Purificação e Agregação do Domínio proteína precursora de amilóide intracelular

O objetivo deste procedimento é purificar o domínio intracelular da proteína precursora de amiloide, também conhecido como CID A, e apresentar um protocolo para agregação térmica e caracterização do CDI A por microscopia de força atômica. Isso é feito expressando primeiro a fusão de A GST de A ICD em bactérias. Em seguida, a proteína G-S-T-A-I-C-D é purificada clivada com trombina para separar o GST de A ICD e o GST é removido.

Em seguida, a agregação térmica de um CDI é induzida. Finalmente, os agregados A ICD são fotografados usando microscopia de força atômica. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram que o CID A pode ser purificado até homogeneidade em quantidade suficiente para análises bioquímicas e biofísicas.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, que requerem etapas complexas de cromatografia, é que é altamente pura e solúvel. Um CDI pode ser isolado na bancada usando reagentes e equipamentos padrão. Um CDI produzido por este protocolo é adequado para posterior caracterização bioquímica e biofísica.

Demonstrando o procedimento será Amina ti. Um ex-pós-doutorado do meu laboratório, Dr. Andres Oberer, demonstrará como realizar a imagem de microscopia de força atômica de um CDI para expressar o domínio intracelular recombinante A PP ou um CDI. Comece com células BL 21 transformadas com o vetor pgx 41, abrigando o CDI humano A fundido ao terminal C do GST com uma única colônia, inocule 10 mililitros de caldo LB com ampicilina e incube durante a noite a 37 graus Celsius com agitação vigorosa na manhã seguinte.

Incubar 400 mililitros de LB ampicilina em um frasco de um litro com cinco mililitros da cultura noturna. Incubar a 37 graus Celsius com agitação vigorosa até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja 0,4 a 0,6. Isso normalmente leva de duas a 2,5 horas para induzir a expressão de G-S-T-A-I-C-D.

Estamos adicionando 0,4 milimolar de IPTG e incubamos 37 graus Celsius com agitação vigorosa por cinco horas. Centrifugar as células a 6 000 vezes G durante 15 minutos a quatro graus Celsius e armazenar o sedimento a 80 graus Celsius negativos. Depois de preparar a lise, tampão e jogar bactérias no gelo, adicione 20 mililitros de tampão ao pellet e usando uma combinação de vórtice e tação no gelo com uma pipeta completamente.

Reese suspende o pellet bacteriano passa o lisado bacteriano suspenso Reese através de um emulsificante pré-resfriado ou prensa francesa. A 30.000 PSI, passe o lisado pelo emulsificante uma segunda vez e colete o lisado em um tubo pré-resfriado de 50 mililitros. Centrifugar o lisado a 15 000 vezes G e quatro graus Celsius durante 30 minutos.

Separe e transfira o supinato para um tubo pré-resfriado de 50 mililitros. Adicione 500 microlitros de uma pasta de 50% de glutationa surgiu. Gire por 30 minutos a quatro graus Celsius enquanto a amostra está girando.

Faça um novo tampão de eluição após a incubação. Despeje o lisado e a pasta em uma coluna descartável de cromatografia de poliestireno de cinco polegadas com filtros de curso. Lave a coluna cinco vezes com três mililitros de PBS.

Tampe a parte inferior da coluna e adicione 500 microlitros de tampão de eluição em temperatura ambiente. Tampe o topo da coluna e gire por cinco minutos em temperatura ambiente. Colete o peso inicial em um microtubo de lixo de 1,5 mililitro resfriado.

Repita a eluição mais duas vezes. Dialisar o eluato em uma membrana de diálise de corte de 10.000 pesos moleculares em quatro litros de PBS durante a noite de quatro graus Celsius no dia seguinte. Dialise contra mais quatro litros de PBS a quatro graus Celsius por uma hora.

Remova a proteína do de diálise e execute um ensaio de quantificação de proteínas para determinar o rendimento de G-S-T-A-I-C-D. Uma purificação típica de 400 mililitros de cultura resultará em rendimentos superiores a 20 miligramas de proteína purificada em concentrações de 10 a 20 miligramas por mililitro. Alíquota da proteína em 200 microlitros, alíquotas e congelamento de menos 80 graus Celsius.

Para liberar o ICD A do degelo do GST, 200 microlitros de G-S-T-A-I-C-D purificado e adicionar 20 microliberações de uma unidade por microlitro de trombina incubam durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte, limpe qualquer material agregado por centrifugação a 20.000 vezes G por 30 minutos de quatro graus Celsius. Transfira o SUPINATE para um microtubo pré-resfriado para remover GST e trombina. Adicione 50 microlitros de pasta 50% glutationa aro e 50 microlitros, 50% p e pasta wino zaine aro, respectivamente.

Incubar com rotação por cinco minutos em temperatura ambiente. Centrifugue brevemente para sedimentar os grânulos agrícolas e remova o supinato em um tubo novo. Extraia o GST mais quatro vezes com glutationa.

Aros realiza um ensaio de quantificação de proteínas em cinco microlitros do CDI A purificado. Os rendimentos típicos de uma cultura de 400 mililitros são de 50 a 100 microgramas a uma concentração de 0,2 a 0,5 miligramas por mililitro. Após diluir o CDI A recém-preparado em PBS a uma concentração de 0,1 miligrama por mililitro, induziu a agregação térmica incubando as amostras a 43 graus Celsius a 800 RPM em um agitador aquecido por 48 horas.

Dilua a amostra 20 vezes com água deionizada e coloque dois microlitros em recém-clivado. A mica seca a amostra em um dessecador durante a noite para visualizar o CDI agregado A usa microscopia de força atômica no modo de rosqueamento com ouro forrado. Micro cantilevers de nitreto sharpp com um raio de ponta nominal de dois nanômetros.

Amplitudes típicas de batida durante a imagem, um 10 a 20 nanômetros na freqüência de ressonância dos modilhões. A expressão e o enriquecimento relativo de G-S-T-A-I-C-D são mostrados aqui. Após a lise, a maior parte da proteína de fusão está presente na fração solúvel e, portanto, a extração dos corpos de inclusão não é necessária.

O material aludido da coluna de glutationa é superior a 95% puro. Na preparação mostrada aqui, a concentração de proteína aludida da coluna foi de 14,5 miligramas por mililitro e o rendimento foi de 22 miligramas. A clivagem de 200 microlitros desta preparação durante a noite com 20 unidades de trombina resultou em quase 100% de clivagem da proteína de fusão.

A quantidade de trombina usada é baixa o suficiente para não ser detectável por kumasi. A coloração azul, a remoção da trombina e o GST resultaram em alguma perda de material. No entanto, foi superior a 90% de pureza com um rendimento nesta preparação de 70 microgramas de A ICD a uma concentração de 0,35 miligramas por mililitro.

Um agregado de CDI, fotografado por um FM, é tipicamente amorfo de esteróides e varia em tamanho de 50 a 100 nanômetros. O material agregado não é detectável quando uma quantidade equimolar da chaperona UBI Quillin é adicionada à reação de agregação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como purificar o EICD induzir sua agregação e imagem agregada bay A-F-M-E-I-C-D.

Purificado por esta técnica pode ser aplicado a outros métodos, como espalhamento de luz e ensaios de armadilha de filtro para responder a perguntas sobre o efeito das chaperonas moleculares na agregação de EACD.