Name: Isolamento dos núcleos dos cardiomiócitos a partir de Post-mortem de tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a isolar núcleos de cardiomiócitos de tecido pós-morte usando homogeneização, centrifugação por gradiente de densidade e citometria de fluxo. Este método garante alta pureza para análises moleculares.

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Nós gostamos de reconhecer Marcelo Toro para a assistência com a citometria de fluxo. Este estudo foi financiado pelo sueco Coração e Pulmão Foundation, da Comissão Européia, FP7 &quot;CardioCell&quot;, Sueco de Pesquisa do Conselho, seguros AFA e ALF. OB foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Isolamento dos Núcleos Cardiac <ol><li> Revestimento tubos de ultracentrifugação (Tubos centrífuga Beckman # 363664) com 10 ml de solução de revestimento de 1% BSA / PBS. Tapar os tubos e deixá-los girar durante 30 min num rotor tubo. Remover a solução de revestimento e deixar que o tubos de centrifugação de ar seco (um tubo por coração do rato é necessária para a análise de corações de rato individuais, alternadamente até 5 corações de rato ou 1 g de tecido do coração a partir de uma espécie diferente (por exemplo, humanos) podem ser processados em um tubo). </li><li> Todos os passos seguintes devem ser realizados no gelo. Dissecar o ventrículo esquerdo do coração de rato fresco ou congelado snap-com um bisturi. Nota, este protocolo é optimizado para coração de rato, mas também pode ser adaptado para rato ou do coração humano. Alternativamente, usam-se a 1 g de tecido do coração a partir de uma espécie diferente. </li><li> Apare o espécime em cubículos pequenos, com um bisturi. </li><li> Transfira os pedaços de tecido em um tubo Falcon 50 ml cheia com 15 ml de tampão de lise. </li><li> Homogeneizar atecido do coração com uma T-25 Ultra-Turrax sonda homogeneizador (IKA) com 24.000 rpm durante 10 seg. </li><li> Diluir o homogeneizado com um volume igual de tampão de lise a 30 ml. </li><li> Utilizar um vidro douncer (40 ml) para continuar a homogeneizar o tecido e os núcleos livre. Executar oito traçados com um pilão de grande folga. </li><li> Passe o núcleo bruto isolar através de um 100 mm e 70 mM de nylon de malha de células do filtro (BD Biosciences), consecutivamente. </li><li> Girar para baixo os núcleos isolado bruto numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 700 xg durante 10 min. </li><li> Remover o sobrenadante cuidadosamente por inversão dos tubos e limpar o interior do tubo com uma toalha de papel. Tenha cuidado para não perturbar o pellet núcleos. </li><li> Dissolve-se o isolado bruto núcleos em 5ml de tampão de sacarose por pipetagem a solução várias vezes para cima e para baixo. Adicionar mais 25 ml de tampão de sacarose para o sedimento dissolvido. </li><li> Adicionar 10 ml de tampão de sacarose recentemente preparada para o tubo de ultracentrifuga revestido (ver passo 1.1). &lt;/ Li&gt; <li> Cuidadosamente sobrepor a 10 ml adicional de tampão de sacarose, com a ressuspenso núcleos sedimento dissolvido em tampão de sacarose a partir do passo 1.9. </li><li> Equilibrar os tubos de centrifugação antes de os colocar num rotor JS13.1 livre oscilante e colocar o rotor em uma centrífuga de alta velocidade (Beckman Avanti-S 25). </li><li> Girar a amostra núcleos em 13.000 xg, a 4 ° C durante 60 min. </li><li> Quando a rotação foi concluída, remover os tubos cuidadosamente a partir do rotor e descartar o sobrenadante por inversão dos tubos e limpando os detritos remanescente a partir do interior dos tubos com toalha de papel. </li><li> Dissolve-se o pellet núcleos em 1 ml de tampão de núcleos de armazenamento (NSB mais tampão). Nota: NSB plus contém 1,5 mM espermina na forma de um estabilizador de DNA. </li><li> Prossiga com o passo 2.1, imunocoloração de núcleos de cardiomiócitos. </li></ol> 2. A imunocoloração para Citometria de Fluxo <ol><li> Prepare o controlo negativo para a imunocoloração. Tomar uma alíquota de 20 uL para fora da amostra núcleos e umadd ul 980 de NSB mais buffer. </li><li> Adicionar anti-pericentriolar material de um anticorpo (anticorpo de coelho anti-PCM-1, Antibodies Atlas) para a amostra núcleos em uma diluição de 1:500 a immunolabel núcleos de cardiomiócitos. Adicionar o anticorpo de isotipo para a diluição mesmo que o anticorpo anti-PCM-1 para o controlo negativo, preparado no passo 2.1. </li><li> Incubar controlo negativo e tubo de amostra a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lavar controlo negativo e amostra, pelo menos, uma vez com NSB mais tampão (tubos de girar para baixo numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 700 xg durante 10 