Isolamento dos núcleos dos cardiomiócitos a partir de Post-mortem de tecidos

O objetivo geral deste procedimento é isolar núcleos de cardiomiócitos a partir de tecido post mortem. Isso é realizado primeiramente homogeneizando o tecido com um homogeneizador de sonda e um pistilo de vidro, seguido por várias etapas de filtração. O segundo passo é isolar a fração nuclear das demais frações celulares por meio de centrifugação de sedimentação em gradiente de densidade.

Em seguida, os núcleos de cardiomiócitos são imunomarcados com anticorpo derivado contra PCM um. A etapa final consiste em isolar os núcleos de cardiomiócitos marcados por meio de ordenação celular ativada por fluorescência. Por fim, logo antes de manipulações adicionais a jusante, a pureza dos núcleos de cardiomiócitos é confirmada pela reanálise das frações nucleares ordenadas.

A principal vantagem desta técnica é que os núcleos de cardiomiócitos podem ser analisados igualmente bem a partir de tecidos frescos ou congelados em arquivo, de maneira de alto rendimento. Estudos baseados em DNA em cardiomiócitos são especialmente desafiadores por várias razões. Em primeiro lugar, os cardiomiócitos compõem apenas cerca de 20–30% das células no coração.

Além disso, eles são em grande parte nucleados. Além disso, os cardiomiócitos são em grande parte poliploides. Este método descrito aqui supera todas essas dificuldades.

Antes de iniciar o procedimento, recobrir os tubos de ultracentrifugação com 10 mililitros de uma solução de revestimento contendo BSA 1% mais PBS. Após girar os tubos por 30 minutos, remover a solução de revestimento e deixá-los secar ao ar.

Inicie o procedimento de isolamento de núcleos cardíacos utilizando um bisturi para dissecar o ventrículo esquerdo de um coração de camundongo congelado rapidamente. Corte a amostra dissecada em segmentos pequenos e, em seguida, transfira os fragmentos de tecido para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 15 mililitros de tampão de lise. Em seguida, homogeneíze o tecido cardíaco com um homogeneizador de sonda a 24.000 RPM durante 10 segundos e, depois, dilua o homogeneizado com um volume igual de tampão de lise até completar 30 mililitros. Transfira o homogeneizado para um homogeneizador de vidro utilizando oito movimentos com uma pistila de grande folga para liberar os núcleos.

Em seguida, passe os núcleos brutos. Isole primeiramente por meio de um filtro celular de 100 micrômetros, depois por um filtro celular de 70 micrômetros, direcionando para um tubo cônico novo de 50 mililitros. Agora, centrifugue o isolado de núcleos brutos por 10 minutos a 700 × g e 4 °C.

Inverta o tubo para remover cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, limpe o interior do tubo com um papel-toalha. Tendo cuidado para não perturbar o pellet de núcleos. Pipete a solução para cima e para baixo várias vezes para ressuspender os núcleos brutos.

Isolar em cinco mililitros de tampão de sacarose e, em seguida, adicionar mais 25 mililitros de tampão de sacarose à suspensão de núcleos. A seguir, adicionar 10 mililitros de tampão de sacarose recém-preparado a um dos tubos de ultracentrífuga revestidos previamente preparados. Então, sobrepor cuidadosamente o tampão com a solução do pellet de núcleos ressuspendido.

Após equilibrar o tubo em um rotor de giro livre, coloque o rotor em uma centrífuga de alta velocidade e centrifugue a amostra de núcleos por 60 minutos a 13.000 ×g e 4 °C. Quando a centrifugação terminar, remova cuidadosamente os tubos do rotor e, novamente, inverta-os. Para descartar o sobrenadante, limpe os resíduos remanescentes do interior do tubo com um papel toalha, como anteriormente, e, em seguida, ressuspenda o pellet de núcleos em um mililitro de tampão de armazenamento de núcleos.

