Name: Um Ensaio Galvanotaxis para Análise de Precursores Neurais Cinética migração celular em um campo aplicado externamente Corrente Contínua Elétrica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a analisar a migração de precursores neurais adultos em campos elétricos contínuos usando câmaras Galvan Axxis e imagem em lapso de tempo. Este método revela propriedades galvanotáticas para estudos de reparo neural.

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Este trabalho é financiado pelas Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (Grant # 249669 e # 482986) e Coração and Stroke Foundation of Canada (Grant # 485508). Os autores agradecem Youssef El-Hayek e Dr. Qi Wan por sua assistência no desenvolvimento dos protocolos experimentais.

Todos os procedimentos que envolvem manipulação de animais foram aprovados pela Universidade de Toronto Comitê Animal Care, de acordo com as diretrizes institucionais (protocolo no. 20009387). Os métodos que se seguem devem ser realizados utilizando ferramentas e técnicas estéreis, numa câmara de fluxo laminar, onde aplicável. No texto do protocolo a seguir, a frase &quot;EFH-SFM&quot; refere-se a meio isento de soro suplementado com factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento de fibroblastos básico e heparina. EFH-SFM é usado quando a investigar o galvanotaxis de NPCs indiferenciadas, porque esses mitógenos manter NPCs em sua 4 estado indiferenciado. Ao investigar a galvanotaxis de NPCs induzidas a diferenciar-se em tipos de células maduras, &quot;FBS-SFM&quot; refere-se a meio isento de soro suplementado com 1% de soro fetal bovino. FBS promove a diferenciação de maduras NPCs em fenótipos neurais 5. 1. Isolamento e Cultura de precursores neurais (Nãomostrado em video) <ol><li> Anestesiar um rato CD1 (6-8 semanas de idade) com isofluorano e sacrifício através de deslocamento cervical. </li><li> Extinguir a cabeça em etanol a 70% e decapitar o animal com tesouras de dissecação afiadas. </li><li> Enquanto mantém a cabeça com pinça cirúrgica, remover a pele na superfície dorsal para expor o crânio. </li><li> Usando um bisturi e não. Lâmina 11, marcar o crânio no seio frontal ao longo do eixo mediolateral, e também ao longo da sutura sagital na direcção rostrocaudal. </li><li> Descasque os ossos parietais de distância da cabeça com nenhum. 7 pinças curvas, tendo cuidado para não furar o tecido cerebral. </li><li> Insira uma espátula fina embaixo do cérebro a partir de debaixo do cerebelo e avançando para os bulbos olfatórios. Enquanto segurando o crânio no lugar com uma pinça, puxe o cérebro do crânio e imediatamente colocá-lo na gelada líquido cefalorraquidiano artificial (veja receitas abaixo). </li><li> Sob um microscópio de dissecação, utilizando estériltesouras e pinças de dissecção cortar o cérebro de meia ao longo da linha média. Rodar cada hemisfério, de modo que a superfície (cut) medial virado para cima. </li><li> Selecione um hemisfério, e com a superfície medial voltada para cima, localize o esplênio do corpo caloso (região posterior do corpo caloso). </li><li> Fazer uma incisão da superfície do córtex do esplênio do corpo caloso ao longo do eixo dorsoventral. </li><li> Descasque o córtex incisão em direção ao bulbo olfativo para expor as paredes medial e lateral do ventrículo lateral. </li><li> Girar o hemisfério, de modo que a superfície dorsal virada para cima, e usar microtesoura curvadas para cortar e recolher as paredes expostas medial e lateral, que contêm a região periventricular onde residem NPCs 6. </li><li> Repita os passos 1,8-1,11 para o outro hemisfério. </li><li> Pipetar a tecido isolado em 7 ml de solução de tripsina (ver receita abaixo) num tubo de 15 cc, e colocar o tubo sobre um balancim de 37 ° Cincubadora durante 25 min. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 1500 rpm durante 5 min, o sobrenadante aspirado, e ressuspender o tecido em 2 ml de solução de inibidor de tripsina (ver receita abaixo). </li><li> Tritura-se o tecido suavemente com um pequeno furo de pipetas de Pasteur 30-50 vezes com cuidado para evitar bolhas de ar. