Engenharia bactérias aderentes pela criação de um único sintético Curli Operon

O objetivo geral do experimento a seguir é conferir propriedades aderentes a bactérias, a fim de facilitar sua separação de meios líquidos. Isso é alcançado primeiramente por meio do design de uma curli sintética, para contornar a regulação genética complexa e permitir a produção fácil e em larga escala de polímeros adesivos. Em um segundo passo, bactérias aderentes são visualizadas e quantificadas em poliestireno, o que permite uma estimativa rápida da eficiência do dispositivo sintético.

Em seguida, bactérias aderentes são visualizadas em vidro por microscopia confocal. Para observar diretamente o biofilme e obter informações sobre sua estrutura, são obtidos resultados que mostram um aumento significativo da aderência na linhagem que carrega o dispositivo sintético, com base tanto na aderência quanto na medição percentual e nas observações microscópicas. A principal vantagem da abordagem da biologia sintética em comparação com métodos existentes, como clonagem convencional, é que construtos contendo apenas os genes estritamente necessários, com os sinais apropriados, podem ser obtidos muito rapidamente.

Este método pode ajudar a responder uma questão fundamental na área de biorremediação, como enfrentar o desafio de remover bactérias carregadas de metais de resíduos radioativos. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque são necessários conhecimentos básicos sobre sinais regulatórios genéticos e manipulação de bancos de dados. A demonstração visual focará na quantificação e visualização de biofilmes, pois essas duas etapas são muito difíceis de aprender devido à fragilidade dos biofilmes.

O primeiro passo para projetar o carron sintético é determinar a organização genética dos genes curly e localizar seus sinais transcricionais e translacionais endógenos. Isso é realizado utilizando bancos de dados especializados, como o REON DB ou o eco gene. O próximo passo é selecionar os cinco genes absolutamente necessários para a síntese do curly: CSGB e CSGA, que codificam os monômeros da fibra, e C-S-G-E-C-S-G-F e CSGG, que codificam o complexo de secreção do curly. As sequências escolhidas são extraídas do banco de dados em formato fasta. A gestão de dados e a pré-análise in silico serão realizadas com o software Clone Manager, já que o agrupamento C-S-G-G-F-E é antissenso no genoma de e coli.

Essa sequência precisa ser convertida em sua contraparte complementar reversa. Utilize as operações de ferramentas do gerenciador de clones: processo de molécula inverter molécula, cole a sequência C-S-G-E-F-G após C-S-G-B-A utilizando a função ligar. Em seguida, adicione o promotor apropriado PRCN na extremidade inicial da sequência iCal C-S-G-B-A-E-F-G.

O locus RCN codifica uma bomba FLX chamada RCNA, responsável pela desintoxicação de níquel e cobalto, e seu regulador metálico cognato RCNR. Na ausência de cobalto ou níquel, o repressor RCNR se liga à caixa RCNR no DNA e impede a ativação completa da transcrição dos genes downstream. Se a concentração intracelular de cobalto ou níquel aumentar, a ligação do cobalto ou níquel à proteína RCNR impede a fixação do repressor ao promotor, e a atividade transcricional de P-R-C-N-A aumenta, colocando os cinco genes curvos selecionados sob o controle do promotor.

Prevê-se que os PRCN encaracolados sejam superproduzidos na presença de cobalto e níquel. Em seguida, otimize os sinais transcricionais adicionando um sítio de ligação ao ribossomo perfeito ou RBS antes do primeiro ATG da sequência de DNA CS gba e um segundo RBS perfeito antes da sequência C-S-G-E-F-G. Para atender aos padrões do I GMs, o dispositivo deve ser flanqueado por um prefixo padrão de bio brick contendo sítios de restrição para ECO R um e X-bar um, e um sufixo contendo sítios de restrição para SPE um e PST um, para facilitar a montagem subsequente.

