Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

O objetivo geral deste procedimento é monitorar as respostas de cálcio induzidas por estímulos, tanto em neurônios marcados com GFP, espacial quanto temporalmente em fatias de cérebro usando um corante indicador de cálcio fluorescente não verde. Isso é feito extraindo primeiro o cérebro de um camundongo transgênico que expressa GFP em células específicas. O segundo passo é preparar fatias de tecido com um micrótomo.

Em seguida, a solução de carga de corante indicador de cálcio é pipetada nas fatias para permitir que o corante seja absorvido pelas células cerebrais. A etapa final é realizar um registro de carimbo de data/hora de células fluorescentes usando microscopia confocal. Em última análise, as respostas de cálcio em neurônios marcados com GFP são mostradas usando análise de imagem de cálcio multicolorida.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes de microscopia confocal é que podemos obter imagens de cálcio em neurônios fluorescentes verdes da tecnologia GFP usando uma matriz indicadora de cálcio fluorescente com desvio para o vermelho. A enorme mudança de traço do menos vermelho nos permite fazer uma análise multicolorida da fluorescência vermelha em combinação com o GFP verde usando um único comprimento de onda de excitação. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando fomos confrontados com o problema de monitorar sinais de cálcio em neurônios que só podíamos identificar usando uma tecnologia genética fluorescente, que era a proteína de fluorescência verde.

Vou agora demonstrar várias etapas críticas deste procedimento. Comece o procedimento despejando a solução de ágar aquecida em uma placa de Petri quadrada a uma altura de um centímetro após o resfriamento e endurecimento, o gel de ágar 4% é cortado em blocos de um centímetro cúbico e colocado em uma garrafa para armazenamento. Após a decapitação, o camundongo cortou o couro cabeludo com uma lâmina de barbear de ponta única na direção sagital central, do osso frontal até a protuberância occipital externa.

Posteriormente, abra ainda mais o couro cabeludo cortado primeiro na direção lateral rostral. Em seguida, na direção ventral. Em seguida, faça dois cortes laterais e um rostral.

No forame magno com uma pequena tesoura de mola, corte cuidadosamente o crânio. Neste momento, os ossos interparietais e parietais occipitais devem ser descolados. Se a dura-máter ainda estiver presente, remova-a cuidadosamente com uma pinça para evitar danos ao cérebro.

Em seguida, remova o osso escamal, o etmoidal anterior e o forame frontal. Agora o cérebro pode ser facilmente removido com uma espátula de micro colher invertida e os nervos cranianos podem ser cortados. O cérebro deve pousar em seu lado ventral em uma superfície resistente a cortes com a superfície ventral do cérebro para baixo.

Use uma lâmina de barbear de ponta única para remover o cerebelo. Esta superfície de corte reto será a base para a montagem do cérebro em uma placa para permitir o corte de seções cerebrais coronais. Em seguida, cole o cérebro com a superfície de corte na placa de base do micrótomo usando uma pequena quantidade de super cola adesiva de cianoacrilato de alto desempenho de cura rápida.

Posteriormente, cole um bloco de gel de ágar de um centímetro cúbico no lado ventral do cérebro na placa de base do micrótomo para apoiar e fixar o cérebro durante o corte. Depois que a ligação secar, coloque a placa no banho do micrótomo contendo solução extracelular oxigenada a frio de seis graus Celsius. Em seguida, corte o cérebro em fatias de 300 mícrons de espessura com baixa velocidade de corte, as fatias do cérebro coronal são coletadas até que todo o cérebro tenha sido seccionado.

Agora prepare uma solução de 20% F1 27 em DMSO adicionando solução de DMSO ao pó F1 27 onic. Em seguida, dissolva-o sônica diretamente a solução por dois minutos. Depois disso, adicione cinco microlitros de solução F1 27 20% onic a um tubo de 50 microgramas de pêlo permeável a células.

Misture a solução com uma pipeta. Em seguida, adicione 45 microlitros de solução extracelular à mistura e vortex. Resumidamente, adicione mais 325 microlitros de solução extracelular e sonice o tubo por mais três minutos.

Após a sonicação, adicionar 1.156 mililitros de solução extracelular oxigenada para obter a solução final de carga D indicadora de cálcio. Transfira as fatias do cérebro coronal para uma placa de cultura de células de seis poços cheia de solução extracelular oxigenada até seis fatias por poço. Em seguida, aspire a solução extracelular oxigenada das câmaras, tomando cuidado para não danificar as fatias do cérebro.

Em seguida, pipete 750 microlitros da solução de carga do indicador de cálcio D diretamente para cada um. Bem, as fatias do cérebro devem ser cobertas pela solução contendo rore am. Depois disso, incube as fatias na incubadora de cultura de células de dióxido de carbono de oxigênio por 45 a 60 minutos a 37 graus Celsius.

No final da incubação, substitua a solução de carga DI do indicador de cálcio por uma solução extracelular oxigenada fresca para evitar sobrecarregar as células. Para monitorar as mudanças induzidas pelo estímulo no sinal fluorescente, transfira uma das fatias de cérebro carregadas de vermelho fure para uma câmara de gravação e posicione-a conforme desejado. Depois de montar a câmara na configuração do microscópio confocal, perfunda a fatia por 10 minutos com solução extracelular oxigenada para remover qualquer excesso de corante indicador de cálcio extracelular.

Depois de sair da câmara de gravação, o PERFUSE oito é recolhido em uma garrafa a vácuo. Em seguida, olhe para a fatia através do microscópio em baixa ampliação. Anote a orientação da fatia e encontre a área de interesse na fatia, no nosso caso, a área hipotalâmica no cérebro.

Depois, mude para alta ampliação. Encontre a célula de interesse na fatia coletando imagens GFP e verificando simultaneamente a intensidade de fluorescência do sinal vermelho URA. Ajuste a potência do laser para um valor que permita medições na mudança da intensidade de fluorescência vermelha URA e evite o branqueamento dos dois fluoróforos.

Em seguida, comece a adquirir imagens nas taxas entre 0,5 a dois hertz para coletar os sinais de fure e GFP. Esta figura mostra a imagem confocal dos neurônios GN, RHR Tau GFP em uma fatia coronal do cérebro. Este é o sinal de fluorescência relativamente uniforme observado após carregar a fatia do cérebro com fure am e esta é a imagem mesclada mostrando os neurônios carregados com o corante indicador de cálcio.

Aqui estão exemplos das respostas de cálcio induzidas por estímulos somáticos de neurônios individuais marcados com GFP em diferentes áreas do cérebro hipotalâmico. Os sinais distintos de cálcio entre os neurônios que expressam GN RHR de diferentes núcleos hipotalâmicos podem ser comparados usando a área sob a curva como uma estimativa para a mudança total de cálcio em uma determinada célula durante o mesmo período, uma vez dominado. Essa técnica pode ser feita em menos de 90 minutos, incluindo a preparação do corante indicador de cálcio, o carregamento e a incubação das fatias se for realizada corretamente.