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 1500 rpm durante 5 min, o sobrenadante aspirado, e ressuspender em 1-2 ml de SFM (ver receita abaixo) por trituração do pellet 3-5 vezes. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 1500 rpm durante 3 minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de SFM + EFH. </li><li> Conte viver a densidade celular com um hemocitómetro e as células da placa num frasco de cultura T25, a uma densidade de 10 células por uL de SFM + EFH. </li><li> Permitir que a cultura a crescer durante 7 dias não perturbadas para render flutuantes neuroesferas primárias compostas por NPCs. </li></ol> 2. Galvanotaxis Preparação Câmara <ol><li> Coloque 3 de vidro quadrado não. 1 lamelas (22 x 22 x 0,17) ind garrafa de 6N de ácido clorídrico durante a noite. </li><li> No dia seguinte, utilizar uma ponta de diamante, cortador de vidro para cortar seis tiras rectangulares (22 x 5 x 0,17 mm) de vidro a partir de qualquer quadrado. 1 lamínulas. </li><li> Transfira os deslizamentos lavado com ácido quadrados e retangulares deslizamentos em uma capela de fluxo laminar. Lave as tiras rectangulares e quadradas, primeiro com etanol 70%, em seguida com água de cultura de tecidos de grau autoclavado, e deixa-se secar numa Kim Wipe (para esterilidade adicionado, o vidro pode ser permitido para o ar seco). </li><li> Aplique graxa de vácuo para o perímetro de uma superfície das lâminas de vidro quadrados, e vedá-las à base de 60 mm pratos de Petri de plástico. </li><li> Aplique graxa de vácuo ao longo do eixo longo de uma superfície das tiras de vidro rectangulares e selá-los às arestas opostas das lâminas de vidro quadrados (de tal forma que elas fiquem paralelas umas às outras), a fim de criar uma calha central. </li><li> UV-esterilizar as câmaras durante pelo menos 15 min no fluxo laminar. </li><li> Pipetar 250-300 ul de poli-L-Lysine para a calha central das câmaras e incubar à temperatura ambiente durante 2 horas. </li><li> Aproximadamente 15 minutos antes do final do período de incubação, a preparação da solução de Matrigel (ver receita abaixo). </li><li> Aspirar o poli-L-lisina, lave as calhas centrais com 1 ml de água esterilizada, e uL de solução da pipeta 250-300 Matrigel para as calhas centrais. </li><li> Incubar as câmaras, a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Aspirar a solução Matrigel e lavar cuidadosamente as calhas centrais com 1-2 ml de SFM. </li><li> Pipetar 100 mL de EFH-SFM ou FBS-SFM para as calhas centrais e transferir as câmaras galvanotaxis para o palco de um microscópio de contagem. </li><li> Pipetar 3-4 ml da cultura neuroesfera contendo em uma placa de Petri de 60 mm e transferir a placa de Petri, para o estágio de microscópio de contagem. </li><li> Se a um objectivo de visualização de 5x, utilizar uma pipeta para transferir P10 5-8 neuroesferas inteiras (até quatro de cada vez) na calha central de cada galvanotaxiscâmara sem dissociar-los, e cuidadosamente espalhado as neuroesferas redor da calha central, sem perturbar o substrato Matrigel. </li><li> Adicionar um adicional de 150-200 ul EFH-SFM ou FBS-SFM para as calhas centrais. </li><li> Transferir as câmaras galvanotaxis em um de 37 ° C, 5% CO 2, 100% incubadora humidificada durante 17-20 h (se analisar NPCs indiferenciadas) para permitir que as neuroesferas a aderir ao substrato de Matrigel e dissociam-se em células individuais, como mostrado na Figura 1 . Se a análise de NPCs diferenciados, o período de incubação deve ser alargado para 69-72 horas para permitir a diferenciação das células. </li></ol> 3. Viver imagens de células Time-Lapse <ol><li> Permitir que o sistema de imagens ao vivo de células para equilibrar a 37 ° C, 5% CO 2 durante um período mínimo de 30 min antes do início da gravação de lapso de tempo. </li><li> Corte dois pedaços de 12 cm de 1 mm de diâmetro prata fio da bobina, eles de um lado, e colocá-los em Clorox blixiviação durante 20 minutos de modo a formar de Ag / AgCl. </li><li> Transferir as câmaras galvanotaxis para a plataforma