Engenharia bactérias aderentes pela criação de um único sintético Curli Operon

O objetivo geral do experimento a seguir é dar propriedades aderentes às bactérias, a fim de facilitar sua separação do meio líquido. Isso é conseguido primeiro projetando um curli sintético para contornar a regulação genética complexa e permitir a produção fácil e massiva de polímeros pegajosos. Como segunda etapa, uma bactéria aderente é visualizada e quantificada em poliestireno, o que permite uma estimativa rápida da eficiência do dispositivo sintético.

Em seguida, uma bactéria aderente é visualizada no vidro por microscopia confocal. Para observar diretamente o biofilme e obter informações sobre sua estrutura, são obtidos resultados que mostram um aumento significativo da aderência na cepa que abriga o dispositivo sintético com base tanto na adesão, medição percentual quanto em observações microscópicas. A principal vantagem da abordagem da biologia sintética sobre os métodos existentes, como a clonagem convencional, é que a construção que abriga apenas os genes absolutamente claros necessários com sinais apropriados pode ser obtida muito rapidamente.

Este método pode ajudar a responder a uma questão-chave no campo da biorremediação, como enfrentar o desafio de remover bactérias carregadas de metal de resíduos radioativos. Geralmente, indivíduos novos neste método têm dificuldade porque são necessários conhecimentos básicos sobre sinais regulatórios genéticos e manuseio de bancos de dados. A demonstração visual se concentrará na quantificação e visualização do filme biológico porque essas duas etapas são muito difíceis de aprender devido à fragilidade dos bioframes.

O primeiro passo para projetar o carron sintético é determinar a organização genética dos genes encaracolados e localizar seus sinais endógenos, transcricionais e translacionais. Isso é feito usando bancos de dados especializados, como REON DB ou eco gene. O próximo passo é selecionar os cinco genes absolutamente necessários para a síntese encaracolada, CSGB e CSGA e codificar os monômeros de fibra e C-S-G-E-C-S-G-F e CSGG codificar o complexo de secreção de ondulação, extrair as sequências escolhidas do banco de dados em formato mais rápido, gerenciamento de dados e pré-análise in silico será realizada com software gerenciador de clones, pois o cluster C-S-G-G-F-E é antisense no genoma de e coli.

Essa sequência precisa ser convertida em sua contraparte de complemento reverso. Use as ferramentas do gerenciador de clones operações processar molécula inverter molécula, cole a sequência CSG atrás de CSGBA usando a função ligate. Em seguida, adicione o promotor PRCN apropriado na frente da sequência c-s-g-b-a-e-f-g iCal.

O locus RCN codifica uma bomba FLX RCNA, responsável pela desintoxicação de níquel e cobalto, e seu regulador metallo cognato RCNR. Na ausência de cobalto ou níquel, o repressor RCNR se liga à caixa RCNR no DNA e impede a ativação completa da transcrição dos genes a jusante. Se a concentração intracelular de cobalto ou níquel aumentar, a ligação de cobalto ou níquel à proteína RCNR impede a fixação do repressor ao promotor e a atividade transcricional de P-R-C-N-A aumenta colocando os cinco genes encaracolados selecionados sob o controle do promotor.

Prevê-se que os encaracolados PRCN sejam superproduzidos na presença de cobalto e níquel. Posteriormente, otimize os sinais transcricionais adicionando um local de ligação de ribossomo perfeito ou RBS na frente do primeiro A TG do CS gba, sequência de DNA e um segundo RBS perfeito na frente da sequência CSGE. Para se adequar aos padrões I GMs, o dispositivo deve ser flanqueado por um prefixo de tijolo biológico padrão contendo locais de restrição para ECO R um e X-bar um, e um sufixo contendo locais de restrição para SPE um e PST um para facilitar a montagem posterior.

A parte do bio tijolo em si não pode conter nenhum local de reconhecimento ECO R, PST um SPE e X-bar R um. Assim, esses locais foram eliminados por mudanças de mutação silenciosas na análise de restrição in silico do dispositivo revelou um PST, um local na sequência CSGA, um PST um local na sequência RCNR e um ECO R um no gene CSGE. Esses locais foram modificados por mutações silenciosas.

Quando o design do opor sintético estiver concluído, execute uma simulação de tradução usando o software gerenciador de clones. Use a explosão do programa de alinhamento de sequência para verificar a homologia perfeita entre as proteínas encaracoladas do tipo selvagem e as proteínas codificadas pelo sintético para iniciar este procedimento para cada poço de uma placa de poliestireno de 24 poços com dois mililitros de M 63, meio mínimo com 0,2% de glicose inocular cada poço com 10 a seis células de uma cultura bacteriana durante a noite. Cultive as bactérias a 30 graus Celsius por 18 a 48 horas sem agitar cada coluna da placa de 24 poços representa uma modalidade.

A quantidade adequada de cobalto e antibiótico é adicionada quando necessário. As três primeiras linhas são usadas para quantificar as bactérias aderentes A pela média das três repetições. A última fileira restante é usada para visualizar o biofilme por coloração violeta cristalina após 18 a 48 horas, recuperar o supinato contendo as células planctônicas de cada poço das três primeiras fileiras da placa de 24 poços e transferir o supinato para um tubo de hemólise.

Enxágue cuidadosamente cada poço com um mililitro de meio M 63 e puxe a lavagem no tubo de hemólise com o supinado inicial. Esta piscina é chamada de células natatórias chamadas S. O fundo dos poços na microplaca é coberto com células de aderência. Para recuperar o biofilme, adicione um mililitro de M 63 em cada um.

Raspe bem com a ponta da pipeta e, em seguida, pipete para cima e para baixo e transfira a fração de biofilme para um novo tubo de hemólise. Vortex o tubo por 15 segundos. Colete a fração de biofilme em tubos de hemólise.

