Name: Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda a monitorar respostas de cálcio em neurônios marcados com GFP em fatias de hipotálamo de rato usando corante indicador vermelho e microscopia confocal. Este método permite análise espacial e temporal dos sinais de cálcio.

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Agradecemos aos nossos colegas que participaram do trabalho aqui resumidas. Este trabalho foi financiado por doações do Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), &quot;análise integrativa do olfato&quot; o DFG Schwerpunktprogramm 1392 e pela Fundação Volkswagen (TLZ). TLZ é professor Lichtenberg da Fundação Volkswagen.

<ol><li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li>
<li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+Ca2%2B+dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons%3A+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li>
<li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
<li>Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+internalization+and+surface+expression+of+a+functional%2C+fluorescently+tagged+G-protein-coupled+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor.</a> Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).</li>
<li>Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fura+red+as+an+intracellular+calcium+indicator+in+frog+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers.</a> Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).</li>
<li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+modifies+action+potential+generation+in+sheep+pars+distalis+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. Technique for setting up the perfusion of a recording chamber for physiological studies with cultured and acutely dissociated cells. , Avaliable from: 
	 <a target="_blank" href="
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf">
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf</a> (1998).</li>
<li>Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+noninvasive+intracellular+pH+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator.</a> Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+genetically+labeled+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of genetically labeled gonadotropes.</a> Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd edn, Academic Press. (2001).</li>
<li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pheromones+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li>
<li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse%3A+effects+and+neural+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li>
<li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li>
<li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li>
<li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li>
<li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li>
<li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li>
<li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2%2B+transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li>
<li>Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Neuroscience Meeting Planner, , Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma questão importante em neurociência é compreender como o cérebro processa a informação social. A principal fonte de informações necessárias para o reconhecimento social é codificada por sinais olfativos ou pheromonal. A detecção destes sinais por populações neuronais no nariz e ao reconhecimento dos sinais no cérebro, especialmente o hipotálamo, desempenham um papel fundamental em muitos processos sociais e de hormonas e de outros factores de influência neuroendócrinos 13-16. Um obstáculo essencial de anal...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Gato. N ° </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma </td><td> A1296 </td></tr><tr><td> Fura-red/AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-3021 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231 </td></tr><tr><td> Vibratório-Blade Microtome Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9770170 </td></tr><tr><td> Dispositivo de arrefecimento CU 65 para Micrótomo Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9920120 </td></tr><tr><td> O 2 / CO 2 Incubadora, CB210-UL </td><td> Encadernador </td><td> 0019389 </td></tr><tr><td> Super cola, Loctite 406TM </td><td> Henckel </td><td> 142580 </td></tr><tr><td> Espátulas duplas, forma colher </td><td>Bochem </td><td> 3182 </td></tr><tr><td> Espátulas Microspoon, forma colher </td><td> Bochem </td><td> 3344 </td></tr><tr><td> Tesoura de mola, Moria-Vannas-Wolff - Lâminas 7 milímetros </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15370-52 </td></tr><tr><td> Tesoura de mola, Vannas - Lâminas 3 milímetros </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> Wagner Tesoura </td><td> Belas Science Tools </td><td> 14071-12 </td></tr><tr><td> Médico Fórceps, 7b Dumont </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11270-20 </td></tr><tr><td> Câmara de banho grande retangular Aberto (RC-27) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0238 </td></tr><tr><td> Radiance BioRad Confocal Microscope 2100 </td><td> Zeiss </td><td> nd </td></tr></tbody></table>

respostas de imagem de cálcio nos neurônios gfp-tagged fatias de cérebro de rato hipotalâmicos

