Name: Facilitar Drug Discovery: um ensaio automatizado de alta Inflamação conteúdo em Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprenda a realizar triagem fenotípica automatizada de compostos imunomoduladores em larvas de zebrafish usando ensaio de inflamação induzida por sulfato de cobre. Este método permite análise de alto rendimento em imunologia.

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<p class="jove_content"&gt; Agradecemos Nadeshda Wolf, Nadine Eschen e Susanne Delong para a pecuária excelente. CW foi apoiado por uma bolsa de doutorado do programa de Helmholtz &#39;<em&gt; Biointerfaces</em&gt; Internacional de pós-graduação da escola &quot;(BIFIGS). Apoio adicional foi fornecido por uma concessão KIT-RISC e por Marie Curie Internacional Reintegração Grant dentro do 7 º Programa-Quadro da Comunidade Europeia (PIRG07-GA-2010-267552) para CG. AHS foi apoiada por BOLD (Biologia do Fígado e pâncreas e Desenvolvimento de Doenças) - Marie Curie Rede de Formação Inicial (238.821). UL foi apoiada por Dopaminet FP7 (Seventh Framework Program) (223.744).</p&gt;

1. Manejo dos animais Para o queixo ensaio utilização larvas dpf 3 resultantes de cruzamentos do grupo entre homozigotos duplo transgênico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 e peixe AB (tipo selvagem). Recolher embriões por desova natural e levantá-los a 29 ° C em meio E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO4, e de metileno 0,1% de azul, equilibrada a pH 7,0) em placas de Petri. É essencial para manter uma densidade de embriões não superiores a 50-70 por placa. 2. Classificação Larva Confira todas as larvas sob um estereoscópio de fluorescência para a expressão repórter fluorescente, inflamação espontânea e desenvolvimento adequadas à idade relacionados. 3. Preparação Triagem Médio (Sempre preparar fresco) Preparar meio E3 sem azul de metileno suplementado com DMSO (1% final) e MS222 (0,05 g / l). 4. CuSO4Preparação (Sempre preparar fresco) Primeiro pesar CuSO4 (M r = 159,6 g / mol) e preparar uma solução-mãe 20 mM em dH2O Preparar 120 uM CuSO Solução de trabalho de 4 (a partir de 20 mM de solução stock) em E3/DMSO (1%) / MS-222. Proteja CuSO 4 solução da luz. 5. 384-bem Preparação Plate (Greiner 384 Bem Microplaca) Pré-adicionar 20 ul de E3/DMSO (1%) / MS-222 a cada poço com uma pipeta inversa. Um aumento da pipeta furo é necessário para lidar com os embriões cuidadosamente sem infligir qualquer ferimento, o que é feito cortando a ponta de um furo de 2 mm. Transferir larva único em 74 uL de meio a cada poço (84 uL para o controlo não tratado). Se necessário, orientar as larvas em posição lateral no interior da cavidade utilizando um flexível Eppendorf Microloader pipeta (Eppendorf; 5242 956,003). Conduz todos os passos seguintes para manipulação de líquidos com um líquido robômanuseamento da estação de trabalho para assegurar o tratamento simultâneo de todas as larvas. 6. Tratamento de Drogas Misture compostos em chapa estoque de drogas 5 vezes por pipetagem cima e para baixo. Adicionar 16 ul de estoque de chapa 7.5x droga a cada poço e misturar 5 vezes. Ajuste a posição da ponta dentro dos poços para evitar lesões de larvas e dispensar o médio de 10 s / ul. Misturar médio em poços 4 vezes para assegurar uma distribuição homogénea do fármaco no interior do poço. 7. Incubação Incubar placa de rastreio durante 1 h à 29 ° C coberto com folha de alumínio para proteger compostos, bem como CuSO 4 a partir de luz. 8. Ferir Química Adicionar 10 ul de 120 mM CuSO4 solução de trabalho para cada poço, excepto para controlos negativos, mistura de 4 vezes e incubar novamente durante 1 h em 29 ° C. 9. Lavagem Retire e trocar 80 ul de mim<html> sódio de cada poço duas vezes (em passos de 20 ul) para remover compostos, bem como CuSO4. 10. Aquisição de Imagem Iniciar a aquisição da imagem em um microscópio invertido automatizado (isto é: Olympus digitalização ^ r) 90 minutos após o tratamento de cobre inicial. Definir inicial z nível para que neuromasts de direita e esquerda da linha lateral posterior são visíveis. Imagem cada poço uma vez por hora no brightfield canais, Cy3 e GFP em 4 planos focais (50 distância mm) usando uma objetiva de 4x (NA = 0,13). Informações adicionais sobre a imagem e processamento de dados estão disponíveis mediante solicitação. 11. Processamento de Imagem 1. Dados de classificação Imagens brutas são processados ​​com nosso script personalizado software LabView. A primeira operação no pipeline de processamento de imagem é a classificação de imagens brutas do microscópio pasta de dados gerado pelo bem do canal, e tempo-informação. ove_step &quot;&gt; 2 foco. prolongado Subsequentemente, o software cria imagens de foco estendidos a partir de 4 planos de contacto para cada um dos canais. 