A parte do bio brick em si não pode conter nenhum dos sítios de reconhecimento ECO R I, PST I, SPE I e Xba R I. Assim, esses sítios foram eliminados por mutações silenciosas; a análise de restrição in silico do dispositivo revelou um sítio PST I na sequência CSGA, um sítio PST I na sequência RCNR e um sítio ECO R I no gene CSGE. Esses sítios foram modificados por mutações silenciosas.

Uma vez concluído o projeto do opor sintético, realize uma simulação de tradução utilizando o software clone manager. Utilize o programa de alinhamento de sequências blast para verificar a homologia perfeita entre as proteínas curly do tipo selvagem e as proteínas codificadas pelo on sintético para iniciar este procedimento em cada poço de uma placa de policarbonato de 24 poços com dois mililitros de meio mínimo M 63 contendo 0,2% de glicose, inoculando cada poço com 10 elevado a seis células de um cultivo bacteriano de crescimento noturno. Incube as bactérias a 30 graus Celsius por 18 a 48 horas sem agitação; cada coluna da placa de 24 poços representa uma modalidade.

A quantidade adequada de cobalto e antibiótico é adicionada quando necessário. As três primeiras fileiras são usadas para quantificar as bactérias aderentes A, calculando-se a média das três repetições. A última fileira restante é usada para visualizar o biofilme por coloração com violeta de cristal após 18 a 48 horas, recuperando-se o sobrenadante contendo as células planctônicas de cada poço das três primeiras fileiras da placa de 24 poços e transferindo-se o sobrenadante para um tubo de hemólise.

Lave cuidadosamente cada poço com um mililitro de meio M 63 e aspire a lavagem no tubo de hemólise junto com o sobrenadante inicial. Este pool é denominado células nadadoras, chamadas S. O fundo dos poços na placa de microtitulação está coberto com células aderentes. Para recuperar o biofilme, adicione um mililitro de M 63 em cada poço.

Realize uma raspagem do poço com a ponteira da pipeta, depois aspire e dispense várias vezes, transferindo a fração de biofilme para um novo tubo de hemólise. Vortexe o tubo por 15 segundos. Colete a fração de biofilme em tubos de hemólise.

Este pool representa as células aderidas à superfície, denominadas B. Transfira 200 microlitros da fração sobrenadante e biofilme dos tubos de hemólise para uma placa de 96 poços. Estime o número de bactérias aderidas à superfície e em natação a partir da densidade óptica a 600 nanômetros. A porcentagem de aderência para cada modalidade é calculada utilizando a fórmula B vezes 100 dividido por três vezes S mais B. Para visualizar o biofilme, apenas na última linha da placa de 24 poços, descarte as células planctônicas desses poços.

Adicione um mililitro de M 63 a cada poço para lavar o biofilme que se desenvolveu no fundo da placa. Seque a placa descoberta por uma hora a 80 graus celsius; após uma hora, adicione 100 microlitros de violeta cristal a 20% a cada poço, seguido por lavagens extensivas com água. Um chassis fluorescente é necessário para este protocolo.

Um hospedeiro adequado para o plasmídeo contendo o curli sintético é a linhagem e coli SCC one, que expressa constitutivamente a proteína verde fluorescente sem diferença observável em relação à linhagem parental MG 1 16 55. Transforme a linhagem hospedeira com um plasmídeo puck 57 contendo o curli sintético para obter a linhagem S 23. Transforme a linhagem hospedeira com um plasmídeo controle puck 18 para obter a linhagem controle.

Cultive sob agitação durante a noite pré-culturas das cepas S 23 e S 24 a 30 graus Celsius em meio M 63 suplementado com glicose e ampicilina. No dia seguinte, adicione 20 mililitros de meio M 63 a uma placa de Petri e, em seguida, inocule 15 mililitros de meio M 63 em placas de Petri com 100 microlitros das pré-culturas. Adicione a concentração apropriada de cobalto e não se esqueça do controle negativo sem cobalto.