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender o pellet núcleos em 1 ml de tampão mais NSB). </li><li> Adicionar anti-coelho de anticorpo fluorescente secundário (FITC ou APC) para controlo negativo e tubo de amostra em uma diluição de 1:1000. </li><li> Incubar controlo negativo e tubo de amostra a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Lavar controlo negativo e amostra, pelo menos, uma vez com NSB mais tampão (tubos de girar para baixo numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 700 xg durante 10 min. Descartar o sobrenadante e dissolver os núcleos sedimento em 1 ml de tampão mais NSB). </li><li> Continuar com a análise por citometria de fluxo e triagem. </li></ol> 3. Citometria de Fluxo <ol><li> Revestimento tubos núcleos de recolha (Falcon de 15 ml) com 1% de solução de BSA / PBS antes de começar a citometria de fluxo de triagem, tal como descrito no passo 1,1. </li><li> Filtrar a amostra eo controlo negativo através de um filtro 30 uM célula e carregar primeiro o controlo negativo para o citómetro de fluxo (afluxo BD). Definir o portão primeiro e segundo para definir núcleos e singuletos (núcleos único), com base na dispersão para a frente (FSC), largura de pulso para a frente de dispersão (FS largura de pulso) e dispersão lateral (SSC) (Fig. 2a e b). Adicionando um DNA mancha (DRAQ5 (1:500)) para a amostra pode ajudar a identificar a população núcleos inicialmente. </li><li> Carregar a amostra immunolabeled e definir a terceira porta para isolar os núcleos dos cardiomiócitos (PCM-1-positve) de não-cardiomiócitos núcleos (PCM-1-negativo). Inicie a triagem(Fig. 2c, d). </li></ol> Opcional: A fim de analisar o conteúdo de DNA nuclear (ploidia) e para executar a análise do ciclo celular adicionar uma mancha de DNA adequado para os núcleos (por exemplo, Hoechst 33342 ou DRAQ5) (fig. 2e). <ol start="4"><li> Após a triagem de citometria de fluxo, colocar os núcleos em gelo e re-analisar para determinar a pureza de classificação (Fig. 3a e b). </li><li> Girar para baixo os núcleos classificados nos tubos de recolha a 1500 xg numa centrifugadora refrigerada durante 15 min. </li><li> Dissolve-se o pellet núcleos num tampão compatível com a aplicação a jusante. </li></ol> 4. Os resultados representativos Morfologia núcleos e integridade pode ser avaliada por manchas de DNA e visualizada por microscopia (Fig. 1). Bem sucedida PCM-1 rotulagem pode ser avaliado por microscopia de epifluorescência e por citometria de fluxo (Fig. 1 e Fig.. 2c e d). PCM-1-positive e populações negativas devem ser bem separadas umas das outras (Fig. 2c, d). Em ventrículo esquerdo murino cerca de 30% de todos os núcleos deve ser os núcleos dos cardiomiócitos (Fig. 2d). Triagem pureza pode ser avaliada por re-analisando os núcleos ordenadas (Fig. 3a e b). Ambas as populações núcleos deve ter uma pureza superior a 95% de triagem. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig1.jpg" /> Figura 1. PCM-1 identifica os núcleos dos cardiomiócitos. Núcleos Cardíaca (a) são coradas com anticorpos para PCM-1 (b), e para Nkx2.5 (c) em um coração de rato adulto. (D) PCM-1-rotulado núcleos são cercados por citoplasma dos cardiomiócitos (miosina de cadeia pesada (MHC)) e expressar o fator de transcrição Nkx2.5, documentando a identificação precisa de núcleos de cardiomiócitos pelo PCM-1 coloração (barras de escala 20 microns e 10 iM (d, inserção)). (E) isolados núcleos cardíacas visualizado com o DNA mancha DRAQ5. (Feg) Cardiomyocnúcleos YTE são rotulados com anticorpos contra PCM-1 (barra de escala 10 mm). Note, o padrão de coloração epinuclear de PCM-1 em núcleos dos miócitos em secção de tecido e em núcleos isolados (setas). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig2.jpg" /> Figura 2. Classificação por citometria de fluxo de núcleos de cardiomiócitos. (A) núcleos cardíaca são identificados por dispersão frontal (FSC) e dispersor lateral (SSC). (B) Um segundo portão identifica núcleos único pelo FSC e largura de pulso FS 5. (C, d) gating fluorescente permite a separação de núcleos de cardiomiócitos (PCM-1-positivo) e não-cardiomiócitos (PCM-1-negativa) núcleos a partir de tecido do coração. (E) cardiomiócito do rato são na maior parte (&gt; 80%) diplóide (2n), apenas um pequeno subconjunto é tetraplóide (4n) 6. Note, cardiomiócitos humanos contêm uma maior frequência de núcleos poliploidia (&gt; 2n) 7,8. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig3.jpg" /> <strong&gt; Figura 3. Análise de pureza de classificados núcleos dos cardiomiócitos e não-cardiomiócitos. Re-análise de núcleos não-ordenados dos cardiomiócitos (a) e cardiomiócitos (b). Ambas as populações apresentam um grau de pureza superior a 99% de classificação.