Antes de iniciar o procedimento de coloração imunológica, transfira uma alíquota de 20 microlitros da amostra de núcleos para um tubo fax. Adicione 980 microlitros de tampão de armazenamento de núcleos à alíquota e rotule o tubo como controle negativo. Agora, adicione o anticorpo anti-PCM1 à amostra de núcleos e aos tubos de controle negativo em uma diluição de 1:500.

Em seguida, incubar ambos os tubos a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, após lavar os tubos com o tampão de armazenamento de núcleos e descartar o sobrenadante, ressuspender os pellets de núcleos em outro mililitro de tampão de armazenamento de núcleos.

Em seguida, adicione anticorpo secundário fluorescente antirrábico às amostras celulares em uma diluição de um para 100 e incube-as a quatro graus Celsius por uma hora. Após lavar os tubos com tampão de armazenamento de núcleos, ressuspenda os pellets em um mililitro de tampão de armazenamento de núcleos para triagem e análise por citometria de fluxo após o revestimento de núcleos, tubos de coleta com BSA e PBS como no início do vídeo, comece filtrando a amostra e o controle negativo através de peneiras celulares individuais de 30 mícrons. Pouco antes de carregar, adicione uma coloração de DNA.

Adicione uma diluição de um para 500 para identificação das populações nucleares. Carregue o controle negativo no citômetro de fluxo. Utilize os parâmetros de dispersão para frente e dispersão lateral para definir o primeiro portão para delimitar os núcleos cardíacos, semelhante ao gráfico de dispersão mostrado aqui.

Em seguida, utilize os parâmetros de dispersão para frente e largura do pulso de dispersão para frente para criar um segundo gate ao redor dos núcleos singletes, semelhante ao gráfico de dispersão mostrado aqui. Agora, carregue a amostra imunomarcada e posicione o terceiro gate para diferenciar os núcleos de cardiomiócitos positivos para PCM1 dos núcleos de não cardiomiócitos negativos para PCM1. Utilize a coloração nuclear de DNA para analisar o teor de DNA e realizar a análise do ciclo celular, semelhante à análise ilustrada por este histograma.

Após classificar os núcleos com base na positividade para PCM1, coloque os núcleos classificados no gelo e reanalise uma alíquota de cada amostra classificada para determinar a pureza da classificação. Por fim, centrifugue os núcleos classificados em seus tubos de coleta por 15 minutos a 1500 ×g e 4 °C. Após descartar os sobrenadantes, ressuspenda os pellets de núcleos em um tampão compatível com a aplicação downstream desejada.

Nesta primeira figura, um coração de camundongo adulto foi corado com um corante nuclear e com anticorpos contra a PCM um, o fator de transcrição cardíaco murino NKX 2.5 e a cadeia pesada da miosina ou MHC. Aqui é mostrado um aumento da sobreposição da figura anterior. Observe como os núcleos marcados pela PCM um em branco expressam o fator de transcrição NKX 2.5 em vermelho e estão cercados pelo citoplasma de cardiomiócitos em verde.

Esses dados demonstram conjuntamente a precisão com que a coloração de PCM um identifica os núcleos de cardiomiócitos. O recorte destaca o padrão de coloração epinuclear de PCM um nos núcleos de miócitos, conforme indicado adicionalmente pelas setas no experimento representado nas próximas três figuras, em que isolados de núcleos cardíacos foram corados com o corante de DNA DRAC cinco e com anticorpos contra PCM um. Aqui, a sobreposição das duas figuras anteriores mostra novamente as setas destacando o padrão de coloração epinuclear de PCM um nos núcleos isolados de cardiomiócitos.

Este gráfico de pontos demonstra que aproximadamente 30% dos núcleos isolados por este método são núcleos de cardiomiócitos, conforme indicado pela marcação de PCM1. Por fim, como ilustram esses histogramas, os núcleos de cardiomiócitos de camundongo são principalmente diplóides, conforme indicado pelo pico 2N, e apenas um subconjunto pequeno é tetraplóide, conforme indicado pelo pico menor 4N. Uma das vantagens desta técnica é que ela pode ser facilmente adaptada para outras espécies.

Quanto aos humanos.