3. RGB-overlay Em uma última etapa as imagens desfocadas estendidos a partir dos 3 canais são combinadas para resultar em uma imagem RGB-sobreposição final. 4. Detecção automática neuromasto Uma ferramenta de reconhecimento de padrões (LabView rápida IA ​​ferramenta de prototipagem) identifica neuromasts dentro das imagens de sobreposição RGB e cria uma área empiricamente definida de interesse em torno dos neuromasts. 5. Quantificação Dentro da área empiricamente definido de interesse em torno neuromasts lesionados vermelhas leucócitos fluorescentes (reflectido como pixels vermelhos) são pontuados resultando em uma leitura primária de p ercent um ó rea ccupied por eukocytes l (PAOL). Em média 95,27 ± 2,11% (FDA1) e 95,12 ±1,56% (FDA2) de poços (larvas) foram detectados de forma adequada e foram subsequentemente submetidos a processamento de dados adicional. A saída de dados brutos (PAOL para cada neuromasto detectado) é armazenado em um arquivo txt e serve como entrada de dados para os scripts do MATLAB que processam os dados brutos mais. 12. Informática 1. Imaps Avaliar o sucesso de experiências individuais através da visualização gráfica da PAOL-prima de dados de saída em um código de cor pode ser realizado com os mapas chamados inflamação (imaps) (Figura 2). Verde brilhante reflete um índice inicial de alta inflamatória; preta indica que não há inflamação. Esta visão rápida permite a identificação rápida de experiências com falha, que pode então ser excluídos da análise de dados complementares. 2. Média de controles Cada placa experimental contém 320 compostos refletindo umadados de ponto único por composto eo tempo de ponto, bem como 32 controlos positivos e negativos, respectivamente. O controle de 32 repetições são média e desvio padrão é calculado. Para os controlos apenas os pontos de dados dentro de 2 desvios padrão estão incluídos. 3. Normalização A normalização é feita por análise de planilhas. O valor médio de DMSO, sendo o controlo negativo, é definido como 0 e os mais altos PAOL calculada a média para o controlo de cobre é definido como 1, de modo que a diferença máxima entre o controlo positivo e negativo é definido como 1. PAOL cada composto é linearmente interpolados ou extrapolados para os controlos respectivos na placa experimental. 4. Final ler-out: índice Inflamatória Depois de experiências duplicadas suficiente (ou seja 15) foram realizados, normalizados dados brutos de experiências duplicadas são em média, resultando em uma final ler-out - o inflamatóriaíndice. O índice de inflamatória inicial do controle de cobre começa a 100% para o tempo de ponto zero e correlaciona-se para a imagem de tempo de início de aquisição (90 minutos após o tratamento de cobre inicial). 5. Montagem de regressão exponencial Monotonic Devido à resolução da inflamação ao longo do tempo realizamos um ajuste de regressão monotônica exponencial não-linear para a inflamação inicial usando <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="Equação 1" /> - Um 0 é uma medida para a resposta inicial em t = 0, um 1 está relacionada com a inclinação da magnitude ao longo do tempo. 6. 2-D trama espaço de características (Figura 4) Para gerar o espaço de características, uma regressão não-linear e é aplicado um cluster de análise-divide o espaço de características em regiões característicos, permitindo assim que identificação automática de candidatos interessantes de diferentes modulatórios-imune categorias (anti-inflammatteoria, anti-resolução, pró-inflamatória, de resolução de pro). Todos os compostos são apresentados no gráfico 2-D com base nos parâmetros de um 0 e um 1. 13. Manuseio e Armazenamento de Dados Nossos dados manipulação rotinas criar páginas web para visualização e representam as telas de drogas tais fornecendo uma visão rápida da imagem e processamento de dados dos resultados passos, bem como uma visão detalhada, quando solicitada pelo usuário 10. Soft links para outros bancos de dados heterogêneos relevantes biológicas e químicas são integrados, assim como para fornecer um recurso valioso para estudos comparativos e romance 11. Por essas rotinas, normas adequadas de dados e metainformação são definidas para armazenamento a longo prazo destes dados. 14. Os resultados representativos Em uma tela de piloto analisamos uma biblioteca composta de 640 aprovados pela FDA conhecidos compostos bioativos para efeitos na progressão da iniciação, ou resolução de um granulresposta inflamatória ocytic. Com base nos efeitos observados nos classificados 4 tipos de fenótipos moduladores do sistema imunológico que podem ser indicativos de diferentes modos de ação: anti-inflamatórios (1), a resolução anti-(2), pro-inflamatória (3) e pró-resolução (4) , que pode ser descrito com os parâmetros um 0 e um 1, que surgem a partir de um encaixe de regressão não-linear monotónica (e AO + alx -) para a inflamação inicial. A 0 representa a magnitude da resposta inflamatória ao passo que um 1 caracteriza o declive da curva e, assim, descreve resolução da inflamação. Mostrar todos os compostos num lote espaço 2-D característica (um 1 vs um 0) permite a identificação automática de candidatos atingidos a partir das diferentes categorias modulatórios imunes (Figura 3). 