de um microscópio de contagem e seleccionar que câmara irá ser utilizada para a análise de células live-migração de imagem com base nos seguintes critérios: i) as neuroesferas deve ser quase completamente dissociado em células individuais e, ii) as células devem possuir morfologias redondas com pouco ou nenhum processo que se estende dos corpos celulares. </li><li> Transferir a câmara galvanotaxis seleccionado numa câmara de fluxo laminar, em conjunto com um qualquer quadrado separado. Uma lamínula de vidro e graxa de vácuo. </li><li> Lava-se a tampa desliza em primeiro lugar com 70% de etanol, em seguida, em água esterilizada, e aplicar uma tira de massa lubrificante de vácuo sobre dois bordos paralelos da lâmina de cobertura. </li><li> Aspirar o meio de cultura a partir da calha central da câmara, em seguida, rapidamente colocar a lâmina de cobertura (graxa lado voltado para baixo) para a câmara de tal modo que a gordura restante nas duas tiras paralelas tiras de vidro rectangulares, criando efectivamente um telhadopara a câmara. </li><li> Pipetar 100 mL de fresco EFH-SFM ou FBS-SFM na calha central através de ação capilar. </li><li> Use graxa de vácuo para criar bordas de piscinas de meios de cultura em cada extremidade da calha central, como mostrado na Figura 2. </li><li> Cortar duas peças 15 cm de tubo de PVC, e com uma seringa de 10 cc com uma agulha de calibre 18 para injectar a solução de agarose cuidadosamente no tubo, garantindo não formar bolhas no interior dos tubos, e permitir que o gel solidificar durante 5 min. </li><li> Transferir a câmara galvanotaxis ao sistema vivo de células de imagem, juntamente com o gel de agarose a tubos, Ag / AgCl, e um par de vazios 60 pratos de Petri milímetros que serão utilizados como meios de cultura reservatórios e irá conter o Ag / AgCl. Permitir que a câmara galvanotaxis para descansar dentro do 37 ° C, 5% CO 2 ambiente durante 20-30 min. </li><li> Durante este tempo, preparar as tampas dos dois pratos de Petri vazias e da tampa da caixa de Petri a câmara de galvanotaxis por furos de perfuraçãoneles com uma ferramenta Dremel ou semelhante, como mostrado na Figura 3. </li><li> Pipetar 1-1,5 ml de EFH-SFM ou FBS-SFM para um ou outro lado da calha central, e 7-8 ml de SFM em cada placa de Petri vazia. Coloque uma placa de Petri em cada lado da calha central da câmara e galvanotaxis lugar um eléctrodo de Ag / AgCl em cada prato. Ponte o espaço entre a câmara de galvanotaxis e as placas de Petri para estabelecer a continuidade eléctrica com as pontes de gel de agarose, como se mostra na Figura 4. </li><li> Conectar os eletrodos de Ag / AgCl a uma fonte de alimentação externa, com um amperímetro em série para medir a corrente elétrica e ligue a fonte de alimentação. Use um voltímetro para medir a força do campo eléctrico em frente da calha central, e ajustar a saída da fonte de alimentação até que a intensidade do campo eléctrico desejado é alcançado (os ensaios realizados neste laboratório utilizam uma força dcEF de 250 mV / mm com corrente eléctrica entre 1 e 1,5 mA). </li><li> Iniciativate módulo do lapso de tempo no sistema de célula de imagem ao vivo, e permitir que o experimento de correr para a quantidade de tempo desejada. Após a conclusão do ensaio, as células de fixação em paraformaldeído a 4%, para análise de imunomarcação padrão. </li></ol>

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<li>Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).</li>
<li>McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Cell+Behavior+Electrically%3A+Current+Views+and+Future+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).</li>
<li>Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+competence+is+a+rare+property+of+neural+stem+cells+that+may+depend+on+genetic+and+epigenetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations.</a> Nat. Med. 8, 268-273 (2002).</li>
<li>Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Subependymal+Neural+Precursors%2C+but+Not+Differentiated+Cells%2C+Undergo+Rapid+Cathodal+Migration+in+the+Presence+of+Direct+Current+Electric+Fields%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields.</a> PLoS ONE. 6, e23808(2011).</li>