Introduza três lamínulas de vidro retangulares em cada placa de Petri. Incube as placas durante a noite a 30 graus Celsius sem agitação. As bactérias podem ser visualizadas diretamente ao microscópio fluorescente nos dias seguintes.

É importante evitar a secagem da amostra, portanto os seguintes passos devem ser realizados com cuidado, mas rapidamente. Remova cada lamínula das placas de Petri e drene-a cuidadosamente. Limpe com cuidado a face inferior com um pequeno cotonete embebido em etanol 70% para remover todos os resíduos bacterianos destinados à observação por microscopia confocal.

Deposite a lamínula sobre uma lâmina de vidro com a face superior coberta pelo biofilme colocada voltada para cima. Em seguida, o biofilme é coberto por uma lamínula maior, que é fixada à lâmina de vidro com verniz.

Inverta o conjunto para que o biofilme fique agora na face inferior. Coloque o conjunto sob o microscópio a laser confocal neste experimento. Utiliza-se um microscópio a laser confocal Zeiss LSM five 10 meta na plataforma CT micro.

Selecione a objetiva de imersão em óleo de 40 vezes. Utilize as seguintes configurações: excite a GFP em 488 nanômetros e colete a fluorescência bacteriana na faixa de 500 a 600 nanômetros. Use a objetiva de imersão em óleo de 40 vezes para adquirir as imagens.

No modo confocal de varredura a laser, analise as estruturas tridimensionais gerais dos biofilmes, desde a superfície sólida até a interface com o meio de crescimento, utilizando um incremento de um mícron.

Realize projeções tridimensionais com um software maus, determine a espessura do biofilme pela análise do valor médio de C ao longo de seções longitudinais estatísticas. A quantificação do biofilme, volumes bio, pode ser extraída de pilhas Z confocais. As habilidades de aderência de E. coli modificada geneticamente para superproduzir curly em resposta a metais podem ser avaliadas por métodos simples.

Por exemplo, a coloração com violeta cristal em placas Irene lisas de 24 poços permite a visualização rápida da formação de biofilme no fundo de cada poço, conforme mostrado pela diferença na intensidade da cor roxa. Aparentemente, a linhagem selvagem é menos aderente do que a linhagem modificada. Um método quantitativo é medir as porcentagens de aderência em poliestireno das linhagens selvagem e modificada com várias concentrações de cobalto.

Os resultados apresentados neste gráfico revelam que a porcentagem de aderência da linhagem modificada é 1,5 vez maior do que a da linhagem selvagem na ausência de cobalto. Além disso, observou-se um reforço significativo da aderência na presença de concentrações crescentes de cobalto, em meios com concentrações de cobalto de 25 micromolar ou 50 micromolar, nas quais as porcentagens de aderência das células modificadas atingem 30% e 40%, respectivamente. As capacidades de aderência também podem ser comparadas utilizando microscopia com bactérias marcadas com GFP cultivadas em lâminas de vidro; observações por microscopia de epifluorescência de bactérias verdes sobre um fundo escuro revelam que a linhagem modificada forma um biofilme, enquanto a linhagem selvagem forma apenas microcolônias, indicadas pelas setas.

A análise por microscopia confocal fornece uma visão geral da estrutura tridimensional do biofilme. As reconstruções da vista superior são mostradas nos painéis A e as reconstruções da vista lateral são mostradas nos painéis B. Os resultados confirmam que a linhagem modificada é mais aderente e forma um biofilme mais denso e espesso do que o tipo selvagem. Ao tentar este procedimento, é importante verificar cuidadosamente o design experimental, por exemplo, para explorar o potencial de biorremediação de *E. coli* modificada ou *Occus ants* no contexto de efluentes radioativos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar um gene sintético utilizando software de gerenciamento de clones e de como quantificar rapidamente a expressão de cepas bacterianas. Não se esqueça de que trabalhar com genes sintéticos e organismos geneticamente modificados pode ser extremamente perigoso. Tais materiais devem ser manipulados de acordo com as leis vigentes, e precauções, como a autoclavação de bactérias transformadas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.