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<li>Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Nuclei+Isolation+from+Human+Postmortem+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (20), e914(2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A identificação precisa de núcleos de cardiomiócitos é crucial para a análise dos processos regenerativos no miocárdio 2,3. As técnicas convencionais para isolar cardiomiócitos de tecido fresco baseiam-se principalmente a digestão enzimática de proteínas da matriz extracelular e da subsequente purificação a partir de células intersticiais por centrifugação a baixa velocidade. A purificação adicional de cardiomiócitos de vida a partir de células estaminais embrionárias (ESC) pode ser realizada por imunomarcaçã...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Tampão de Lise </td></tr><tr><td> Nome do reagente </td></tr><tr><td> 0,32 M de sacarose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM de CaCl2 </td></tr><tr><td> 5 mM de acetato de magnésio </td></tr><tr><td> 2,0 mM de EDTA </td></tr><tr><td> 0,5 mM de EGTA </td></tr><tr><td> 1 mM de DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 2. Tampão de sacarose </td></tr><tr><td> Nome do reagente </td></tr><tr><td> 2,1 M de sacarose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM de acetato de magnésio </td></tr><tr><td> 1 mM de DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 3. Tampão de núcleos de armazenamento (NSB plus) </td></tr><tr&gt; <td> Nome do reagente </td></tr><tr><td> 0,44 M de sacarose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) </td></tr><tr><td> 70 mM de KCl </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 1,5 mM de espermina </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Reagentes e Equipamentos </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> Isotipo IgG de coelho-CHIP Grau, # ab37415 </td><td> Abcam </td></tr><tr><td> De coelho anti-PCM-1 anticorpo, # HPA023374 </td><td> Anticorpos Atlas </td></tr><tr><td> Burro seg. anticorpo, anti-coelho Alexa 488 Fluor, # A-21.206 ou sec equivalente. anticorpo fluorescente </td><td> Life Technologies </td></tr><tr><td> DRAQ5 </td><td> Biostatus </td></tr><tr><td> Os filtros de células de 30 uM, 70 uM e 100 uM </td><td> BD Biosciences </td></tr><tr><td> Vidro douncer (40 ml) epilão &quot;L&quot; </td><td> VWR (Wheaton Industries, Inc.) </td></tr><tr><td> T-25 homogeneizador Ultra-Turrax </td><td> IKA Alemanha </td></tr><tr><td> Dispersão ferramenta S25 N-18 G </td><td> IKA Alemanha </td></tr><tr><td> Centrífuga Beckman Avanti </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Tubos Falcon de 15 ml e 50 ml </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Tubos de centrífuga Beckman # 363664 </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> JS13.1 rotor livre balançando </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Citómetro Influx </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Rotator tubo </td><td> VWR </td></tr></tbody></table>

isolamento dos núcleos dos cardiomiócitos a partir de post-mortem de tecidos

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identificação de núcleos de cardiomiócitos tem sido um desafio em cortes de tecido como a maioria das estratégias de contar apenas com proteínas marcadoras citoplasmáticos 1. Eventos raros em miócitos cardíacos, tais como a proliferação e apoptose necessitam de uma identificação precisa dos núcleos dos miócitos cardíacos para analisar a renovação celular e na homeostasia em condições patológicas 2. Aqui, nós proporcionar um método para isolar a partir de núcleos de cardiomiócitos pós tecido mortem por sedimentação densidade e imunomarcação com anticorpos contra o material pericentriolar 1 (PCM-1) e triagem de citometria de fluxo posterior. Esta estratégia permite uma análise com rendimento elevado e de isolamento, com a vantagem de se trabalhar igualmente bem em tecido fresco e material de arquivo congelado. Isto torna possível estudar o material já recolhidos na biobancos. Esta técnica é aplicável e testado em uma vasta gama de espécies e adequados para várias aplicações tais como a jusante de carbono-14 namoro 3, a célula-cycle análise 4, visualização de análogos da timidina (por exemplo, BrdU e UDI) 4, a análise de transcriptoma e epigenética.