45 para fora de 640 compostos exerceu efeito anti-inflamatória significativa através da redução do índice de inflamatória inicial a 50% ou menos. Dentro this categoria encontramos 6 compostos pertencentes à classe farmacológica de não-esteróides anti-inflamatórios não esteróides), confirmando a validade da nossa abordagem. No entanto, os AINE não classificado entre os mais potentes anti-inflamatórios. Além dos AINEs encontramos várias classes de drogas farmacológicas adicionais como, por exemplo, os bloqueadores do receptor da angiotensina (BRA), antibióticos e inibidores da bomba de protões. 7 compostos preencheram os critérios de limite empiricamente definidos para potenciais pró-resolução drogas. 18 medicamentos exerceu um efeito pró-inflamatória, resultando em recrutamento de leucócitos exagerada a neuromasts feridos em comparação com os controlos positivos. Apenas 2 compostos impediu a resolução atempada da resposta inflamatória. O efeito anti-inflamatório de candidatos vários hit (candidatos exemplares acima mencionados a partir de classes de drogas farmacológicas) a partir do ecrã coul pilotod ser confirmado, de maneira dose-dependente em subsequentes ensaios Chin secundárias (dados não mostrados). Novo teste de 4 potenciais pró-drogas resolução não confirmar o modo de ação indicada como exercida na tela principal. 2 dos fármacos tinham um potencial anti-inflamatório ligeiro em concentrações mais elevadas (20 mM). Uma terceira droga exibiu um marginal não-dose-dependente efeito anti-inflamatório em concentrações que variam de drogas 5-20 uM. O quarto fármaco não teve nenhum efeito sobre a resposta inflamatória com as concentrações testadas. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxo de Trabalho do ensaio Chin. Individual composto transgênico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larvas (3 dpf) são manualmente distribuídas em placas de microtitulação 384-bem. Drogas são adicionados simultaneamente a cada cavidade utilizando um Zephyr Workstation Handling Compact líquido. Placas de ensaio são então incubadas durante 1 h em 29 ° C. O tratamento com CuSO 4 </sub&gt; - Solução (10 mM de concentração final) durante 1 h inflige o ferimento e inicia uma resposta inflamatória aguda. Finalmente, a solução de cobre e as drogas são lavadas e de aquisição de imagem automatizado é iniciado (90 minutos após o tratamento de cobre inicial). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> Figura 2. . Resumo imagem de imagens brutas A figura mostra imagens brutas de 4 planos focais (Z = 0 - 3) a distâncias de 50 um dos canais Cy3 (esquerda) e GFP (direita), respectivamente. Setas (Z = 1,2) indicam neuromasts exemplares, pontas de seta (Z = 1,2) apontam para cerca de leucócitos cluster neuromasts. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> Figura 3. Mapas inflamação (IMAPS) O sucesso das experiências individuais podem ser avaliados em imaps refletindo a resposta inflamatória (dados brutos) em um código de cores: verde brilhante. Reflete uma inflação alta inicial<html> resposta mmatory; preta indica que não há inflamação imaps no instante 0 (esquerda) e tempo-5 (à direita) mostram claramente se um experimento devem ser incluídos no tratamento dos dados.. Controles de cobre (linha 13 e 24) aparecem em vários tons de verde, enquanto DMSO poços de controlo (linha 1 e 12) aparecem em verde escuro ou preto. Em tempo de ponto-5, a inflamação é quase resolvido nos controles de cobre, agora indicado em tons escuros de verde ou preto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> Figura 4. 2-D trajetória no espaço de recurso de 320 compostos de um FDA aprovou biblioteca e seus respectivos controles. Todos os poços compostos podem ser exibidos em uma trama espaço 2-D característica com base nos parâmetros de um 0 e um 1, que surgem a partir de um não-linear montagem de regressão (d/4203/4203eq1.jpg &quot;alt =&quot; Equação 1 &quot;/&gt;) para a inflamação inicial. Este lote espaço recurso permite a identificação automática de candidatos interessantes que pertencem a uma das seguintes 4 modulatórios-imune categorias que podem ser indicativos das drogas &quot;modo de ação:. anti-inflamatório (1), anti-resolução (2), pro-inflamatória (3) e pró-resolução (4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