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Apesar de um aumento enorme no nosso conhecimento sobre os mecanismos subjacentes a codificação de informação no cérebro, a questão central sobre os passos precisos moleculares, bem como a actividade de neurónios específicos em multi-funcional núcleos de áreas cerebrais, tais como o hipotálamo permanecem. Este problema abrange a identificação dos componentes moleculares envolvidos na regulação de vários neuro-hormonais cascatas de transdução de sinal. Elevações de Ca 2 + intracelular desempenham um papel importante na regulação da sensibilidade de neurónios, quer ao nível de transdução de sinal e em locais sinápticos. Novas ferramentas surgiram para ajudar a identificar os neurónios a miríade de neurónios do cérebro por expressar a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo de um promotor particular. Para monitorar tanto espacialmente e temporalmente estímulo induzido Ca 2 + respostas em GFP-tagged neurônios, um não-verde fluorescente Ca 2 + indicador corante needs a ser utilizado. Além disso, a microscopia confocal é um método preferido de neurónios individuais de imagem em fatias de tecido devido à sua capacidade de visualizar os neurónios em planos distintos de profundidade dentro do tecido e para limitar fora de foco fluorescente. O Ca 2 + raciométrica indicador fura-2 tem sido utilizado em combinação com GFP-tagged neurônios 1. No entanto, o corante é excitada por luz ultravioleta (UV). O custo do laser e a profundidade de penetração limitada óptico da luz UV pode prejudicar a sua utilização em muitos laboratórios. Além disso, a GFP fluorescente pode interferir com os sinais de fura-2 2. Por isso, decidimos usar um vermelho fluorescente Ca 2 + corante indicador. A mudança Strokes enorme de fura-vermelho permite multicolor análise da fluorescência vermelha em combinação com GFP utilizando um comprimento de onda de excitação único. Tivemos bons resultados anteriormente usando fura-vermelho em combinação com GFP-tagged neurônios olfativos 3. Os protocolos para os cortes de tecidos olfactivos parecia estar a trabalhar eQually bem em neurônios do hipotálamo 4. Fura-vermelho base de Ca 2 + da imagem foram também combinados com sucesso com GFP-tagged β pancreáticas e células GFP-tagged receptores expressos em células HEK 5,6. Uma peculiaridade pouco de fura-vermelho é que a sua intensidade de fluorescência a 650 nm diminui uma vez que o indicador se liga de cálcio 7. Assim, a fluorescência de neurónios de repouso com baixa concentração de Ca + 2 tem intensidade relativamente alta. Note-se, que os outros vermelhos Ca 2 + indicadoras de corantes existem ou estão sendo desenvolvidos atualmente, que poderia dar melhores resultados ou melhores em neurônios e áreas diferentes do cérebro.

Neste protocolo, atualizar o progresso recente na imagem Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinais de neurónios GFP-tagged em fatias de cérebro de tecido, utilizando um vermelho fluorescente Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Corante indicador.

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Apesar de um aumento enorme no nosso conhecimento sobre os mecanismos subjacentes à codificação de informações no cérebro, uma questão central relativa ao...