<li>Deuschl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Randomized+Trial+of+Deep-Brain+Stimulation+for+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).</li>
<li>Stone, S. S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+Entorhinal+Cortex+Promotes+Adult+Neurogenesis+and+Facilitates+Spatial+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory.</a> J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo foi adaptado a partir de métodos bem estabelecidos de estudos anteriores 7-9. Galvanotactic câmaras podem ser construídas utilizando uma variedade de técnicas diferentes, incluindo a construção de um poço de vidro separada para confinamento de sementeira de células, ou utilizando a ablação por laser de CO 2 para a microfabricação da calha central, 10,11. Algumas técnicas podem ser mais laboriosa ou dispendiosa do que outros. Nós descrevemos um ensaio simples e de baixo cus...

<table border="1"><tbody><tr><td height="44"> Nome do item </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Isolamento Celular Neural Precursor </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td> 11,688 g dissolvido em 100 ml de dH2O </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 7,456 g dissolvido em 100 ml de dH2O </td></tr><tr><td> 1M de MgCl2 </td><td> Sigma </td><td> M2393 </td><td> 20,33 g dissolvido em 100 ml de dH2O </td></tr><tr><td> 155 mM de NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td><td> 1,302 g dissolvido em 100 ml de dH2O </td></tr><tr><td> Glicose 0,5 M </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td> 9,01 g dissolvido em 100ml de dH2O </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> C7902 </td><td> 1,59 g dissolvido em 100 ml de dH2O </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina de pâncreas bovino </td><td> Sigma </td><td> T1005 </td><td></td></tr><tr><td> Sheep testículos hialuronidase </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido quinurênico </td><td> Sigma </td><td> K3375 </td><td></td></tr><tr><td> Ovomucóide inibidor de tripsina </td><td> Worthington </td><td> LS003086 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100046 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 21700075 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose 30% </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td></td></tr><tr><td> 7,5% de NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td> 23,83 g dissolvido em 100 ml de dH2O </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> Invitrogen </td><td> PMG8041 </td><td> Reconstituir em 1 ml de mistura de hormona e alíquota em 20 unidades ul. </td></tr><tr><td> FGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0226 </td><td> Reconstituir em 0,5 ml da mistura de hormona e alíquota em 20 unidades ul. </td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Sigma </td><td> H3149 </td><td></td></tr><tr><td> Apo-transferrina </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 3188-AT </td><td> 0,1 g dissolvido em 4 ml de dH 2 0 </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> Sigma </td><td> P7505 </td><td> Dissolver 9,61 mg em Apo-transferrina assimlução </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma </td><td> I5500 </td><td> Dissolver 25 mg em 0,5 ml de HCl 0,1 N e adicionar 3,5 ml de dH 2 0 </td></tr><tr><td> Selênio </td><td> Sigma </td><td> S9133 </td><td></td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> Sigma </td><td> P6149 </td><td></td></tr><tr><td> Ferramentas padrão de Dissecção </td><td> Belas Science Tools </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td> Zeiss </td><td> Stemi 2000 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Galvanotaxis Preparação Câmara </td></tr><tr><td> Lâminas de vidro tampa quadrada </td><td> VWR </td><td> 16004 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido clorídrico 6N </td><td> VWR </td><td> BDH3204-1 </td><td></td></tr><tr><td> Graxa de alto vácuo </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 60 milímetros placas de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td> Descongelar e alíquota em 150 unidades ul </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td><td> Só use se induzir a diferenciação NPC, caso contrário use SFM + meios de cultura EFH como indicado acima </td></tr><tr><td> Contando microscópio </td><td> Olimpo </td><td> CKX41 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Viver imagens de células Time-Lapse </td></tr><tr><td> Fio de prata </td><td> Alfa Aesar </td><td> 11434 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td></td></tr><tr><td> Calor inatividadeated FBS </td><td> Sigma </td><td> 16140071 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de PVC </td><td> Fisher Scientific </td><td> 80000006 </td><td> 3/32 &quot;ID x 5/32&quot; OD </td></tr><tr><td> Alvejante </td><td> Clorox </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Seringa de 10 cc </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Agulha de calibre 18 </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td></td></tr><tr><td> Broca Dremel </td><td> Dremel </td><td> Modelo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio invertido equipado com câmara, umidificado incubada </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert-200M </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Receitas <table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Volume </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> 6,2 ml </td></tr><tr><td>1M KCl </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> 1M de MgCl2 </td><td> 0,32 ml </td></tr><tr><td> 155mm de NaHCO3 </td><td> 16,9 ml </td></tr><tr><td> A glicose 1M </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> 0,09256 ml </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Água esterilizada </td><td> 74 ml </td></tr></tbody></table> Líquido cefalorraquidiano artificial <table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Volume ou massa </td></tr><tr><td> Líquido cefalorraquidiano artificial </td><td> 30 ml </td></tr><tr><td> Tripsina de pâncreas bovino </td><td> 40 mg </td></tr><tr><td> Sheep testículos hialuronidase </td><td> 22,8 mg </td></tr><tr><td> Ácido quinurênico </td><td> 5 mg </td></tr></tbody></table> &lt;strong&gt; Solução de tripsina <table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Volume ou massa </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Ovomucóide inibidor de tripsina </td><td> 10 mg </td></tr></tbody></table> Solução de tripsina Inhibitor <table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Água esterilizada </td><td> 37 ml </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10X </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Glucose 30% </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 7,5% de NaHCO3 </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Transferrina, solução Putrescine </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Solução a 25 mg de insulina </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Selênio </td><td> 100 e mu, L </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> Mix hormona (100 ml no total loja, a -20 ° C) <table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Água esterilizada </td><td> 37,5 ml </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10X (3:1) </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Glucose 30% </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 7,5% de NaHCO3 </td><td> 0,75 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 0,25 ml </td></tr><tr><td> Mix de hormônio </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> O soro livre de mídia EFH-SFM: adicionar 10 ul de EGF, 10 | il de FGF, e 3,66 ul de Heparina FBS-SFM: adicionar 0,5 ml de FBS <tafronteira vel = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Item </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 3,6 ml </td></tr></tbody></table> Matrigel Solução alíquota Matrigel deve ser colocado numa caixa de gelo e deixou-se