<ol><li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li>
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<li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li>
<li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciencenet%27+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li>
<li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvester%27%3A+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<p class="jove_content"&gt; Aqui nós apresentamos uma estratégia de rastreamento totalmente automatizado de alto rendimento que permite a identificação de moduladores-imune compostos em um contexto animal inteiro. Monitorização permitindo assim de uma resposta inflamatória aguda<em&gt; In vivo</em&gt; E em tempo real.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nós fornecemos um protocolo para aplicar zebrafish como um organismo modelo valioso para a descoberta de medicamentos ou drogas esforços reaproveitamento, uma vez que os efeitos da droga sobre o recrutamento de leucócitos para feridas podem ser estudadas com relativa facilidade no contexto de um totalmente funcional sistema imune inato. A única vantagem de nossa abordagem é o fato de que ferindo química torna a manipulação larvas obsoleta do manual, permitindo a automação e rastreamento em um formato de alto rendimento.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Além disso, efeitos adversos ou tóxicos, bem como fortes fora do alvo os efeitos podem ser facilmente avaliada com a proposta de set-up. A FDA biblioteca aprovado no entanto, não contêm quaisquer compostos tóxicos nas concentrações de rastreio dadas. No entanto, nós propomos para compostos tóxicos aparentes para comparar o conjunto de dados disponíveis (fenótipo modulatório imunitário, por exemplo, a concentração de droga) entre os membros da presente classe farmacológica mesma substância na biblioteca testado. Membros tóxicos de uma família de substâncias, que de outra forma exerce um fenótipo modulatório promissora imune, pode ser novamente testados em concentrações mais baixas, se for necessário.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nós demonstramos a possibilidade de drogas categorizar automaticamente de acordo com a sua exerceu efeito modulatório-imune. Drogas pertencentes à categoria de compostos anti-inflamatórios podem ser validados em experiências independentes, a maioria dos compostos exercem o seu efeito de uma forma dependente da dose. Quatro compostos identificados como potenciais pró-drogas resolução poderia, assim, não muito longe ser confirmado como tal. Também indica que esta categoria especial modulatório imune é difícil de descrever, uma vez que nenhuma droga que afectam apenas resolução foram até agora descritos na literatura. No entanto, 3 das 4 drogas reanalisada mostrou uma tendência anti-inflamatório nas maiores concentrações molares. Otimizando os critérios de limite empiricamente definidos devem ajudar a reduzir o número de falsos-positivos.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Além disso, a técnica apresentada oferece a possibilidade de ser utilizado para a identificação de mutações em genes que afectam o comportamento migratório de leucócitos<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Concluindo, o método proposto pode facilitar e acelerar a descoberta de medicamentos ou drogas redirecionando esforços produzindo potenciais estruturas de chumbo com novas informações disponíveis sobre tolerância à droga, toxicidade, dosagem, bem como potenciais efeitos fora do alvo. Portanto, servindo como uma estratégia simples, de custo e economia de tempo nas fases iniciais do desenvolvimento da droga.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> Cobre (II) de sulfato de anidro </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> Aprovado pela FDA biblioteca de droga </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 microplaca não-vinculativo, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781906 </td><td> preto </td></tr><tr><td> Olympus varredura ^ R </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zephyr Workstation Handling Compact Líquido </td><td> Caliper </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitar drug discovery: um ensaio automatizado de alta inflamação conteúdo em zebrafish

