições assépticas. Esta última série de imagens demonstra que as células permanecem viáveis durante a distensão dinâmica e também produzem quantidades aumentadas de elastina. Observe o desenvolvimento da coloração azul-escura produzida pelas células em crescimento, conforme detectado com um indicador metabólico, MTT.

Aqui, as células em azul cultivadas em um balão e submetidas à distensão biaxial desenvolveram fibras de elastina, conforme indicado pela coloração verde. Isso contrasta acentuadamente com a ausência de elastina quando as mesmas células são mantidas em condições estáticas em uma estrutura de balão idêntica. Após este procedimento, outros métodos, como o cultivo estático e o fluxo de fluido das células nas estruturas, podem ser realizados para investigar como as células respondem a diferentes condições de cultivo.

O desenvolvimento do cultivo de células em uma estrutura suportada por um balão, que pode ser distendido, mostrou-se muito útil, pois abriu caminho para que pesquisadores na área da engenharia de tecidos possam agora explorar o efeito do condicionamento dinâmico de células em construtos de tecidos engenheirizados. Não se esqueça de que trabalhar com fontes de alta tensão, solventes, lasers e células humanas pode ser perigoso, e treinamento adequado e precauções devem sempre ser tomados ao realizar este procedimento.