Electricidade-Free, Ácido Nucleico seqüencial e isolamento de proteínas

O objetivo geral deste procedimento é isolar ácidos nucleicos prontos para PCR e proteínas imunorreativas a partir de uma amostra, sem necessidade de eletricidade ou infraestrutura laboratorial. O isolamento de ácidos nucleicos em proteínas começa com a mistura da amostra com guanidina e tiocianato para lisar a amostra e passar a mistura sobre o sorvente na pipeta de extração. Após a quinta e última passagem sobre o sorvente, transfira a mistura para o tampão de extração de proteínas e reserve para o isolamento da proteína imunorreativa.

Em seguida, o sorvente e os ácidos nucleicos ligados são lavados passando-se etanol a 95% sobre o sorvente. Diversas vezes, o sorvente e os ácidos nucleicos ligados são então secos passando-se ar ambiente sobre o sorvente por cinco minutos. O passo final para o isolamento de ácidos nucleicos prontos para PCR é eluir os ácidos nucleicos do sorvente utilizando 250 microlitros de tris ou outra solução aquosa semelhante para o isolamento da proteína imunorreativa.

Após misturar a amostra e o tampão de extração de proteínas, utilize uma segunda pipeta de extração e passe a mistura sobre o sorvente 15 vezes. O próximo passo é lavar o sorvente com proteína ligada, passando etanol a 95% sobre o sorvente várias vezes. Em seguida, o sorvente e a proteína ligada são secos ao passar ar ambiente sobre o sorvente por cinco minutos.

O passo final do protocolo é eluir a proteína do sorvente. Em última análise, a pipeta de extração utilizada neste procedimento permite o isolamento, sem eletricidade, de ácidos nucleicos prontos para PCR e proteínas imunorreativas. Olá, meu nome é Dave Pawlowski.

Sou cientista sênior de pesquisa na Kubrick Incorporated, em Buffalo, Nova York, e hoje aprenderemos uma técnica que permite isolar simultaneamente proteínas e ácidos nucleicos em sequência, sem a necessidade de centrífuga, vórtex ou qualquer outro equipamento laboratorial adicional. Antes da lise da amostra, certifique-se de que as amostras estejam na forma líquida. Se a amostra for sólida, por exemplo, alimento ou fezes, ela deve ser suspensa em um meio líquido, como água ou solução salina tamponada com fosfato.

Misture 500 microlitros da amostra com 500 microlitros de tiocianato de guanidina seis molar em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, pressione a pera de uma pipeta de extração, expulsando o ar ambiente. Puxe toda a amostra de um mililitro para dentro da pipeta de extração, acima do material absorvente, permitindo que a pera se expanda lentamente.

Inverta a ferramenta de extração de modo que as microesferas de sorvente e a amostra escorram para a lâmpula. Triture as microesferas de sorvente com a amostra dentro da lâmpula, tomando cuidado para não expelir a amostra para fora da pipeta de extração.

Inverta a pipeta de extração e expulse a amostra no tubo original de 1,5 mililitro. Aspire toda a amostra de um mililitro para dentro da pipeta de extração, passando pelo sorvente a uma velocidade moderada. Tendo o cuidado de manter o sorvente no pescoço da pipeta de extração, expulse toda a amostra no tubo de 1,5 mililitro ao comprimir a bolha.

Repita este processo, passando a amostra sobre o sorvente mais quatro vezes, perfazendo um total de cinco passagens. Após a quinta passagem sobre o sorvente, expulse toda a amostra de um mililitro em quatro mililitros do tampão de extração de proteínas em um tubo cônico de 15 mililitros. Misture o tubo por inversão, feche-o e reserve para uso posterior.

Lave os ácidos nucleicos isolados passando um mililitro de etanol a 95% sobre o sorvente três vezes, retornando o etanol ao seu tubo original. Após a passagem final, repita a lavagem três vezes usando um segundo mililitro de etanol a 95%. O próximo passo do procedimento é secar o sorvente, pois a recuperação de ácidos nucleicos é melhor quando o sorvente está seco.