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Larvas Zebrafish são particularmente sensíveis ao animal como um todo pequena molécula 1,2 telas devido ao seu pequeno tamanho e relativa facilidade de manipulação e de observação, bem como o facto de que os compostos podem ser simplesmente adicionados à água de banho e são facilmente absorvidos quando administrados em uma &lt;1% de solução de DMSO. Devido à claridade óptica de larvas do peixe-zebra e da disponibilidade de linhas transgénicas que expressam proteínas fluorescentes em leucócitos, peixe-zebra oferecem a vantagem única de monitorização uma resposta inflamatória aguda in vivo. Por conseguinte, utilizando o peixe-zebra de alta conteúdo telas de moléculas pequenas destinadas à identificação de moduladores-imune compostos com alta taxa de transferência tem sido proposto 3-6, sugerindo cenários indução da inflamação, por exemplo, entalhes localizadas no tecido fin, danos de laser dirigido para a superfície de gema de 7 embriões ou tailfin amputação 3,5,6. A principal desvantagem destes métodos, porém, foio requisito de manipulação manual do larva para induzir ferimento, impedindo assim a seleção de alto rendimento. Introdução da inflamação induzida quimicamente (queixo) ensaio 8 eliminou esses obstáculos. Uma vez que ferimento é infligida quimicamente o número de embriões que podem ser tratadas simultaneamente é virtualmente ilimitada. Tratamento temporário de larvas do peixe com sulfato de cobre seletivamente induz a morte celular nas células ciliadas do sistema de linha lateral e os resultados no recrutamento de granulócitos rápida para neuromasts feridos. A resposta inflamatória pode ser seguido em tempo real, utilizando o composto transgénico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larvas do peixe 6,9 que expressam uma proteína verde fluorescente em células neuromastos, bem como um vermelho granulócitos marcação fluorescente da proteína. A fim de elaborar uma estratégia de rastreamento que permita ambas as análises de conteúdo de alta e de alto rendimento, introduzimos manipulação de líquidos robótica e micr automatizada combinadaoscopy com um script personalizado software desenvolvido. Este script permite a quantificação automática da resposta inflamatória, marcando a área ocupada por cento fluorescentes vermelhas leucócitos dentro de uma área definida empiricamente em torno feridos verdes neuromasts fluorescentes. Além disso, o processamento automatizado de dados, manipulação, visualização e armazenamento de todas baseadas no costume desenvolvido MATLAB e scripts Python. Em resumo, introduzimos uma tela HC / HT automatizado que permite o teste de compostos químicos para o seu efeito sobre a progressão da iniciação, ou a resolução de uma resposta inflamatória granulocítica. Este protocolo serve um bom ponto de partida para mais análises aprofundadas de mecanismos de drogas e vias envolvidas na orquestração de uma resposta imune inata. No futuro, pode ajudar a identificar os efeitos tóxicos intoleráveis ​​ou meta-off em fases anteriores da descoberta da droga e, assim, reduzir riscos e custos processuais para o desenvolvimento de drogas.