Núcleos cardíaca são isolados através de sedimentação densidade e immunolabeled com anticorpos contra o material pericentriolar 1 (PCM-1) para identificar e classificar os núcleos dos cardiomiócitos por citometria de fluxo.

Isolamento dos núcleos dos cardiomiócitos a partir de Post-mortem de tecidos

A identificação de núcleos de cardiomiócitos tem sido desafiadora em cortes de tecidos, pois a maioria das estratégias baseia-se apenas em proteínas marcadoras citoplasmáticas1. Eventos raros ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar núcleos de cardiomiócitos a partir de tecido post mortem. Isso é realizado primeiramente homogeneizando o tecido com um homogeneizador de sonda e um pistilo de vidro, seguido por várias etapas de filtração. O segundo passo é isolar a fração nuclear das demais frações celulares por meio de centrifugação de sedimentação em gradiente de densidade.Em seguida, os núcleos de cardiomiócitos são imunomarcados com anticorpo derivado contra PCM um. A etapa final consiste em isolar os núcleos de cardiomiócitos marcados por meio de ordenação celular ativada por fluorescência. Por fim, logo antes de manipulações adicionais a jusante, a pureza dos núcleos de cardiomiócitos é confirmada pela reanálise das frações nucleares ordenadas.A principal vantagem desta técnica é que os núcleos de cardiomiócitos podem ser analisados igualmente bem a partir de tecidos frescos ou congelados em arquivo, de maneira de alto rendimento. Estudos baseados em DNA em cardiomiócitos são especialmente desafiadores por várias razões. Em primeiro lugar, os cardiomiócitos compõem apenas cerca de 20–30% das células no coração.Além disso, eles são em grande parte nucleados. Além disso, os cardiomiócitos são em grande parte poliploides. Este método descrito aqui supera todas essas dificuldades.Antes de iniciar o procedimento, recobrir os tubos de ultracentrifugação com 10 mililitros de uma solução de revestimento contendo BSA 1% mais PBS. Após girar os tubos por 30 minutos, remover a solução de revestimento e deixá-los secar ao ar.Inicie o procedimento de isolamento de núcleos cardíacos utilizando um bisturi para dissecar o ventrículo esquerdo de um coração de camundongo congelado rapidamente. Corte a amostra dissecada em segmentos pequenos e, em seguida, transfira os fragmentos de tecido para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 15 mililitros de tampão de lise. Em seguida, homogeneíze o tecido cardíaco com um homogeneizador de sonda a 24.000 RPM durante 10 segundos e, depois, dilua o homogeneizado com um volume igual de tampão de lise até completar 30 mililitros. Transfira o homogeneizado para um homogeneizador de vidro utilizando oito movimentos com uma pistila de grande folga para liberar os núcleos.Em seguida, passe os núcleos brutos. Isole primeiramente por meio de um filtro celular de 100 micrômetros, depois por um filtro celular de 70 micrômetros, direcionando para um tubo cônico novo de 50 mililitros. Agora, centrifugue o isolado de núcleos brutos por 10 minutos a 700 × g e 4 °C.Inverta o tubo para remover cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, limpe o interior do tubo com um papel-toalha. Tendo cuidado para não perturbar o pellet de núcleos. Pipete a solução para cima e para baixo várias vezes para ressuspender os núcleos brutos.Isolar em cinco mililitros de tampão de sacarose e, em seguida, adicionar mais 25 mililitros de tampão de sacarose à suspensão de núcleos. A seguir, adicionar 10 mililitros de tampão de sacarose recém-preparado a um dos tubos de ultracentrífuga revestidos previamente preparados. Então, sobrepor cuidadosamente o tampão com a solução do pellet de núcleos ressuspendido.Após equilibrar o tubo em um rotor de giro livre, coloque o rotor em uma centrífuga de alta velocidade e centrifugue a amostra de núcleos por 60 minutos a 13.000 ×g e 4 °C. Quando a centrifugação terminar, remova cuidadosamente os tubos do rotor e, novamente, inverta-os. Para descartar o sobrenadante, limpe os resíduos remanescentes do interior do tubo com um papel toalha, como anteriormente, e, em seguida, ressuspenda o pellet de núcleos em um mililitro de tampão de armazenamento de núcleos.Antes de iniciar o procedimento de coloração imunológica, transfira uma alíquota de 20 microlitros da amostra de núcleos para um tubo fax. Adicione 980 microlitros de tampão de armazenamento de núcleos à alíquota e rotule o tubo como controle