Este pool representa as células ligadas à superfície chamadas B transferindo 200 microlitros da fração supinato e biofilme dos tubos de hemólise para uma placa de 96 poços. Estime o número de bactérias ligadas à superfície e nadadoras a partir da densidade óptica em 600 nanômetros. A porcentagem de adesão para cada modalidade é calculada usando a fórmula B vezes 100 dividido por três vezes S mais B.To visualizar o biofilme apenas para a última linha dos 24, placa de poço descartar as células de plâncton desses poços.

Adicione um mililitro de M 63 a cada poço para enxaguar o biofilme que se desenvolveu no fundo da placa. Seque a placa descoberta por uma hora a 80 graus Celsius após uma hora, adicione 100 microlitros de violeta cristal 20% para dois a cada poço, seguido de lavagens extensas com água. Um chassi fluorescente é necessário para este protocolo.

Um hospedeiro adequado para o plasmídeo que carrega o encaracolado sintético é a cepa e coli SCC one, que expressa constitutivamente a proteína fluorescente verde sem diferença observável da cepa original MG 1 16 55. Transformar a estirpe hospedeira com um plasmídeo puck 57 com o curli sintético para obter a estirpe S 23. Transforme a cepa hospedeira com um disco de plasmídeo de controle 18 para obter a cepa de controle.

S 24 crescem durante a noite pré-culturas das cepas S 23 e S 24 a 30 graus Celsius. No meio M 63 suplementado com glicose e ampicilina no dia seguinte, adicione 20 mililitros de meio M 63 a uma placa de Petri e, em seguida, inocule 15 mililitros de M 63 em placas de Petri com 100 microlitros das pré-culturas. Adicione a concentração apropriada de cobalto e não se esqueça do controle negativo sem cobalto.

Introduza três lamínulas de vidro retangulares em cada placa de Petri. Incube os pratos durante a noite a 30 graus Celsius sem agitar. As bactérias podem ser visualizadas diretamente sob o microscópio fluorescente nos dias seguintes.

É importante evitar o ressecamento da amostra, portanto, as etapas a seguir devem ser executadas com cuidado, mas rapidamente. Remova cada lamínula das placas de Petri e escorra-a com cuidado. Limpe cuidadosamente a parte inferior da face com um pequeno cotonete embebido em etanol a 70% para limpar todos os resíduos bacterianos para observação confocal.

Depositar a lamínula numa lâmina de vidro com a face superior coberta pelo biofilme colocado virado para cima. O biofilme é então coberto com uma lamínula maior, que é fixada ao vidro. Deslize com verniz.

Inverta a configuração para que o biofilme fique agora na face inferior. Coloque a configuração sob o microscópio confocal a laser neste experimento. Um microscópio laser confocal Zeiss LSM cinco 10 é usado na plataforma micro CT.

Selecione a objetiva de imersão em óleo de 40 vezes. Use as seguintes configurações, excite GFP em 4 88 nanômetros e colete a fluorescência bacteriana na faixa de 500 a 600 nanômetros. Use a objetiva de imersão em óleo de 40 vezes para adquirir imagens.

No modo confocal de varredura a laser. Digitalize as estruturas tridimensionais gerais dos biofilmes da superfície sólida até a interface com o meio de crescimento. Usando um passo de um mícron.

Realizar projeções tridimensionais com um software maus, determinar a espessura do biofilme pela análise do valor médio de C ao longo de seções longitudinais estatísticas. Quantificação de biofilme, os volumes de bio podem ser extraídos de pilhas Z confocais. As habilidades de aderência da E. coli projetada para produzir encaracolados em excesso em resposta ao metal podem ser avaliadas por métodos simples.

Por exemplo, a coloração violeta cristalina em 24 placas de Irene bem polidas permite a visualização rápida da formação de biofilme no fundo de cada poço, conforme mostrado pela diferença na intensidade da cor roxa. Parece que a cepa do tipo selvagem é menos aderente do que a cepa projetada. Um método quantitativo é medir as porcentagens de aderência no poliestireno do tipo selvagem e nas cepas modificadas com várias concentrações de cobalto.

Os resultados apresentados neste gráfico revelam que a porcentagem de aderência da cepa projetada é 1,5 vezes maior do que a da cepa do tipo selvagem na ausência de cobalto. Além disso, foi observado um reforço significativo da aderência na presença de concentrações crescentes de cobalto em meios com concentrações de cobalto de 25 micromolares ou 50 micromolares percentuais de células modificadas de adesão atingem 30% e 40%, respectivamente. As habilidades de aderência também podem ser comparadas usando microscopia com bactérias marcadas com GFP cultivadas em lâminas de vidro, observações de microscopia de epifluorescência de bactérias verdes em um fundo preto revelam que a cepa projetada forma um biofilme, enquanto a cepa trippe selvagem forma apenas microcolônias indicadas pelas setas.

A análise de microscopia confocal fornece uma visão geral da estrutura tridimensional do biofilme. As reconstruções da vista superior são mostradas nos painéis A e as reconstruções da vista lateral são mostradas nos painéis B. Os resultados confirmam que a cepa projetada é mais aderente e forma um biofilme mais denso e espesso do que o tipo selvagem. Ao tentar este procedimento, é importante verificar novamente o projeto da operação, por exemplo, para explorar o potencial de biomediação de E. coli modificada ou formigas no contexto de águas residuais radioativas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar uma abertura sintética usando um software gerenciador de clones e como quantificar rapidamente a emissão de cepas bacterianas. Não se esqueça de que trabalhar com genes sintéticos e organismos geneticamente modificados pode ser extremamente perigoso. Eles devem estar de acordo com as leis vigentes e precauções como autoclavagem de bactérias transformadas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.