Aqui nós descrevemos um romance de alto teor de ensaio inflamação induzido quimicamente visando a identificação de moduladores-imune bioativos. Temos sucesso combinado microscopia automatizada com scripts personalizados de software desenvolvidos permitindo a quantificação automática da resposta inflamatória, bem como processamento de dados ainda mais, a análise, mineração e de armazenamento.

Facilitar Drug Discovery: um ensaio automatizado de alta Inflamação conteúdo em Zebrafish

As larvas de zebrafish são particularmente adequadas para triagens de pequenas moléculas em animais inteiros1,2 devido ao seu pequeno tamanho e à relativa facilidade de manipulação e ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma triagem fenotípica para identificar a atividade imunomoduladora de compostos utilizando um ensaio de inflamação em peixe-zebra in vivo. Isso é realizado primeiramente distribuindo larvas de peixe-zebra em uma placa de 384 poços. Em seguida, os compostos a serem testados são adicionados às larvas para permitir a penetração tecidual.Então, uma solução de sulfato de cobre é adicionada para induzir dano específico no tecido. Por fim, os compostos e o sulfato de cobre são substituídos por meio fresco. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram o grau de influxo de leucócitos específico ao tecido ao longo do tempo, por meio da análise de dados de microscopia em tempo real in vivo.A principal vantagem desta técnica é que ela permite a indução simultânea de inflamação em centenas de indivíduos e, assim, viabiliza a automação experimental e analítica. Demonstrará o procedimento Christina Whitman, estudante de doutorado do meu laboratório, para o ensaio de chin. Realize cruzamentos em grupo entre peixes duplo transgênicos homozigotos e peixes selvagens da linhagem AB, colete os embriões por desova natural e mantenha 50 a 70 por placa em meio E3, a 29 graus Celsius, até três dias após a fertilização.Verifique todas as larvas sob um estereoscópio fluorescente quanto à expressão do marcador fluorescente, inflamação espontânea e desenvolvimento apropriado relacionado à idade. Após preparar o meio de triagem e adicionar 20 microlitros aos poços de uma placa de 384 poços, transfira uma larva anestesiada individualmente em 74 microlitros de meio para cada poço. Utilize uma ponta de pipeta com o orifício cortado para um diâmetro de dois milímetros, com uma ponta de micropipeta flexível.Oriente a larva em posição lateral dentro do poço. Realize todos os passos subsequentes de manipulação de líquidos com uma estação de trabalho robótica de manipulação de líquidos para garantir o tratamento simultâneo de todas as larvas para o tratamento com fármaco. Pipete para cima e para baixo cinco vezes para misturar os compostos em uma placa de estoque de fármaco. Adicione 16 microlitros da placa de estoque de fármaco 7,5 x à placa de triagem e misture cinco vezes a 10 microlitros por segundo.Cubra a placa de triagem com papel de alumínio e incube-a por uma hora a 29 graus Celsius. Para induzir ferimento químico. Adicione 10 microlitros de solução de trabalho de sulfato de cobre 120 micromolar a cada uma.Retire bem os controles negativos, misture quatro vezes e incube novamente por uma hora a 29 graus Celsius. Lave os embriões removendo e trocando 80 microlitros de meio de cada poço duas vezes, iniciando após 90 minutos. Após o tratamento inicial com cobre, adquira imagens em um microscópio invertido automatizado utilizando uma objetiva Forex.Defina o nível Z inicial de modo que a massa neural das linhas laterais posteriores direita e esquerda seja visível e capture uma imagem de cada poço a cada hora. Utilize os canais Brightfield lado três e GFP em quatro planos focais. O software de visualização personalizado do laboratório cria imagens com foco expandido a partir dos quatro planos focais para cada um dos canais.As imagens são então mescladas para criar uma imagem final sobreposta em RGB. Uma ferramenta de reconhecimento de padrões identifica neuromas dentro das imagens sobrepostas em RGB e cria uma área de interesse definida empiricamente ao redor dos neuromas; os leucócitos fluorescentes vermelhos que envolvem os neuromas lesionados são quantificados, resultando em uma leitura