Um Ensaio Galvanotaxis para Análise de Precursores Neurais Cinética migração celular em um campo aplicado externamente Corrente Contínua Elétrica

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a migração de células precursoras neurais derivadas de adultos na presença de um campo elétrico de corrente contínua. Isso é feito primeiro isolando e cultivando células precursoras neurais subependimárias do camundongo adulto. O próximo passo é preparar as câmaras Galvan Axxis e transferir as células precursoras neurais para as câmaras.

A etapa final é aplicar um campo elétrico de corrente contínua através da câmara Galvan Axxis e realizar imagens de lapso de tempo para observar a migração dos neuroprecursores. Em última análise, a microscopia de imagem com lapso de tempo captura as propriedades táticas de Galvan dos neuroprecursores em seus estados diferenciados e indiferenciados. Embora este método possa fornecer informações sobre o oásis de galvan da célula neuroprecursora, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como um modelo de acidente vascular cerebral de camundongo para o recrutamento de neuroprecursores para locais de lesão para melhorar o reparo neurológico.

Demonstrando o procedimento estará Rob Pilley Post, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Ao iniciar este procedimento, os NPCs devem estar em cultura por sete dias, para que as neuroesferas primárias flutuantes estejam prontas para a colheita. Quando necessário, comece a preparar três câmaras Galvan Axxis colocando três vidros quadrados.

Número um, lamínulas em uma garrafa de seis ácido clorídrico normal durante a noite. No início do dia seguinte, configure o gel matra para descongelar lentamente no gelo. Após quatro horas, estará pronto para ser usado na construção da câmara.

Primeiro, use um cortador de vidro com ponta de diamante para cortar seis tiras retangulares de vidro do novo quadrado. Número um, lamínulas. Transfira as tiras quadradas lavadas com ácido e as tiras retangulares para uma capela de fluxo laminar.

Lave as tiras de vidro com etanol a 70% seguido de água em autoclave para cultura de tecidos. Deixe-os secar ao ar ou seque-os em papel sem fiapos. Em seguida, aplique graxa a vácuo no perímetro de uma superfície de cada lâmina de vidro quadrada e sele-as na base de plástico de 60 milímetros.

Placas de Petri. Aplique graxa a vácuo em um lado das tiras de vidro retangulares e sele-as nas bordas opostas do quadrado. Lâminas de vidro para criar quadrados com uma calha central no centro de cada prato.

Esterilize esses quadrados ou câmaras de vidro modificados por pelo menos 15 minutos em um capuz. Em seguida, pipete 250 a 300 microlitros de poliol lisina na calha central das câmaras. Em seguida, incubar as câmaras à temperatura ambiente durante duas horas, cerca de 15 minutos antes do fim da incubação.

Prepare a solução matri gel após duas horas, aspire o poliol lisina e lave as calhas centrais com um mililitro de água da autoclave. Em seguida, pipete 250 a 300 microlitros de solução de gel Matri nas calhas centrais e incube as câmaras a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, aspirar a solução de matrigel.

Em seguida, lave suavemente as calhas centrais com um a dois mililitros de SFM. Agora pipete 100 microlitros de E-F-H-S-F-M ou F-B-S-S-F-M nas calhas centrais em preparação para as células cultivadas. Em seguida, pipete de quatro a cinco mililitros da neuroesfera contendo cultura em uma nova placa de Petri de 60 milímetros.

Em seguida, coloque a placa de Petri no palco do microscópio de contagem sob a objetiva de visualização de cinco x. Use uma pipeta P 10 para transferir suavemente cinco a oito neuroesferas inteiras para a calha central de cada câmara. Até quatro.

As neuroesferas podem ser transferidas de uma só vez, mas não as dissocie das neuroesferas nas calhas centrais. Espalhe-os cuidadosamente sem interromper o substrato do matrigel. Em seguida, adicione mais 150 microlitros de E-F-H-S-F-M ou F-B-S-S-F-M nas calhas centrais.

Agora cultura, as células em uma incubadora umidificada. Após 17 a 20 horas em cultura, NPCs indiferenciados estarão disponíveis após 69 a 72 horas. Em cultura, NPCs diferenciados estarão disponíveis.