negativo. Agora, adicione o anticorpo anti-PCM1 à amostra de núcleos e aos tubos de controle negativo em uma diluição de 1:500.Em seguida, incubar ambos os tubos a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, após lavar os tubos com o tampão de armazenamento de núcleos e descartar o sobrenadante, ressuspender os pellets de núcleos em outro mililitro de tampão de armazenamento de núcleos.Em seguida, adicione anticorpo secundário fluorescente antirrábico às amostras celulares em uma diluição de um para 100 e incube-as a quatro graus Celsius por uma hora. Após lavar os tubos com tampão de armazenamento de núcleos, ressuspenda os pellets em um mililitro de tampão de armazenamento de núcleos para triagem e análise por citometria de fluxo após o revestimento de núcleos, tubos de coleta com BSA e PBS como no início do vídeo, comece filtrando a amostra e o controle negativo através de peneiras celulares individuais de 30 mícrons. Pouco antes de carregar, adicione uma coloração de DNA.Adicione uma diluição de um para 500 para identificação das populações nucleares. Carregue o controle negativo no citômetro de fluxo. Utilize os parâmetros de dispersão para frente e dispersão lateral para definir o primeiro portão para delimitar os núcleos cardíacos, semelhante ao gráfico de dispersão mostrado aqui.Em seguida, utilize os parâmetros de dispersão para frente e largura do pulso de dispersão para frente para criar um segundo gate ao redor dos núcleos singletes, semelhante ao gráfico de dispersão mostrado aqui. Agora, carregue a amostra imunomarcada e posicione o terceiro gate para diferenciar os núcleos de cardiomiócitos positivos para PCM1 dos núcleos de não cardiomiócitos negativos para PCM1. Utilize a coloração nuclear de DNA para analisar o teor de DNA e realizar a análise do ciclo celular, semelhante à análise ilustrada por este histograma.Após classificar os núcleos com base na positividade para PCM1, coloque os núcleos classificados no gelo e reanalise uma alíquota de cada amostra classificada para determinar a pureza da classificação. Por fim, centrifugue os núcleos classificados em seus tubos de coleta por 15 minutos a 1500 ×g e 4 °C. Após descartar os sobrenadantes, ressuspenda os pellets de núcleos em um tampão compatível com a aplicação downstream desejada.Nesta primeira figura, um coração de camundongo adulto foi corado com um corante nuclear e com anticorpos contra a PCM um, o fator de transcrição cardíaco murino NKX 2.5 e a cadeia pesada da miosina ou MHC. Aqui é mostrado um aumento da sobreposição da figura anterior. Observe como os núcleos marcados pela PCM um em branco expressam o fator de transcrição NKX 2.5 em vermelho e estão cercados pelo citoplasma de cardiomiócitos em verde.Esses dados demonstram conjuntamente a precisão com que a coloração de PCM um identifica os núcleos de cardiomiócitos. O recorte destaca o padrão de coloração epinuclear de PCM um nos núcleos de miócitos, conforme indicado adicionalmente pelas setas no experimento representado nas próximas três figuras, em que isolados de núcleos cardíacos foram corados com o corante de DNA DRAC cinco e com anticorpos contra PCM um. Aqui, a sobreposição das duas figuras anteriores mostra novamente as setas destacando o padrão de coloração epinuclear de PCM um nos núcleos isolados de cardiomiócitos.Este gráfico de pontos demonstra que aproximadamente 30% dos núcleos isolados por este método são núcleos de cardiomiócitos, conforme indicado pela marcação de PCM1. Por fim, como ilustram esses histogramas, os núcleos de cardiomiócitos de camundongo são principalmente diplóides, conforme indicado pelo pico 2N, e apenas um subconjunto pequeno é tetraplóide, conforme indicado pelo pico menor 4N. Uma das vantagens desta técnica é que ela pode ser facilmente adaptada para outras espécies.Quanto aos humanos.

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Research

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Medicine

Medicina

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Para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular em cardiomiócitos, apresentamos protocolos usando duas linhagens de camundongos transgênicos: camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh, para a identificação inequívoca de núcleos de cardiomiócitos, e camundongos CAG-eGFP-anilina, para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular.

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