primária representada pela porcentagem da área ocupada pelos leucócitos ou palidez. Em média, 95% das larvas são detectadas corretamente e podem subsequentemente ser submetidas a processamento adicional de dados.O sucesso dos experimentos individuais é avaliado utilizando mapas de inflamação ou mapas oculares. Os dados pálidos são codificados por cores com verde brilhante, representando um alto índice inflamatório inicial, e o preto indica ausência de inflamação. Essa visão geral rápida permite a identificação imediata de experimentos falhos, os quais podem então ser excluídos da análise adicional de dados.iMaps nos tempos 0,0 e 0,5 mostram claramente se um experimento deve ser incluído no processamento adicional dos dados. Os controles de cobre aparecem em diferentes tons de verde, enquanto as amostras controle de DMSO aparecem em verde escuro ou preto no tempo 0,5. A inflamação está quase totalmente resolvida nos controles de cobre, agora indicada em tons escuros de verde ou preto, para processar os controles.Os 32 replicados de controle são médias e o desvio padrão é calculado. Apenas pontos de dados dentro de dois desvios padrão são incluídos. O valor médio do controle negativo DMSO é definido como zero e o valor médio mais alto de PAOL para o controle de cobre é definido como um; o PAOL de cada composto é interpolado ou extrapolado linearmente em relação aos controles respectivos na placa experimental.Os dados brutos normalizados provenientes de experimentos replicados são médias, produzindo uma leitura final: o índice inflamatório devido à resolução da inflamação. Ao longo do tempo, é realizada uma análise de ajuste de regressão não linear exponencial monotônica em direção à inflamação inicial. Utilizando esta fórmula, na qual um zero representa a medida da resposta inicial no tempo igual a zero e um um está relacionado à inclinação da magnitude ao longo do tempo para gerar o espaço de características, aplica-se uma regressão não linear e uma análise de agrupamento divide o espaço de características em regiões características, permitindo assim a identificação automatizada de candidatos interessantes de diferentes categorias imunomoduladoras.Todos os parâmetros são exibidos no gráfico 2D com base nos parâmetros ACE de zero e ace de um. As rotinas de tratamento de dados criam páginas da web que fornecem uma visão geral rápida dos resultados, bem como uma visualização detalhada solicitada pelo usuário. Links suaves para outros bancos de dados heterogêneos, biológicos e químicos relevantes também são integrados para fornecer um recurso valioso para estudos comparativos e inovadores por meio dessas rotinas.Padrões adequados de dados e metainformações são estabelecidos para o armazenamento de longo prazo desses dados em uma tela piloto; foi realizada uma análise em uma biblioteca de 640 compostos bioativos conhecidos aprovados pela FDA, visando avaliar o efeito sobre a iniciação, progressão ou resolução de uma resposta inflamatória granulocítica. Com base nos efeitos observados, quatro tipos de fenótipos imunomodulatórios foram classificados, os quais podem indicar diferentes modos de ação: anti-inflamatório, anti-resolução, pró-inflamatório e pró-resolução. Dentre os 640 compostos, 45 exerceram efeitos anti-inflamatórios significativos, reduzindo o índice inflamatório inicial para 50% ou menos.Dentro desta categoria, foram encontrados seis compostos que pertencem à classe farmacológica de medicamentos anti-inflamatórios legítimos. Confirmada a validade desta abordagem, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como a triagem fenotípica in vivo para atividade de compostos imunomoduladores pode ser amplamente automatizada, permitindo tanto a aquisição quanto a análise de dados consistentes em um contexto de animal inteiro.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Relata-se o desenvolvimento de um sistema automatizado para geração de imagens e análise de zebrafish embriões transgênicos em placas de vários poços. Isso demonstra a capacidade de medir os efeitos dose-dependente de uma pequena molécula, BCI, na expressão do gene Fator de Crescimento de Fibroblastos repórter e fornecer tecnologia para o estabelecimento de high-throughput telas química zebrafish.