descongelar lentamente ao longo de 4-5 horas de modo a formar um líquido viscoso antes de misturar com SFM. Isto irá assegurar a formação de uma camada lisa de substrato Matrigel. Se não for descongelado lentamente, o substrato resultante irá conter aglomerados de Matrigel, possivelmente impedindo a migração de células. <table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Volume ou massa </td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> 300 mg em 10 ml de DDQ 2 0 </td></tr><tr><td> SFM FBS inactivado pelo calor </td><td> 8 ml 2 ml </td></tr></tbody></table> MatrigelSolução Misture 8 ml de SFM com 2 ml de calor FBS inativado em um tubo falcon 15 cc. Mistura de agarose com 10 ml de DDQ 2 0 em um balão de Erlenmeyer, e de calor num forno de microondas durante 30 segundos em intervalos de 10 seg, assegurando para remover a solução a partir do forno de microondas depois de cada intervalo de 10 segundos e misturar completamente. Após a final microondas período de 10 seg, misture a solução de agarose com a SFM solução FBS / e armazenar em um banho de água 57 ° C. </td></tr></tbody></table>

um ensaio galvanotaxis para análise de precursores neurais cinética migração celular em um campo aplicado externamente corrente contínua elétrica

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

A descoberta de haste neural e células progenitoras (colectivamente denominadas células precursoras neurais) (NPCs) no cérebro de mamíferos adultos tem levado a um corpo da investigação sobre a utilização das propriedades multipotentes e proliferativa destas células para o desenvolvimento de estratégias neuroregenerative. Uma etapa essencial para o sucesso de tais estratégias é a mobilização de NPCs para um local da lesão após transplante exógena ou para aumentar a resposta dos precursores endógenos, que são encontradas na região periventricular do SNC. Assim, é essencial para compreender os mecanismos que promovem, orientar e melhorar a migração NPC. O nosso trabalho centra-se na utilização de corrente contínua de campos elétricos (dcEFs) para promover e migração NPC direta - um fenômeno conhecido como galvanotaxis. Endógenos fisiológicos campos elétricos funcionam como pistas fundamentais para a migração de células durante o desenvolvimento normal e da cicatrização. Perturbação farmacológica dotrans-neural potencial tubo em embriões axolotl provoca graves malformações do desenvolvimento 1. No contexto da cicatrização de feridas, a taxa de reparação de córnea ferida está directamente correlacionada com a magnitude do potencial epitelial que surge após a lesão, como mostrado pela melhoria farmacológica ou ruptura dessa dcEF 2-3. Nós demonstramos que o adulto NPCs subependimários sofrer rápida e dirigido migração catódica in vitro quando exposto a uma dcEF aplicado externamente. Neste protocolo, descrevemos nossas técnicas de laboratório para a criação de um ensaio galvanotaxis simples e eficaz para alta resolução, longo prazo de observação de translocação dirigido célula do corpo (migração) em um nível de uma única célula. Este ensaio seria adequado para investigar os mecanismos que regulam a transdução dcEF em motilidade celular através da utilização de ratinhos transgénicos ou knockout, curtas de ARN de interferência, ou agonistas / antagonistas de receptores específicos.

A análise cinemática revela que, na presença de um 250 dcEF mV / mm, NPCs indiferenciadas exibem galvanotaxis altamente dirigidos e rápida para o cátodo (Figura 5A, Movie 1). Na ausência de um dcEF, o movimento aleatório das células é observada (Figura 5B, Movie 2). Neste intensidade de campo,&gt; 98% de NPCs indiferenciadas migrar para o 6-8 hr inteiro para o qual são gravadas, e uma vez que as células mortas não migram isto sugere que eles permaneçam viáveis ​​durante este período, na...

Neste protocolo demonstramos como construir câmaras personalizados que permitem a aplicação de um campo elétrico de corrente contínua para permitir lapso de tempo de imagem do cérebro adulto derivado translocação de células neurais precursor durante galvanotaxis.