Sei que esta etapa é tediosa. No entanto, se você concluir esta etapa no período recomendado, seus resultados serão melhores. Pressione e solte a lâmpada por cinco minutos.

Passar ar ambiente por toda a pipeta de extração para secar os ácidos nucleicos e o leito sorvente; remova o etanol residual da ponta da pipeta de extração. Usando um lenço de papel Kim, recupere os ácidos nucleicos passando 250 microlitros de triss 10 milimolar sobre o sorvente cinco vezes. O tampão triss pode ser substituído por qualquer outra solução aquosa adequada, como PBS.

A solução resultante contém os ácidos nucleicos extraídos para realizar a extração de proteínas primeiro, misture a amostra no tampão de extração de proteínas que foi previamente reservado invertendo o tubo, transfira aproximadamente dois a três mililitros dessa amostra de cinco mililitros para o sorvente de uma nova extração. Pipete e expulse toda a amostra no mesmo tubo cônico de 15 mililitros. Tendo o cuidado de manter o sorvente no pescoço da pipeta de extração.

Repita este processo, passando a amostra sobre o sorvente 15 vezes. Lave o sorvente e a proteína ligada passando um mililitro de etanol 95% sobre o leito do sorvente três vezes, ejetando o etanol no tubo original; lave mais três vezes usando um segundo mililitro de etanol 95%.

O próximo passo do procedimento é secar novamente o sorvente. Assim como com ácidos nucleicos, a recuperação de proteínas é melhor realizada quando o sorvente está seco. Por um período de tempo mais longo.

Pressione e solte a lâmpada durante cinco minutos, fazendo passar ar ambiente por toda a pipeta de extração. Para secar o leito do sorvente proteico, limpe o etanol residual da ponta da pipeta de extração. Usando um lenço de papel Kim, recupere a proteína fazendo passar 250 microlitros de PBS sobre o sorvente cinco vezes.

O tampão PBS pode ser substituído por qualquer outra solução aquosa adequada, como tris 10 milimolar, pH 6,8. A solução resultante contém o teor proteico da amostra. Os genes da toxina shiga associados à cepa de Escherichia coli enterohemorrágica O157:H7 E. coli EDL 933 foram amplificados a partir de um procedimento de extração de ácido nucleico e proteína utilizando a pipeta de extração.

Os genes da toxina Shiga, toxina Shiga um e toxina Shiga dois, estão localizados em fagos bacterianos latentes semelhantes ao fago lambda e em fagos bacterianos defeituosos, sob controle do promotor PR. A ativação da resposta SOS em *E. coli* leva à indução do profago e/ou à produção de toxina. Neste caso, ocorre um grande aumento na amplificação do gene da toxina Shiga dois quando a resposta SOS é induzida por mitomicina C, em comparação com o controle não tratado.

Isso sugere indução de profago e replicação do genoma fágico. A proteína recuperada dos experimentos de isolamento de proteína de ácidos nucleicos descritos no vídeo é imunorreativa. A fração proteica isolada foi aplicada em tiras de ensaio imunocromatográfico rápido para E. coli O157.

Os controles mostram uma identificação positiva em todas as amostras que contêm E. coli O157 com ou sem indução da toxina Shiga, conforme visualizado pela presença de duas faixas vermelhas. Os dados também mostram resultados positivos para aquelas amostras que contêm E. coli O157 e que foram processadas para ácidos nucleicos e proteínas utilizando a pipeta de extração. Esses dados indicam que a proteína isolada de cada amostra é imunorreativa, desencadeando, assim, uma resposta positiva.

A proteína isolada é adequada para eletroforese, conforme mostrado aqui em um gel de acrilamida a 8% corado com kumasi, carregado com BSA isolada do isotiocianato de gudina seis molar. Utilizando a extração, pipetagem e protocolo associado, a mobilidade eletroforética da proteína isolada é idêntica à das amostras controle. Após dominar a técnica, é possível realizá-la em menos de 20 minutos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão clara de como isolar proteínas e ácidos nucleicos a partir do dispositivo simples. Obrigado por dedicar seu tempo para assistir ao nosso vídeo.