O objetivo geral deste procedimento é monitorar respostas de cálcio induzidas por estímulo, tanto em neurônios marcados com GFP quanto espacial e temporalmente, em fatias de cérebro utilizando um corante fluorescente de cálcio não verde. Isso é realizado primeiramente pela extração do cérebro de um camundongo transgênico que expressa GFP em células específicas. O segundo passo é preparar fatias de tecido com um microtomo.Em seguida, a solução de carregamento do corante indicador de cálcio é pipetada sobre as fatias para permitir que o corante seja absorvido pelas células cerebrais. O passo final consiste em realizar uma gravação com carimbo de tempo de células fluorescentes utilizando microscopia confocal. Em última análise, as respostas de cálcio em neurônios marcados com GFP são demonstradas por meio de análise de imagem de cálcio multicolorida.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes de microscopia confocal é que podemos imaginar o cálcio em neurônios verdes fluorescentes com a proteína verde fluorescente (GFP) utilizando um corante indicador de cálcio fluorescente com deslocamento para o vermelho. O grande deslocamento espectral do corante vermelho mais recente nos permite realizar análises multicoloridas da fluorescência vermelha em combinação com a GFP verde, usando um único comprimento de onda de excitação. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando enfrentamos o problema de monitorar sinais de cálcio em neurônios que só podíamos identificar por meio de uma técnica fluorescente genética, que era a proteína verde fluorescente.Agora demonstrarei várias etapas críticas deste procedimento. Inicie o procedimento despejando a solução de ágar aquecida em uma placa de Petri quadrada até uma altura de um centímetro; após o resfriamento e endurecimento, o gel de ágar 4% é cortado em blocos de um centímetro cúbico e colocado em um frasco para armazenamento. Após a decapitação do camundongo, corte o couro cabeludo com uma lâmina de barbear de bordo único na direção sagital mediana, desde o osso frontal até a protuberância occipital externa.Posteriormente, abra ainda mais o couro cabeludo cortado primeiro na direção lateral rostral. Depois, na direção ventral. Em seguida, faça dois cortes laterais e um corte rostral.No forame magno, com uma tesoura de mola pequena, separe cuidadosamente o crânio. Nesse momento, os ossos occipital, interparietal e parietal devem ser destacados. Se a dura-máter ainda estiver presente, remova-a cuidadosamente com uma pinça para evitar danos ao cérebro.Em seguida, remova o osso esquamal, o forame etmoidal anterior e o forame frontal. Agora, o cérebro pode ser facilmente removido com uma espátula de microcolher invertida e os nervos cranianos podem ser seccionados. O cérebro deve pousar com sua face ventral para baixo sobre uma superfície resistente ao corte, com a superfície ventral do cérebro voltada para baixo.Use uma lâmina de barbear de corte único para remover o cerebelo. Esta superfície de corte reto servirá como base para fixar o cérebro em uma placa, permitindo o corte de seções cerebrais coronais. Em seguida, cole o cérebro com a superfície cortada sobre a placa-base do micrótomo usando uma pequena quantidade de cola cianoacrilato de alto desempenho e cura rápida.Posteriormente, cole um bloco de gel de ágar de um centímetro cúbico na face ventral do cérebro sobre a placa base do micrótomo para sustentar e fixar o cérebro durante o corte. Após a secagem da ligação, coloque a placa na câmara do micrótomo contendo solução extracelular oxigenada resfriada a seis graus Celsius. Em seguida, corte o cérebro em fatias de 300 mícrons de espessura com baixa velocidade de corte; as fatias coronais do cérebro são coletadas até que todo o cérebro tenha sido seccionado.Agora, prepare uma solução de 20% de ônico F1 27 em DMSO adicionando solução de DMSO ao pó de ônico F1 27. Em seguida, dissolva diretamente por sonicar a solução por dois minutos. Depois disso, adicione cinco microlitros da solução de 20% de ônico F1 27 a um tubo contendo 50 microgramas de furred am permeável a células.Misture a solução com uma pipeta. Em seguida, adicione 45 microlitros de solução extracelular à mistura e vortexe. Breve, adicione mais 325 microlitros de solução extracelular e sonique o tubo por mais três minutos.Após a sonicação, adicione 1,156 mililitros de solução extracelular oxigenada para obter a solução final de carregamento com o indicador de cálcio D. Transfira as fatias coronais do cérebro para uma placa de cultura celular de seis poços contendo solução extracelular oxigenada, com até seis fatias por poço. Em seguida, aspire a solução extracelular oxigenada das câmaras, tomando cuidado para não danificar as fatias cerebrais.A seguir, pipete 750 microlitros da solução de carregamento do indicador de cálcio D diretamente para cada poço, de modo que as fatias cerebrais fiquem cobertas pela solução contendo rore am. Em seguida, incube as fatias no incubador de cultura celular com oxigênio e dióxido de carbono por 45 a 60 minutos a 37 graus Celsius.No final da incubação, substitua a solução de carregamento do indicador de cálcio DI por uma solução extracelular oxigenada fresca para evitar sobrecarregar as células. Para monitorar as alterações induzidas pelo estímulo no sinal fluorescente, transfira uma das fatias cerebrais carregadas com fure red para uma câmara de registro e posicione-a conforme desejado. Após montar a câmara no sistema de microscopia confocal, perfunda a fatia por 10 minutos com solução extracelular oxigenada para remover qualquer excesso de corante indicador de cálcio extracelular.Após sair da câmara de registro, o PERFUSE oito é coletado em um frasco a vácuo. Em seguida, observe o corte ao microscópio com ampliação baixa. Anote a orientação do corte e localize a área de interesse no corte; em nosso caso, a área hipotalâmica no cérebro.Posteriormente, mude para alta ampliação. Localize a célula de interesse na fatia coletando imagens GFP e verificando simultaneamente a intensidade de fluorescência do sinal vermelho de URA. Ajuste a potência do laser para um valor que permita medições na variação da intensidade de fluorescência vermelha de URA e que evite o desbotamento dos dois fluoróforos.Em seguida, comece a adquirir imagens em taxas entre 0,5 e dois hertz para coletar os sinais de fure e GFP. Esta figura mostra a imagem confocal dos neurônios GN, RHR Tau GFP em um corte coronal de cérebro. Este é o sinal de fluorescência relativamente uniforme observado após o carregamento do corte de cérebro com fure am e esta é a imagem mesclada mostrando os neurônios carregados com o corante indicador de cálcio.Aqui estão exemplos das respostas de cálcio induzidas por estímulo somático em neurônios individuais marcados com GFP em diferentes áreas cerebrais hipotalâmicas. Os sinais distintos de cálcio entre os neurônios que expressam RHR GN de diferentes núcleos hipotalâmicos podem ser comparados utilizando a área sob a curva como uma estimativa da alteração total de cálcio em uma célula específica durante o mesmo período, uma vez dominado. Esta técnica pode ser realizada em menos de 90 minutos, incluindo a preparação do corante indicador de cálcio, a carga e a incubação das fatias, se for realizada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O órgão vomeronasal (VNO) detecta sinais químicos intraespecíficos que transmitem informações sociais e reprodutivas. Realizamos experimentos de imagem de Ca2+ utilizando camundongos transgênicos que expressam G-CaMP2 no tecido do VNO. Essa abordagem nos permite analisar os padrões complexos de resposta dos neurônios vomeronasais a um grande número de estímulos de feromônios.