No microscópio contábil, selecione a câmara com as melhores células para análise de migração de imagens de células vivas. As células devem ser redondas quase completamente dissociadas de suas neuroesferas e ainda não começaram, ou apenas começaram a formar processos em um capuz. Prepare uma tampa da câmara.

Lave uma lamínula de vidro quadrada com etanol 70%, depois com água autoclavada e aplique uma tira de graxa a vácuo em duas bordas paralelas. Agora cubra a câmara. Primeiro, aspire o meio de cultura da calha central e, em seguida, sele rapidamente a tampa, deslize nas paredes retangulares como um telhado.

Em seguida, usando ação capilar, carregue 100 microlitros de meio fresco na calha central. Agora use graxa a vácuo para criar bordas para pools de meios de cultura. Em cada extremidade da calha central no sistema de imagem de células vivas, preparamos tubos de gel agros, prata, eletrodos de cloreto de prata e duas placas de Petri de 60 milímetros para usar.

Como reservatórios de meios de cultura, deixe as câmaras descansarem dentro do ambiente de 37 graus Celsius 5% de dióxido de carbono por 20 a 30 minutos. Durante este tempo, prepare as tampas das duas placas de Petri vazias e a tampa da placa de Petri das câmaras Galvan Axxis fazendo furos nelas com uma Dremel ou pipeta de ferramentas, 1,5 a dois mililitros de mídia em cada lado da calha central e adicione sete a oito mililitros de SFM em cada placa de Petri vazia. Coloque uma placa de Petri em cada lado da calha central da câmara e coloque um eletrodo em cada placa.

Preencha a lacuna entre a câmara e as placas de Petri para estabelecer a continuidade elétrica. Com as pontes de gel Agros, conecte os eletrodos a uma fonte de alimentação externa com um medidor M em série para medir a corrente elétrica e ligar a fonte de alimentação. Use um volímetro para medir a força do campo elétrico diretamente na calha central.

Ajuste a saída da fonte de alimentação conforme necessário. Agora inicie o módulo de lapso de tempo no sistema de imagem. No software de visão Axio, selecione aquisição multidimensional e clique em ver.

Para canais, selecione o canal seis, clique em T para lapso de tempo. Defina as configurações do intervalo de lapso de tempo para um minuto, defina a duração para oito horas nas configurações antes, depois dos campos de ponto de tempo, selecione o ponto de tempo antes e depois. Agora clique em iniciar e permita que o experimento seja executado pelo período de tempo desejado após a conclusão do ensaio, prossiga com a análise IHC.

A análise cinemática revelou que, na presença de um DCEF de 250 milivolts por milímetro, os NPCs indiferenciados exibem um axxis galvan altamente direcionado e rápido em direção ao cátodo nesta intensidade de campo, mais de 98% dos NPCs indiferenciados migraram por seis a oito horas inteiras para as quais foram fotografados. Na ausência de A-D-C-E-F. Observou-se movimento aleatório das células.

Como as células mortas não migram, isso sugere que elas permanecem viáveis durante esse período. Na ausência ou presença de A-D-C-E-F, os fenótipos diferenciados sofreram migração insignificante, tanto na presença quanto na ausência de subconjuntos A-D-C-E-F de células diferenciadas. Processos estendidos que tendiam a se alinhar perpendicularmente à direção do DCEF, mas nenhuma translocação perceptível do corpo celular foi observada.

A imunocoloração verificou que os NPCs mantiveram a expressão positiva do marcador precursor neural após seis horas de exposição à DC EF. Nos ensaios envolvendo NPCs induzidos a se diferenciar em fenótipos maduros, a maioria das células expressa o marcador de astrócitos maduros proteína ácida fibrilar glial ou GFAP após seis horas de exposição ao DCEF. Seguindo este procedimento, pode-se adquirir insights sobre os mecanismos celulares envolvidos na transdução do campo elétrico de corrente contínua em motilidade celular usando modelos de nocaute genético.

Ou senhor, um por exemplo.