Um Ensaio Galvanotaxis para Análise de Precursores Neurais Cinética migração celular em um campo aplicado externamente Corrente Contínua Elétrica

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a migração de células precursoras neurais derivadas de adulto na presença de um campo elétrico contínuo. Isso é realizado primeiramente isolando e cultivando células precursoras neurais subependimárias do camundongo adulto. A próxima etapa consiste em preparar as câmaras Galvan Axxis e transferir as células precursoras neurais para dentro das câmaras.O passo final consiste em aplicar um campo elétrico de corrente contínua através da câmara Galvan Axxis e realizar a microscopia de imagem em intervalos para observar a migração dos precursores neurais. Em última análise, a microscopia de imagem em intervalos captura as propriedades galvanotáticas dos precursores neurais em seus estados diferenciado e indiferenciado. Embora este método possa fornecer informações sobre a galvanose dos precursores neurais, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como um modelo de acidente vascular cerebral em camundongo para o recrutamento de precursores neurais para locais de lesão, a fim de potencializar a reparação neural.Quem demonstrará o procedimento será Rob Pilley, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Ao iniciar este procedimento, as NPCs devem estar em cultura há sete dias, para que neuroesferas primárias livres em suspensão estejam prontas para serem colhidas. Quando necessário, comece a preparar três câmaras Galvan Axxis colocando três vidros quadrados.Primeiro, deixe lamínulas em um frasco com ácido clorídrico normal 6 durante a noite. Cedo no dia seguinte, monte o gel Matra para descongelar lentamente sobre gelo. Após quatro horas, ele estará pronto para uso na montagem da câmara.Primeiro, utilize um cortador de vidro com ponta de diamante para cortar seis tiras retangulares de vidro a partir de lâminas quadradas novas número um. Transfira as lâminas quadradas e as tiras retangulares previamente lavadas com ácido para uma cabine de fluxo laminar.Lave as tiras de vidro com etanol 70%, seguido por água estéril para cultura de tecidos. Deixe-as secar ao ar ou seque-as em papel sem fiapos. Em seguida, aplique graxa de vácuo ao redor da borda de uma das faces de cada lâmina de vidro quadrada e sela-as à base de plástico de 60 milímetros.Placas de Petri. Aplique graxa de vácuo em um lado das tiras de vidro retangulares e selle-as nas bordas opostas do quadrado. Lâminas de vidro para criar quadrados com uma canaleta central no centro de cada placa.Ultravioleta esterilize esses quadrados ou câmaras de vidro modificados por pelo menos 15 minutos em uma câmara de fluxo laminar. Em seguida, pipete de 250 a 300 microlitros de poliolisina na ranhura central das câmaras. Incube então as câmaras à temperatura ambiente por duas horas, aproximadamente 15 minutos antes do término da incubação.Após duas horas, prepare a solução de Matrigel, aspire a poliolisina e lave as ranhuras centrais com um mililitro de água autoclavada. Em seguida, pipete de 250 a 300 microlitros da solução de Matrigel nas ranhuras centrais e incube as câmaras a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, aspire a solução de Matrigel.Em seguida, lave suavemente os sulcos centrais com um a dois mililitros de SFM. Agora, pipete 100 microlitros de E-F-H-S-F-M ou F-B-S-S-F-M nos sulcos centrais, em preparação para as células cultivadas. A seguir, pipete quatro a cinco mililitros da cultura contendo neuroesferas em um novo recipiente de Petri de 60 milímetros.Em seguida, coloque a placa de Petri sobre a platina do microscópio de contagem sob a objetiva de cinco x. Utilize uma pipeta P 10 para transferir suavemente de cinco a oito neuroesferas inteiras para o sulco central de cada câmara. Até quatro.As neuroesferas podem ser transferidas imediatamente, mas não as dissocie enquanto estiverem nas calhas centrais. Espalhe-as cuidadosamente sem perturbar o substrato de Matrigel. Em seguida, adicione mais 150 microlitros de E-F-H-S-F-M ou F-B-S-S-F-M nas calhas centrais.Agora, cultive as células em um incubador umidificado. Após 17 a 20 horas em cultura, NPCs não diferenciados estarão disponíveis após 69 a 72 horas. Em cultura, NPCs