Responses imagem Neuronal em Preparações Slice of Organ Vomeronasal Expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/61481/quantifying-spontaneous-ca2-fluxes-and-their-downstream-effects-in-primary-mouse-midbrain-neurons'&gt;Bancroft, E. A., et al. Quantificando o estilo Ca = '-webkit-text-decoration-skip: none; font-family: Arial, sans-serif; font-size: 0.6em; font-style: normal; font-variant: normal; font-weight: 400; text-decoration-skip-ink: none; vertical-align: baseline; espaço em branco: pré-encapsulamento; '&gt; 2 + &lt; span...

Visualização do influxo de cálcio em neurônios do mesencéfalo ventral derivados de embriões de camundongos

Descrevemos um procedimento experimental para medir a atividade neuronal através de janelas ópticas duas acima bilateral corticies somatossensorial primária (S1) em Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos usando 2-fóton (2P) microscopia na vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

Apresentamos um método combinando dois fotões de imagem para gravar transientes de Ca2 + em dendritos neuronais em fatias cerebral aguda e gravações de células inteiras remendo-braçadeira.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Aqui apresentamos como expor o gânglio geniculado de um rato de laboratório vivo, anestesiado e como usar imagens de cálcio para medir as respostas desses conjuntos desses neurônios a estímulos de sabor, permitindo múltiplos ensaios com diferentes estimulantes. Isso permite comparações profundas das quais os neurônios respondem a quais tastantes.

In vivo Imagem de cálcio do rato Geniculado Gânglio Respostas ao Sabor Estímulo

Apresentamos um protocolo para expor o tronco cerebral do rato adulto do lado ventral. Usando uma lente de índice gradiente-refrativo com um microscópio em miniatura, a imagem de cálcio pode ser usada para examinar a atividade de somata neural inferior de oliva in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Este protocolo detalha o procedimento para obter imagens de respostas de cálcio no colículo superior (CS) de camundongos acordados, incluindo a obtenção de imagens da atividade de um único neurônio com microscopia de dois fótons, deixando o córtex intacto em camundongos selvagens, e a obtenção de imagens de todo o SC com microscopia de campo largo em camundongos mutantes do córtex parcial.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

O presente protocolo descreve imagens de cálcio in vivo para medir as respostas de conjuntos de neurônios lombares-6 DRG a estímulos somáticos e viscerais. Comparações completas podem ser feitas entre neurônios que respondem a diferentes estímulos. Este protocolo é valioso para investigar mecanismos de dor visceral e estimulação somática, como a acupuntura.

in vivo Imagem de cálcio da resposta dos neurônios dos gânglios da raiz dorsal a estímulos somáticos e viscerais

O giro dentado do hipocampo desempenha funções essenciais e distintas na aprendizagem e na memória. Este protocolo descreve um conjunto de procedimentos robustos e eficientes para imagens de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado em camundongos em movimento livre.

Imagem de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado do hipocampo em camundongos 

Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .

In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos

Aprenda a monitorar respostas de cálcio em neurônios marcados com GFP em fatias de hipotálamo de rato usando corante indicador vermelho e microscopia confocal. Este método permite análise espacial e temporal dos sinais de cálcio.

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

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