Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

O objetivo geral deste procedimento é monitorar respostas de cálcio induzidas por estímulo, tanto em neurônios marcados com GFP quanto espacial e temporalmente, em fatias de cérebro utilizando um corante fluorescente de cálcio não verde. Isso é realizado primeiramente pela extração do cérebro de um camundongo transgênico que expressa GFP em células específicas. O segundo passo é preparar fatias de tecido com um microtomo.

Em seguida, a solução de carregamento do corante indicador de cálcio é pipetada sobre as fatias para permitir que o corante seja absorvido pelas células cerebrais. O passo final consiste em realizar uma gravação com carimbo de tempo de células fluorescentes utilizando microscopia confocal. Em última análise, as respostas de cálcio em neurônios marcados com GFP são demonstradas por meio de análise de imagem de cálcio multicolorida.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes de microscopia confocal é que podemos imaginar o cálcio em neurônios verdes fluorescentes com a proteína verde fluorescente (GFP) utilizando um corante indicador de cálcio fluorescente com deslocamento para o vermelho. O grande deslocamento espectral do corante vermelho mais recente nos permite realizar análises multicoloridas da fluorescência vermelha em combinação com a GFP verde, usando um único comprimento de onda de excitação. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando enfrentamos o problema de monitorar sinais de cálcio em neurônios que só podíamos identificar por meio de uma técnica fluorescente genética, que era a proteína verde fluorescente.

Agora demonstrarei várias etapas críticas deste procedimento. Inicie o procedimento despejando a solução de ágar aquecida em uma placa de Petri quadrada até uma altura de um centímetro; após o resfriamento e endurecimento, o gel de ágar 4% é cortado em blocos de um centímetro cúbico e colocado em um frasco para armazenamento. Após a decapitação do camundongo, corte o couro cabeludo com uma lâmina de barbear de bordo único na direção sagital mediana, desde o osso frontal até a protuberância occipital externa.

Posteriormente, abra ainda mais o couro cabeludo cortado primeiro na direção lateral rostral. Depois, na direção ventral. Em seguida, faça dois cortes laterais e um corte rostral.

No forame magno, com uma tesoura de mola pequena, separe cuidadosamente o crânio. Nesse momento, os ossos occipital, interparietal e parietal devem ser destacados. Se a dura-máter ainda estiver presente, remova-a cuidadosamente com uma pinça para evitar danos ao cérebro.

Em seguida, remova o osso esquamal, o forame etmoidal anterior e o forame frontal. Agora, o cérebro pode ser facilmente removido com uma espátula de microcolher invertida e os nervos cranianos podem ser seccionados. O cérebro deve pousar com sua face ventral para baixo sobre uma superfície resistente ao corte, com a superfície ventral do cérebro voltada para baixo.

Use uma lâmina de barbear de corte único para remover o cerebelo. Esta superfície de corte reto servirá como base para fixar o cérebro em uma placa, permitindo o corte de seções cerebrais coronais. Em seguida, cole o cérebro com a superfície cortada sobre a placa-base do micrótomo usando uma pequena quantidade de cola cianoacrilato de alto desempenho e cura rápida.

Posteriormente, cole um bloco de gel de ágar de um centímetro cúbico na face ventral do cérebro sobre a placa base do micrótomo para sustentar e fixar o cérebro durante o corte. Após a secagem da ligação, coloque a placa na câmara do micrótomo contendo solução extracelular oxigenada resfriada a seis graus Celsius. Em seguida, corte o cérebro em fatias de 300 mícrons de espessura com baixa velocidade de corte; as fatias coronais do cérebro são coletadas até que todo o cérebro tenha sido seccionado.

Agora, prepare uma solução de 20% de ônico F1 27 em DMSO adicionando solução de DMSO ao pó de ônico F1 27. Em seguida, dissolva diretamente por sonicar a solução por dois minutos. Depois disso, adicione cinco microlitros da solução de 20% de ônico F1 27 a um tubo contendo 50 microgramas de furred am permeável a células.

Misture a solução com uma pipeta. Em seguida, adicione 45 microlitros de solução extracelular à mistura e vortexe. Breve, adicione mais 325 microlitros de solução extracelular e sonique o tubo por mais três minutos.

Após a sonicação, adicione 1,156 mililitros de solução extracelular oxigenada para obter a solução final de carregamento com o indicador de cálcio D. Transfira as fatias coronais do cérebro para uma placa de cultura celular de seis poços contendo solução extracelular oxigenada, com até seis fatias por poço. Em seguida, aspire a solução extracelular oxigenada das câmaras, tomando cuidado para não danificar as fatias cerebrais.

A seguir, pipete 750 microlitros da solução de carregamento do indicador de cálcio D diretamente para cada poço, de modo que as fatias cerebrais fiquem cobertas pela solução contendo rore am. Em seguida, incube as fatias no incubador de cultura celular com oxigênio e dióxido de carbono por 45 a 60 minutos a 37 graus Celsius.

No final da incubação, substitua a solução de carregamento do indicador de cálcio DI por uma solução extracelular oxigenada fresca para evitar sobrecarregar as células. Para monitorar as alterações induzidas pelo estímulo no sinal fluorescente, transfira uma das fatias cerebrais carregadas com fure red para uma câmara de registro e posicione-a conforme desejado. Após montar a câmara no sistema de microscopia confocal, perfunda a fatia por 10 minutos com solução extracelular oxigenada para remover qualquer excesso de corante indicador de cálcio extracelular.

Após sair da câmara de registro, o PERFUSE oito é coletado em um frasco a vácuo. Em seguida, observe o corte ao microscópio com ampliação baixa. Anote a orientação do corte e localize a área de interesse no corte; em nosso caso, a área hipotalâmica no cérebro.

Posteriormente, mude para alta ampliação. Localize a célula de interesse na fatia coletando imagens GFP e verificando simultaneamente a intensidade de fluorescência do sinal vermelho de URA. Ajuste a potência do laser para um valor que permita medições na variação da intensidade de fluorescência vermelha de URA e que evite o desbotamento dos dois fluoróforos.

Em seguida, comece a adquirir imagens em taxas entre 0,5 e dois hertz para coletar os sinais de fure e GFP. Esta figura mostra a imagem confocal dos neurônios GN, RHR Tau GFP em um corte coronal de cérebro. Este é o sinal de fluorescência relativamente uniforme observado após o carregamento do corte de cérebro com fure am e esta é a imagem mesclada mostrando os neurônios carregados com o corante indicador de cálcio.

Aqui estão exemplos das respostas de cálcio induzidas por estímulo somático em neurônios individuais marcados com GFP em diferentes áreas cerebrais hipotalâmicas. Os sinais distintos de cálcio entre os neurônios que expressam RHR GN de diferentes núcleos hipotalâmicos podem ser comparados utilizando a área sob a curva como uma estimativa da alteração total de cálcio em uma célula específica durante o mesmo período, uma vez dominado. Esta técnica pode ser realizada em menos de 90 minutos, incluindo a preparação do corante indicador de cálcio, a carga e a incubação das fatias, se for realizada corretamente.