diferenciados estarão disponíveis.Sob microscópio invertido, selecione a câmara com as melhores células para análise de migração por imagem de células vivas. As células devem ser arredondadas, quase completamente dissociadas de seus neuroesferas, e ainda não tiverem, ou apenas começado a formar prolongamentos em uma cabine de segurança. Prepare uma tampa para a câmara.Lave uma lamínula quadrada de vidro com etanol 70%, seguida de água autoclavada, e aplique uma fita de graxa de vácuo em duas bordas paralelas. Agora, cubra a câmara. Primeiro, aspire o meio de cultura do sulco central e, em seguida, sela rapidamente a lamínula sobre as paredes retangulares, como se fosse um telhado.Em seguida, utilizando ação capilar, carregue 100 microlitros de meio fresco no sulco central. Agora, use graxa de vácuo para criar bordas para poças de meio de cultura. Em cada extremidade do sulco central no sistema de imagem de células vivas, prepare tubos de gel de agarose, eletrodos de prata e cloreto de prata, e dois recipientes de Petri de 60 milímetros para uso.Como reservatórios de meio de cultura, deixe as câmaras em repouso no ambiente de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 20 a 30 minutos. Durante esse período, prepare as tampas de dois recipientes de Petri vazios e a tampa do recipiente de Petri das câmaras Galvan Axxis perfurando orifícios com uma Dremel ou pipeta de ferramenta, adicione 1,5 a dois mililitros de meio em cada lado do sulco central e acrescente sete a oito mililitros de SFM em cada recipiente de Petri vazio. Coloque um recipiente de Petri em cada lado do sulco central da câmara e insira um eletrodo em cada recipiente.Conecte a câmara aos recipientes de Petri para estabelecer a continuidade elétrica. Com as pontes de gel de Agros, conecte os eletrodos a uma fonte de alimentação externa com um medidor M em série para medir a corrente elétrica e ligue a fonte de alimentação. Use um voltímetro para medir a intensidade do campo elétrico diretamente ao longo do sulco central.Ajuste a saída da fonte de alimentação conforme necessário. Agora inicie o módulo de lapso de tempo no sistema de imagem. No software Axio Vision, selecione a aquisição multidimensional e clique em ver.Para os canais, selecione o canal seis e clique em T para o lapso de tempo. Defina as configurações de intervalo do lapso de tempo para um minuto e defina a duração para oito horas nos campos antes e depois do ponto de tempo, selecione o ponto de tempo anterior e posterior. Agora, clique em iniciar e deixe o experimento rodar pelo tempo desejado; após a conclusão do ensaio, prossiga com a análise de IHQ.A análise cinemática revelou que na presença de um DCEF de 250 milivolts por milímetro, NPCs indiferenciados exibem um rápido e altamente direcionado movimento galvanoaxial em direção ao cátodo; nesta intensidade de campo, mais de 98% dos NPCs indiferenciados migraram continuamente durante as seis a oito horas inteiras em que foram monitorados. Na ausência de DCEF, observou-se movimento aleatório das células.Como as células mortas não migram, isso sugere que elas permanecem viáveis durante esse período. Na ausência ou presença de A-D-C-E-F, os fenótipos diferenciados apresentaram migração desprezível, tanto na presença quanto na ausência de subconjuntos de células diferenciadas de A-D-C-E-F. Foram observados prolongamentos citoplasmáticos que tenderam a se alinhar perpendicularmente à direção do DCEF, mas nenhuma translocação visível do corpo celular foi observada.A imunomarcação confirmou que as NPCs mantiveram expressão positiva do marcador de precursor neural nestina após seis horas de exposição ao campo elétrico de corrente contínua. Nos ensaios envolvendo NPCs induzidas a se diferenciarem em fenótipos maduros, a maioria das células expressa a proteína ácida fibrilar glial, ou GFAP, marcador de astrócito maduro, após seis horas de exposição ao campo elétrico de corrente contínua. Após este procedimento, pode-se obter informações sobre os mecanismos celulares envolvidos na transdução do campo elétrico de corrente contínua em motilidade celular por meio de modelos genéticos de knockout.Ou senhor, um por exemplo.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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