Desenvolvimento de imagem automatizada e análise química para as telas de zebrafish.

O nosso laboratório desenvolveu um novo sistema de imagem automatizado de alto débito, que é útil para a detecção de vários comportamentos diferentes em larvas de peixe-zebra de 7 dias de idade. O sistema pode ser utilizado para detectar alterações subtis no comportamento após as larvas foram expostas a agentes tóxicos ambientais ou de produtos farmacêuticos.

Automatizados análises comportamentais de alto rendimento em larvas do peixe

Este artigo descreve o vídeo elevado rendimento oleoduto que tenha sido estabelecida com sucesso para infectar e analisar um grande número de embriões de peixes-zebra proporcionando uma nova ferramenta poderosa para o teste e composto de descoberta de medicamentos usando um animal vertebrado organismo inteiro.

Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

O peixe-zebra é um excelente organismo experimental para estudar os processos de desenvolvimento de vertebrados e modelo da doença humana. Aqui, nós descrevemos um protocolo sobre como executar uma tela química Manual de alto rendimento em embriões de peixe-zebra com um todo-mount hibridização in situ (desejo) de leitura.

Um manual de tela pequena molécula Aproximando de alta capacidade Usando embriões Zebrafish

O protocolo descreve intubação zebrafish adulto com um biológico; em seguida, dissecando e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e qPCR. Este método permite a administração de compostos bioativos para monitorar a absorção intestinal e o estímulo imune local evocado. É relevante para a dinâmica intestinal da profilaxia oral de teste.

Intubação oral de Zebrafish adulto: um modelo para avaliar a absorção Intestinal de compostos bioativos

O objetivo do presente protocolo é medir o tempo de trânsito de fluorescente etiquetado alimento através do intestino de zebrafish larval de forma alto throughput.

Elevado-throughput medição de tempo de trânsito do intestino usando Zebrafish Larval

Aqui, apresentamos um protocolo para detecção de proteínas mediadas por anticorpos fluorescentes em preparações inteiras de embriões e larvas de zebrafish.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Modelos de xenoenxerto de zebrafish permitem a triagem de medicamentos de alto risco e imagens fluorescentes de células cancerígenas humanas em um microambiente in vivo. Desenvolvemos um fluxo de trabalho para a triagem de medicamentos automatizados em larga escala em amostras de leucemia derivada do paciente em zebrafish usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência automatizada.

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para implantação automatizada de xenoenxerto tumoral em larvas de peixe-zebra usando um sistema de injeção robótica de última geração. Além disso, apresentamos vídeos de injeção e dados de validação que demonstram o desempenho bem-sucedido do sistema.

Automatizando a implantação de tumores em larvas de peixe-zebra para pesquisa e medicina do câncer

Visual analytics (VA) é uma nova abordagem de análise de dados de forma interativa. Neste vídeo, discutimos o problema de sobrecarga de dados causada por high-throughput experimentos biológicos, e propor VA como uma solução para esse problema. O vídeo demonstra a análise dentro e entre os conjuntos de dados imunológicos usando uma ferramenta chamada Tableau VA.

Facilitar a Análise de Dados com Visual imunológicos Técnicas Analíticas

Aprenda a realizar triagem fenotípica automatizada de compostos imunomoduladores em larvas de zebrafish usando ensaio de inflamação induzida por sulfato de cobre. Este método permite análise de alto rendimento em imunologia.

Facilitar Drug Discovery: um ensaio automatizado de alta Inflamação conteúdo em Zebrafish

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